動物組織アッセイは、核シンチレーション検出を利用して、グリコーゲンへの放射性標識グルコースの取り込みを測定することにより、グリコーゲンシンターゼの酵素活性を決定します。
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この記事について
サマリー
要約
グリコーゲンは多くの真核細胞にとって重要な代謝産物であり、エネルギー貯蔵と迅速なエネルギー放出に不可欠です。分子の構築は、成長するグリコーゲンポリマーにおけるグルコース単位の連続的な結合を促進するという主な機能を持つ高度に調節された酵素であるグリコーゲンシンターゼに依存しています。この酵素はグルコース-6-リン酸によってアロステリックに活性化され、リン酸化によって複数の部位で阻害されます。グリコーゲンシンターゼ酵素活性に関する知識は、グリコーゲン代謝、筋肉のエネルギーレベル、糖尿病やグリコーゲン蓄積症などの代謝障害を理解するための重要な要素です。ここで説明するのは、放射性標識[14C]-UDP-グルコースからグリコーゲン分子への統合グルコースの量を測定することにより、動物の筋肉組織におけるグリコーゲンシンターゼの活性を決定する高感度で効果的な方法です。この手順では放射性 14C を利用し、使用と廃棄には適切な許可と実験スペースが必要です。この手順では、液体シンチレーションカウンターへのアクセスも必要です。
概要
グリコーゲンは、グルコース単位で構成される高度に分岐した多糖類であり、筋肉、肝臓、脳などのさまざまな組織で重要なエネルギー貯蔵庫として機能します1。その合成と分解は、特殊な酵素と調節タンパク質の複雑なシステムによって調整されます。その生合成に不可欠なのは酵素グリコーゲンシンターゼ(GYS)であり、そのアイソフォームには2つのアイソフォーム(GYS1とGYS2)があります。GYS1は、肝細胞以外のグルコースからのグリコーゲンの生成に直接関与する調節酵素であり、GYS2は肝臓で機能します。グリコーゲン症として知られるこのプロセスは、成長するグリコーゲン鎖に個々の単位のグルコースを連続的に付加することです。GYSは、中間体ウリジン二リン酸グルコース(UDP-グルコース)からグリコーゲン鎖の末端へのグルコースの移動を触媒し、α-1,4-グリコシド結合を生成します2。この反応はグリコーゲン分岐酵素と連携してグリコーゲン分子を拡張し、効率的なエネルギー貯蔵と放出の両方を提供します。
酵素の活性を測定するためのアッセイ技術が存在し、分光光度法の種類3,4の方法からなる方法のより一般的なグループの1つがあります。これらのアッセイは通常、間接結合反応のシステムに依存し、下流生成物であるNADHの吸光度を340 nmで測定します。グリコーゲンシンターゼによってUDP-グルコースから遊離されたUDPの単位ごとに1単位のNADHが消費され、グリコーゲンシンターゼ活性と直接相関する測定可能な興奮を生成します5,6。分光光度法アッセイは比較的安価で入手しやすいですが、間接反応に依存するという小さな欠点と、サンプルの濁度による干渉と感度の低下という大きな欠点があり、特に小さなサンプルやリン酸化グリコーゲンシンターゼがほとんど/高度にリン酸化されたサンプルでは問題となります。上記の結合反応を用いた蛍光アッセイは、ヒト7およびマウス8の筋肉組織の感度を改善するために開発されました。グリコーゲンシンターゼを定量するための他の技術は、免疫ブロッティング9や免疫組織化学10など存在します。ただし、これらの技術は酵素の物理量を定量化することしかできず、せいぜいリン酸化から活性を推測することはできますが、酵素活性を直接定量化することはできません11。
これらの酵素アッセイ技術の中で、放射化学的方法は、サンプルの濁度による干渉がなく、感度が高いため、哺乳類組織におけるグリコーゲンシンターゼ活性を決定するために最も広く使用されています8,9。これらのアッセイは、14C12または3H13のいずれかで標識されたUDPグルコースからグリコーゲンに放射性標識グルコースを組み込むことで、一定時間にわたる酵素活性の直接測定を可能にします。次の手順では、グリコーゲンシンターゼを含む組織サンプルをUDP-グルコースおよびグリコーゲンプライマーにさらします。グリコーゲンシンターゼは、以下の式に示す反応を触媒します。
UDP-[14C]グルコース+(グリコーゲン)n→(グリコーゲン)n+1[14°C]+UDP
一定時間後、反応は終了し、放射性標識グルコースを含むグリコーゲンは、濾紙12 (以下に説明のとおり)に沈殿するか、Niederwangerら14 によって記述されたようにゲルろ過され、シンチレーション検出器を用いて測定される。この方法には、グリコーゲンシンターゼのアロステリック活性化因子であるグルコース-6-リン酸(G6P)を含む別の同一反応も含まれます。十分なレベルのG6Pの条件下では、グリコーゲンシンターゼ活性が最大限に活性化され、特定のサンプルのグリコーゲンシンターゼ活性の絶対的な可能性を示します。ここで説明する方法は、鈴木ら15 から96ウェルフォーマットに変更され、マウスの筋肉組織での使用に最適化されている。ただし、プロトコルは他の組織や動物種に対して変更できます。
