ラングドルフ灌流法と重力沈降による成マウス心筋細胞の単離と精製

サマリー

本研究は、成マウス心筋細胞の抽出手順を最適化・効率化し、心血管疾患の研究手法を改善することを最終目標としています。このプロトコルは、より低い処理時間で高い生存率と純度を持つ心筋細胞を効率的に取得し、より信頼性の高い実験と治療の進展を加速させます。

要約

心血管疾患は依然として大きな世界的健康課題であり、信頼性の高いin vitroモデルの重要性を生み出しています。本研究は、既存方法における生存率の低さや非心筋細胞汚染の限界に対応するため、成マウス心筋細胞の分離および培養のための最適化プロトコルを提示します。このプロトコルは逆行性ランゲンドルフ灌流に基づいており、抗凝固にはヘパリンナトリウムを使用し、消化にはコラーゲン酵素タイプIIのみ(1.2 mg/mL)を使用します。心筋細胞は重力沈降によって精製され、ラミニン被覆された表面で培養されました。この方法は、1心あたり8.75 ±0.36 × 10個^の5 心筋細胞を一貫して得られ、桿状細胞の割合が高い(91.2%±2.11%)、純度も高く(dapi⁺細胞に対するcTNT⁺DAPI⁺細胞の割合は約97.47%±1.365%)、明確なサルコメリック構造を示しました。高品質な成人心筋細胞を得るための標準化かつ再現可能な方法を提供することで、このプロトコルは in vitro 研究と病態生理学的関連性のギャップを効果的に埋め、高度な心血管研究を支援します。

概要

心血管疾患は世界中の主要な死亡原因であり続けています^。心筋細胞は心臓研究の中心的焦点として、長らく心臓生理学および病理学の調査に不可欠なツールとして機能してきました^。市販されている心筋細胞株や最近普及しているヒト多能性幹細胞由来心筋細胞(hPSC-CMs)はアクセスの容易さと操作の容易さの面でより大きな利点^{を提供しますが、}一次心筋細胞は生体外で単離されたものの、心臓の生理学的および病理学的メカニズムとの構造的および機能的相関が優れていることを示しています。したがって、体外心筋細胞分離技術の習得は極めて重要です。

心筋細胞は発達過程で明確な形態的および機能的変化を示します。特に、これらの細胞は胚発生期および新生児期(出生後7日以内)に増殖能力を維持しますが^{、その後は}この再生能力を永久に失われます。出生後の成熟を通じて、心筋細胞は大幅な形態的再編成を受け、最終的に生後2か月までに特徴的な成体表現型を獲得します。これは高度に組織化された筋^{膜構造を持つ}桿状形態^7,8。これらの発達段階依存的特徴は、心臓病態生理の機構的研究に成マウス心筋細胞を活用する重要性を強調しています。

この分野を発展させるために重要なのは、特に人間の心臓生理を正確に模倣する成人由来の細胞など、高精度な心筋細胞の信頼できる調達です。成人マウス心筋細胞の現行分離プロトコルは、(i) 細胞生存能力の低下、(ii) 多様な集団特性、(iii) 技術的に要求の高い手順など、いくつかの持続的な課題に直面し^{ています。これら}が^{研究の進展}を妨げる要因がすべて積み重なっています。これは、収量と純度の向上の両方を達成するために分離方法の最適化が緊急に求められ、心血管疾患の研究においてより生理学的に関連性の高い細胞プラットフォームを提供することが求められていることを浮き彫りにしています。

灌流パラメータの体系的な最適化、酵素的消化プロトコル、試薬の配合を通じて、本研究は成マウス心筋細胞の分離および培養のための改良された方法論を確立することに成功しました。最適化されたプロトコルにより、形態学的完全性が良好に保存され、高い桿状比率と明確に見える筋膜構造が特徴となる心筋細胞が得られます。これらの進展は、心筋細胞の病態生理を深く調査するための堅牢な実験的基盤を提供し、心筋細胞メカニズムに焦点を当てた心血管疾患研究を大きく促進しています。