放射性物質には固有のコストと安全性の考慮事項があるにもかかわらず、放射化学アッセイは、機器が利用可能であれば、非放射性代替品よりも大きな利点をもたらします。以下の手順では、動物の筋肉組織におけるグリコーゲン代謝の重要な酵素であるグリコーゲンシンターゼの活性を決定するための高感度で堅牢な手段について詳しく説明します。
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プロトコル
すべての手順は、ボール州立大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。B6 の男性および女性のコホート。この原稿では、生後3ヶ月の129-Gaatm1Rabn/J野生型マウスを代表例として使用しています。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。
1. アッセイ前の準備
- 子宮頸部脱臼16 によって組織を採取し、グリコーゲン貯蔵庫を保存するために液体N2で直ちに凍結し、アッセイの開始まで液体N2または超低温冷凍庫に保存します。
- グリコーゲンシンターゼアッセイの開始前にストック溶液を調製します(表1)。
- アッセイに必要な複製マウスサンプルとコントロールの数を決定します。各マウスサンプルには、反応ごとに2回ずつ、合計4回の反復(G6Pの有無)が必要です( 図1 および 表2を参照)。
- クロマトグラフィー紙を4cmの短冊状にカットします。グリコーゲンはこの紙に付着し、洗浄プロセス中に結合したままになります。シュレッダーの幅(6 mm)を使用して、クロマトグラフィー紙を細かい個々のセグメントに細断します。
- 鉛筆を使用して、指定された紙片にマウス識別、空白、合計のラベルを付けます。インクの使用は避けてください。
- クロマトグラフィー紙を木製ブロックテンプレートにセットします。各テンプレートには、96ウェルプレートの1列に相当する最大12枚の論文を保持できます。
- クロマトグラフィー用紙クランプ(クリップボードトップ)を入手します。
- クロマトグラフィー紙の端をクランプし、紙の表面積の大部分を露出させて、反応の列ごとに1つのクランプを準備します。ラベル付きのエッジが表示されていることを確認します。
- 1.7 mLマイクロフュージチューブにサンプル識別でラベルを付けます。サンプルごとに2本のチューブ。1つはホモジネート用、もう1つは上清用です。
- アッセイを開始する前に、+および-G6P反応混合物の両方を調製します(詳細については、 表3 を参照してください)。各反応混合物の2,400 μLアリコートを調製します。
2. 放射性化学的グリコーゲンシンターゼ活性反応
注意:このステップには、放射性物質である[14C]-UDP-グルコースの使用が含まれています。原子力規制委員会(NRC)が承認した方法で取り扱い、保管、廃棄すること。
- 30 μLの[14C]-UDP-グルコース(0.1 μCi/μL)を両方の(+/- G6P)反応混合物の2,400 μLアリコートに加え、最終濃度を0.0012 μCi/μLにします。このレシピは18サンプルに適しています。
注:[14C]-UDP-グルコースの量は、使用量を節約し、適切な感度を確保するために変更できます。たとえば、マウスの脳組織には50 μL、マウスの心臓には25 μLを使用します。 - ボルテックス反応混合物をボルテックスし、サンプル、ブランク、および合計を保持する96ウェルプレートの各ウェルに50 μLをアリコートします(表2)。その後、プレートフィルムで覆い、4°Cに置きます。
- プロテアーゼ阻害剤を室温で解凍するように設定します。これらの阻害剤は、追加情報とともに 表4に 項目化されています。
- 30〜50 mgの凍結組織を大量に排出します。~30 mgは骨格筋および心臓のサンプルに最適です。脳に~50mg。組織とマイクロフュージチューブを液体N2に保管し、組織の重量をすばやく計量して、組織が凍結した状態にあることを確認します。冷やした乳棒を使用して、組織をさらに粉砕します。
- 氷上でプロテアーゼ阻害剤を含む均質化バッファーを調製します。
- 一度に1つのサンプルを、組織の入ったチューブを液体N2からコールドキャップ付きの氷に1分間移動します。液体N2の中にあるまま、コールドキャップ(液体N2で冷却された3つの小さな穴のあるチューブキャップ)をサンプルチューブに追加します。これにより、チューブ内の残留液体 N2 が蒸発する際の組織の損失が防止されます。液体N2から出たら、サンプルは氷の中に残るはずです。
- 氷上に置いたら、体積(10〜30 μL / mg)のホモジナイゼーションバッファーをサンプルに加え、Tissue-Tearorでサンプルをホモジナイズします。これら 2 つの手順が完了したら、次のサンプルに進みます。
注:サンプルに添加されるバッファーの量は、組織の供給源に応じて最適化される場合があります。例:骨格筋の場合は30 μL / mg、心臓の場合は15 μL / mg、脳の場合は10 μL / mg。 - サンプルを4°Cで3,600 g で5分間遠心分離し、上清を清潔なマイクロフリージチューブに移します。ペレットに触れないように注意してください。ボルテックスし、氷上のV底96ウェルプレートの対応するウェルに~150 μLを加えます。残りはブラッドフォードアッセイ用の上清用に保存します(ステップ2.15を参照)
注:必要に応じて、追加のサンプルアリコートを、イムノブロッティングなどの後のアッセイのために保存することができます。
注意: ステップ2.9から2.14では、 14Cの取り扱いが必要です。NRCが承認した方法で、すべての汚染された物質を廃棄してください。 - 反応ミックスプレートを4°Cから取り外し、フィルムを取り外した状態でサーモサイクラーで30°Cに加熱します。この間に、1 Lの-20°C66%エタノールを取得し、攪拌プレート上の撹拌棒で洗浄ビーカーに加えます。
- 反応ウェルに25 μLのサンプル上清を、ブランクウェルとトータルウェルに25 μLのホモジナイゼーションバッファーを加えて反応を開始します。マルチチャンネルピペットを使用して、反応プレート上の1列に一度に1列ずつ追加し、列の間に少なくとも1分間待ちます。各行の反応が開始された時刻を記録します。詳細については、 表 2 を参照してください。マルチチャンネルピペットを使用し、同量の液体が加えられていることを確認します。
- 反応が実行されるまで10〜15分待ちます。ただし、実行時間は行間で同じである必要があります。
- マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから55 μLを吸引し、以前に調製したそれぞれのクロマトグラフィーペーパーに分注します。吸引する前に上下にピペッティングして反応を混合します。クロマトグラフィー紙の中央に液体をスポットします。
- ウェルから液体を見つけた後、鉗子を使用してクランプから合計の紙を取り除きます。これらはアルミホイルの上に敷いて安全に乾燥させることができます。他のすべてのクロマトグラフィーペーパーを攪拌する66%エタノール浴に落とします。グリコーゲンは 66% エタノールに不溶ですが、[14C]-UDP-グルコースは可溶性でクロマトグラフィー紙を洗い流します。
- 反応プレートの各行について、手順2.11と2.12を繰り返します。反応の開始時間と停止時間を記録して、各行の反応時間が同じであることを確認します。
- すべての列を攪拌する66%エタノールに加えたら、15分間洗浄します。
注:このステップおよびその後の洗浄ステップ中に、サンプルアリコートは、酵素活性の計算に必要な正規化のためのタンパク質の総量を決定する責任を担うブラッドフォードアッセイなどの相補的なアッセイのために調製される場合があります。 - クロマトグラフィー紙を失うことなく、66%エタノールを廃棄してください。1 Lの新しい66%エタノールで30分間洗浄します。この66%エタノールは室温で保存できます。
- 前のステップを繰り返して、合計30分間の66%エタノール洗浄を3回繰り返します。
注:必要に応じて、最終洗浄ステップからの66%エタノールを保存し、その後のアッセイのために-20°Cで保存することができます。 - 66%エタノールを除去した後、洗浄ビーカー内のすべてのクロマトグラフィー紙をアセトンに浸します。アセトンは乾燥プロセスを促進します。
- アセトンからクロマトグラフィー紙を取り出し、アルミホイルの上に置きます。アセトンは保存または廃棄してください。
- クロマトグラフィー紙をヒートランプの下で15分間乾燥させます。
注:乾いた紙は無期限に保管できます。シンチレーション検出に進む準備ができるまで、紙は安全に保管できます。
3. シンチレーション検出による活動の測定
- 鉗子を使用して、クロマトグラフィー紙をシンチレーションラックに保持されたシンチレーションバイアルに移動します。サンプル用紙の向きを記録します。
- 蓋ポンプを使用して、各バイアルに5 mLのシンチレーション液を追加します。各バイアルのキャップをねじ込みます。
- サンプルをシンチレーション検出器にロードし、サンプルの後ろの停止ラックをロードします。 14Cを監視するためのプログラムが選択されていることを確認します。[自動カウント] を選択して検出を開始します。
- 結果の印刷
- シンチレーションチューブと内容物は、NRCによって承認された方法で廃棄してください。
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結果