プロトコル

本研究のすべての動物処置は、徳慶人民病院倫理委員会が承認した施設動物ケア・利用委員会(IACUC)のガイドラインに厳格に従って実施されました。この研究は、GemPharmatech Co., Ltd.から購入した8〜12週齢のオスC57BL/6マウスを用いました。すべての動物は、環境パラメータが国家基準を満たすSPFグレードのバリア施設に収容されていました(室温22±2°C、相対湿度50±10%、明暗サイクル12/12時間)。実験全体を通じて、本研究は「3R」原則(置換、減少、精錬)を厳格に遵守し、動物の苦痛を最小限に抑えるために麻酔や鎮痛などの標準手順を実施しました。

注:簡単に言うと、未保存の心臓はマウス胸腔から迅速に摘出され、ランゲンドルフ装置を通じてコラゲナーゼタイプII溶液による逆行灌流を受けて細胞外マトリックスを酵素的に消化します。組織消化が完了した後、軟化した心筋は慎重に単細胞懸浮液として解離されます。得られた細胞懸濁液は順次ろ過されて未消化の組織断片を除去し、その後重力沈降で生存可能な心筋細胞を富集させます。精製された心筋細胞は、その後の実験応用に利用されます。

1. ランゲンドルフ灌流装置の準備

注:ランゲンドルフシステムの総チューブ容積は15.5 mLです。心灌流時の灌流流量は3.5 mL/min、体内洗浄時は10〜15 mL/分です。

1. ランゲンドルフ灌流系を75%エタノール50mLで洗浄します。
   注意:無菌を確保するために、1 M HClで月に一度のガラス管洗浄を行います。
2. 滅菌DDH2O250mLでエタノール残留物を除去し、気泡を除去します。
3. 水浴の温度を42°Cに設定します。 ポンプを起動して循環加熱を開始し、サーペンタインチューブの外部空洞に温かい水を注ぎます。
   注:これにより、37°Cで液体が心臓に到達します。

2. バッファーの準備

1. 表1に記載された配合に従い、クレブス-炭酸水素溶液バッファー(KB)、パーフュージョンバッファー(PB)、消化バッファー(DB)、筋細胞プレート培地(MPM)、および筋肉細胞培養培地(MCM)を準備します。
   注意:使用当日は新鮮に準備してください。
2. 氷の上で10mLのKBバッファーを予冷します。
3. ルーメンをPBで満たします。流量を3.5 mL/minに設定し、排水温度(最適37°C)を測定します。
4. 7mLのDBをパイプラインに流し込み、その後パーフュージョンラインを閉じます。
5. ヘパリンナトリウム溶液(0.5%、62.5 KU)を準備し、300 μLをインスリン注射器に注入します。
6. ピープルバター10mLとKB10mLを2皿に分けて氷で冷やします。
7. 50 mL遠心分離機チューブの蓋に100 μmのセルストレーナーを置き、1 mLのKBで事前に湿らせてから、50 mLの遠心分離機チューブに固定します。

3. 心臓摘出とカニュレーション

注:このプロトコルでは、外部汚染を最小限に抑えるため、処置中は滅菌手袋、器具、ガーゼ、綿棒を使用しました。一次細胞培養には完全な無菌技術が不可欠ですが、ここでは細胞分離のための無菌性維持ではなく、下流の組織学的・分子解析のための動物福祉と組織の完全性を支える役割を果たしました。