プロトコルに従って、シンチレーション検出器から作成されたプリントアウトには、グリコーゲンシンターゼの活性レベルに直接相関する、バイアルを含む各クロマトグラフィー紙から放出される電離放射線の測定量が含まれます。シンチレーション検出器は、設定された時間にわたって、各サンプル、ブランク、および合計について、検出された放射線の毎分カウント (CPM) を計算します。まず、CPMを、使用するシンチレーションカウンターの効率(DPM = CPM /効率)に基づくDPM(分あたりの崩壊数)に変換します。効率は、既知のDPMを持つ標準ソースをカウントすることによって決定されます。酵素活性を計算する式は次のとおりです。
[サンプル平均DPM/2.2 x 10^6][総アッセイ量(75 μL)/クロマトグラフィー紙にスポットされた量(55 μL)] x (1/比活性) x(アッセイインキュベーションの1/分) x (1/mgタンパク質) x(1000 nmol/μmol)
比活性...
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ディスカッション
グリコーゲンシンターゼ酵素活性の測定は、さまざまな代謝状態や疾患状態におけるグリコーゲン代謝をモニタリングするための貴重なツールです。グルコース-6-リン酸(G6P)の存在下での測定は、酵素の調節状態とリン酸化状態の間接的な指標についての洞察を提供します。[U-14C]-UDP-グルコース取り込みアッセイは、グリコーゲンシンターゼ酵素活性を測定するための効率的で十分に文書化された技術であり、高感度、基質特異性、およびマウス骨格筋などの小さな組織サンプルへの適応性を提供します。この記事では、マウスの筋肉溶解物における GYS1 活性を定量化するために作成された手順が最適化されており、他の酵素アッセイと比較したその技術的強みと、より広範な使用に関連する考慮事項を強調しています。
この手法を成功させるには、いくつかの考慮事項が必要です。不完全な溶解やタンパク質収量の変動は、酵素活性の正規化にアーティファクトをもたらす可能性があるため、組織の均質化は慎重に標準化する必要があります。これに対抗するために...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
資金は、ボール州立大学、インディアナ大学医学部マンシー校、およびアロバイオセラピューティクスによって部分的に提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| [14C]ウリジン5-二リン-グルコース | アメリカン・ラジオラベルド・ケミカルズ | ARC 0154 | |
| 31 ETCHRクロマトグラフィー用紙 | ワットマン | 3031 915 | |
| 塩酸ベンザミジン水和物 | シグマ | B6506 | |
| ベータ・メルカプトエタノール | シグマ | M3148 | |
| ドライバス | トリーパインズ・サイエンティフィック | SC25 | |
| エタノール(200プルーフ) | ファームコアパー | 111000200 | |
| エチレングリコール四酢酸(EGTA) | シグマ | E4378 | |
| エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA) | シグマ | E5134 | |
| グルコース-6-リン酸ナトリウム塩 | シグマ | G7879 | |
| ウサギ肝臓からのグリコーゲン(タイプIII) | シグマ | G8876 | |
| マイクロプレート、フラットボトム、96井戸 | グライナー | 655101 | |
| マイクロプレート、PCR、96ウェル | DOTサイエンティフィック | 951-PCR | |
| 多目的シンチレーションカウンター | ベックマン・カウルター | LS 6500 | |
| フッ化カリウム二水和物 | シグマ | 221872 | |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | ゴールドバイオ | GB-108-2 | |
| シンチレーションカクテル | リサーチ・プロダクツ・インターナショナル | 111195 | |
| シンチレーションバイアル | リサーチ・プロダクツ・インターナショナル | 125509 | |
| フッ化ナトリウム | シグマ | S7920 | |
| ティッシュティアラー | バイオスペック製品 | モデル398 | |
| トシリシンクロロメチルケトン(TLCK) | シグマ | T7254 | |
| トリズマ基地(99.9%) | シグマ | T1503 | |
| トリズマ塩酸塩 | シグマ | T3253 | |
| ウリジン5-ジホスポ-グルコース | シグマ | U-4625 |
参考文献
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