1. マウスを腹膜内注射で、80 mg/kgのペントバルビタールナトリウム(医薬品グレード)と5 IU/g 体重ヘパリンナトリウムを組み合わせて麻酔します。深部麻酔が得られるまで注意深く監視してください。ネズミのつま先をつねり、つま先をつまむ反射が消えるのを観察して、麻酔の効果を確認します。
2. 脱毛クリームで胸部の毛を除去します。
3. マウスをフォームボードに固定し、胸部の皮膚を75%アルコールで消毒します。
4. 鉗子で胸の皮膚を持ち上げ、剣突に切開をします。
5. 剣骨を高くし、肋骨を腋部に向かって両側に切り、横隔膜を完全に横断します。
   注意:心臓を傷つけないようにしてください。
6. 止血鉗子を使って胸骨と肋骨を固定し、心臓を完全に露出させます。
7. 血液を吸収し、肝臓を後肢の方へ組織で優しく移動させます。綿棒を慎重に使い、心臓を操作して下大静脈を露出させます。
8. 準備済みのインスリン注射器を使って、ステップ2.5のヘパリンナトリウム溶液300μLを下腔静脈に注入します。
   注意:気泡の侵入を防ぐために注意してください。
9. 胸腺組織を切除し、その後周囲の静脈と動脈を切断します。心臓をすぐに事前に冷蔵したPBバッファー(ステップ2.6のもの)に移します。
   注:胸腺摘出は大動脈の視認性を向上させます。切除時に大動脈セグメントを保存してください。心筋収縮は予冷却されたPB溶液によって遅らせられました。麻酔下での心臓切除は人道的な安楽死を実現します。
10. マイクロ鉗子を使って大動脈を掴み、ランゲンドルフ灌流システムのカニューレに取り付けます。5-0シルク縫合糸で固定してください。
    注意:このステップは素早く行ってください。心臓着型中は灌流システムを必ずオフにしてください。

4. 心臓灌流

1. 灌流システムを起動し、2分30秒のタイミングを計ります。この期間中、排水はPBバッファーで構成され、収集の必要はありません。
2. 2分30秒の間隔が終わったら、DBバッファの回収と再循環を開始し、15分間計時します。
   注意:心筋の状態をモニタリングしてください。最適な消化は組織の弾力性低下と透明性の増加を示します。消化が不完全に見える場合は、持続時間をやや延長してもよいですが、心筋細胞への損傷を防ぐために合計20分を超えないようにしてください。
3. 時間制限終了後、DBバッファーからPBバッファーに切り替え、さらに4分30秒の灌流を続けます。この段階の排水にはDBバッファーが含まれています。回収しろ。
4. 最終タイミング間隔終了後にシステムを停止して灌流を終了します。

5. 細胞解離と精製

1. 心臓をカニューレから取り出し、事前に冷却したKBバッファー(ステップ2.6で準備)に移します。
   注:酵素的消化は心臓を即時にKBバッファーに移すことで終了しました。これにより残留酵素が急速に希釈され、過剰消化を防ぎ高い細胞生存率を確保します。
2. 細いハサミを使って、心房組織と大動脈組織を慎重に切除し、心筋だけを残します。
3. マイクロ鉗子を用いて心筋組織を機械的に小さな破片(< mm³)に解離します。
4. 2mLスポイトで組織断片を優しく吹き飛ばし、単一細胞懸濁液にします。
   注意:吹き気時には棒状心筋細胞の形態を保存するために細心の注意が必要です。標準的なピペットチップの使用は避けてください。狭い口径が細胞の完全性を機械的に損なう恐れがあります。
5. 得られた細胞懸濁液を、あらかじめ湿らせた100μmセルストレーナー(ステップ2.7で組み立てたもの)を通して50mLチューブにフィルターします。
6. ろ過した懸濁液を15mLのチューブに移し、心筋細胞が重力沈降(15分、4°C)によって沈殿します。
   注:15 mLチューブの基礎表面積の減少は、50 mLチューブと比べて細胞回収効率を大幅に向上させます。
7. 上清を慎重に吸引し、ペレット状心筋細胞を2mLの移送ピペットで10 mLの氷冷KBバッファーに再懸浮させ、沈着(15分、4°C)を繰り返します。
8. ステップ5.4-5.7を繰り返し、適用に適した完全な桿状心筋細胞の精製製剤を得る。

6. 細胞培養

1. 培養皿に10 μg/mLのラミニンを塗り、37°Cで2時間培養します。
   注:桿状心筋細胞の機械的損傷を最小限に抑え、差別プレートに伴う処理時間の延長を短縮するため、本研究では差別プレートの代わりにラミニンコーティングを用い、細胞の付着効率を高めるだけでなく心筋細胞の本来の生理的特徴も維持する戦略を用いています。
2. 心筋細胞を予備加熱(37°C)MPMの4 mLに再懸濁します。ラミニン溶液を取り除いた後、心筋細胞をコーティング皿に種まけます。37°Cで2%の_CO2 を含んで1時間培養します。顕微鏡で細胞の形態、大きさ、密度を観察します。
3. 孵化後は慎重にMPMをデカントし、予め温めた(37°C)MCMに置き換えます。24時間、2%の_CO2 で37°Cでキュベーションを保ちます。
4. 24時間後、心筋細胞の構造的完全性と形態を調べます。
   注意:処置中は厳格な無菌技術を必ず行ってください。
   注意:コラーゲナーゼタイプIIは呼吸器アレルギー、皮膚、目の刺激を引き起こす可能性があります。換気の良い場所で作業し、ほこりを吸い込んだり、皮膚や粘膜に触れないようにしてください。廃棄されたマウスの心臓組織、血液サンプル、及びそれらに接触した使い捨て用品はすべて、バイオハザードシンボルが入った専用の漏れ防止容器にバイオハザード廃棄物として収集されなければなりません。これらの物質はその後、集中的な除染および処分手順にかけられます。

結果

成マウス心筋細胞の分離および培養手順はプロトコルで示されており、必要な器具とチューブのセットアップは図1に示されています。形態学的評価により、新たに分離された心筋細胞および1時間および24時間培養されたものはすべて特徴的な桿状または柱状の形態を示し、明確に縞模様が見られました(図2A-C)。24時間培養心筋細胞における心トロポニンT(cTNT)の免疫蛍光染色は、高い細胞純度(図2D)と明確な筋節(図2D)を示し、この方法で高い純度と生存率の両方を持つ心筋細胞が得られることを示しました。

その後、この抽出法...

ディスカッション

本研究は、成マウスの心筋細胞分離および培養のための最適化プロトコルを確立することで、心血管研究における重要な方法論的突破口を示しています。バッファー組成と酵素的消化パラメータの体系的な洗練により、培養システムの信頼性を大幅に向上させるとともに、心筋細胞の純度と生存率の両方を向上させます。これらの技術的進歩は、一次成人心筋細胞を用いて心血管疾患をモデル化するための堅牢なプラットフォームを提供します。

一般的に、軽度の消化は心筋細胞の付着と生存を促進しますが、消化酵素の濃度が極端に低いと組織解離が不十分になることがあります。したがって、酵素濃度の最適化は、効果的な心臓組織の消化と心筋細胞の生存能力を維持するために極めて重要です。特定の心筋細胞分離プロトコル¹²では、プロテアーゼカクテル(コラーゲナーゼおよびプロテアーゼXIV)の使用が、過剰消化や必須細胞表面タンパク質や細胞外マトリックス成分の除去により、心筋細胞の長期培養生存率を低下させることが示されています。最適化され...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BDM	アラジン科学株式会社、上海、中国	D111028
BSA	アラジン科学株式会社、上海、中国	B265994
C57BL/6マウス	ジェムファーマテック株式会社		8歳とndash;12週齢のオス
CaCl2	アラジン科学株式会社、上海、中国	C431202
コラーゲン酵素タイプII	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション(アメリカ)	LS004176	LOT#:43D23502  酵素活性単位:270u/mg dw
FBS	ビヨタイム・バイオテクノロジー、中国	C0226
グルコース	アラジン科学株式会社、上海、中国	D639737
ヘペス	シグマ・オルドリッチ	H7006
KCl	アラジン科学株式会社、上海、中国	P112134
KH2PO4	アラジン科学株式会社、上海、中国	P104075
L-グルタミン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	25030081
MEM	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11095080
MgSO4	アラジン科学株式会社、上海、中国	M116444
Na2HPO4	アラジン科学株式会社、上海、中国	S274390
NaCl	アラジン科学株式会社、上海、中国	C111547
NaH2PO4	アラジン科学株式会社、上海、中国	S108339
NaHCO3	アラジン科学株式会社、上海、中国	S112338
ペニシリン・ストレプトマイシン(100倍)	ビヨタイム・バイオテクノロジー、中国	C0222
プリモベート逆立細胞培養顕微鏡	カール・ツァイス
タウリン	アラジン科学株式会社、上海、中国	T103829