ラットの膝下切断モデルと即時的標的筋肉再神経支配

サマリー

このプロトコルは、ラットにおける膝下切断の実施方法と、即座に標的筋肉再神経支配(iTMR)を行う方法を示し、切断関連の痛みの治療・予防戦略を調査し、切断に関連する痛みメカニズムの理解を深めることを目的としています。

要約

切断に関連する痛みは患者の生活の質を低下させ、オピオイド使用に寄与し、機能的リハビリテーションや義肢の使用を減少させることがあります。切断後の痛みを確実に生じさせつつ、可動性を保つ前臨床モデルは、これらの結果の生物学的メカニズムを研究する上で不可欠です。ここでは、スプラグ・ドーリーラットを用いて後肢膝下切断をモデル化するための詳細で再現可能な齧歯類手術プロトコルを提示します。この手技は、脛骨神経、総腓骨神経、褥骨神経を含む坐骨神経の枝を単離・切断し、切断後の神経病理や痛みに関連する行動を持続させます。ラットはこの手術で回復が良く、手術直後すぐに食事や水分補給に問題なく歩き回ることができます。動物はその後、反射的および自然な痛みの測定で評価されます。この処置による痛みの挙動は時間をかけて強靭であり、切断部から標準的な反射的な痛み行動を得ることができます。重要なのは、可動性が維持されることで、運動障害を交絡させることなく縦断的な行動検査が可能になることです。このプロトコルは切断を中心としていますが、切断された神経を大腿二頭筋および半膜筋の近くの運動枝に結合させることで、切断された神経を切断後の介入としてターゲット筋再神経化(TMR)として容易に適応させることが可能です。これにより、再神経介入と切断後の痛みへの影響の研究が可能になります。これまでにもこのモデルを用いて、切断後の痛み行動における性別特異的な違いの評価やTMRの効果の研究に成功しています。このプロトコルは、切断に関連する痛み、神経腫形成、機能的アウトカムの研究に柔軟かつ堅牢なプラットフォームを提供し、切断後の痛み改善を目指すトランスレーショナル研究にも応用可能です。

概要

慢性痛は大肢切断後の最も衰弱させる合併症の一つであり^{、患者の最大}70%に影響を及ぼ^します。薬物介入、理学療法、神経ブロック、心理療法などの従来の痛み管理戦略は、限定的または一時的な緩和をもたらすことが多い⁴.したがって、効果的な長期的な疼痛管理戦略の臨床的必要性は依然として大きく存在します。

標的筋再神経支配(TMR)は、もともと筋電義肢の制御を強化するために開発され、四肢切断後の痛み緩和に有望なアプローチとして浮上^{しています。}手術技術では、切断された混合運動感覚神経を近隣の運動枝へと方向転換します。臨床的には、TMRは幻肢痛、残存肢痛、神経腫関連症状の大幅な減少を示している^6,7,8。再生末梢神経インターフェース(RPNI)は、神経損傷や切断関連の痛みに用いられる別の外科的介入です。切断された神経末端は縫合され、自由(非神経化・無血管)筋移植片に包まれ^ます。切断された軸索は脱神経化された神経筋接合部を神経化させ、移植片内で筋肉の収縮を生み出し、近接縫合の制御信号として利用されます。TMRとは対照的に、RPNIは齧歯類モデルで広く研究されています。TMRと同様に、RPNIは神経腫形成を防ぎ、神経切断損傷に伴う痛みを軽減することが示されています^10,11。臨床的には、RPNIは切断者の幻肢痛および残存性肢痛の両方を軽減することが示されています¹²。

臨床的に採用されているにもかかわらず、TMRおよびRPNIの鎮痛効果の生物学的メカニズムは依然として十分に解明されていません。これらのメカニズムを解明するためには、前臨床モデルが不可欠です。過去の研究では、神経切断モデルを改良して神経を表層化し、神経腫痛を直接検査してきた^10,11。これらのモデルは、直接刺激による神経腫性痛みや、足に残る神経分布における脊髄反射の挙動を評価することで神経障害性疼痛を定量化できます。例えば、神経損傷を免れた部分は胸側神経を維持し、脛骨神経と総腓骨神経は切断されます。痛み行動テストは外側足部に^{行われます。}後肢切断モデルは、肢に対する最も重篤な損傷を示します。そのため、広範な神経細胞の喪失が起こり、その種の損傷には大きな炎症や治癒の負担が伴います。神経損傷がある場合、DRG内の健康なニューロンが損傷したニューロンの維持を助けます。切断により、利用可能な健康なニューロンの数が大幅に減少し、損傷した神経1本あたり、1本の神経が損傷した場合よりも大きな神経損失が生じます(^14、15、16)。齧歯類後肢切断手術の生存手術の既往報告は稀です^17,18。しかし、上肢切断に比べて、坐骨神経に関連する痛みや再生に関する豊富な過去データ、さらに複数の外来^{行動検査が}行われている利点^{もあります。}

このギャップを埋めるために、私たちは即時TMRを組み込んだラット後肢切断モデル(図1)を開発しました。RPNI作成技術は以前に発表されており、後肢^{切断モデルに}適応可能です。このモデルは臨床手技と密接に似ており、さまざまな痛み行動、神経腫形成、ニューロン保存の評価を可能にします(図2)²²。我々の研究は、標準的な切断よりもTMRに有意な鎮痛効果を示し、神経腫の予防に効果があることを示し、寒冷感受性における性的二形反応を示しました^22,23。

ここで示すプロトコルは、手術技術の詳細かつ標準化された視覚的デモンストレーションを提供し、実験的アプローチにおける再現性と一貫性を確保します。神経の分離、正確な切断、緊張のない神経結合などの重要なステップを明確に示すことで、このプロトコルはTMR介在の鎮痛および神経腫予防のメカニズムを調査するための堅牢な枠組みを研究者に提供します。

プロトコル

すべての動物処置は、施設動物ケア・使用委員会(IACUC)の承認を受け、米国国立衛生研究所(NIH)の実験動物ケア・利用ガイドラインに準拠しなければなりません。

1. 術前準備

注:生後8〜10週、体重250〜300gのオスおよびメスのSprague-Dawleyラット(チャールズリバーラボラトリーズ)を使用しました。

1. ウォーミングパッドを起動し、無菌手術フィールドを準備してください。最適な曝露を得るために、ラットの体に垂直に無菌パッドを敷きます。
2. すべての手術用器具と材料を準備してください:滅菌生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム)、ポビドンヨウ素消毒液、メロキシカム、焼灼、10-0マイクロ縫合、4-0吸収性編み縫合、定規、皮膚接着剤。
   注意:すべての手術器具はオートクレーブまたはホットビーズ滅菌で滅菌してください。
3. ラットを誘導チャンバーに入れ、4%イソフルラン、酸素10L/分、空気60%で麻酔を誘導します。4分経過または反応しなくなったら、鼻のコーンに切り替え、ラットの大きさに応じてイソフルランを1.5%〜2.0%に調整します。
4. 手術部位は腰の下から後肢全体にかけて剃ります。ポビドンヨウ素消毒液とアルコール綿棒を交互に投与し、最後にアルコールで3回準備を行います。
5. ツベルクリン注射器(通常200gラットなら0.2 mL)を使って、メロキシカム1 mg/kgを皮下投与します。

2. 膝下切断(図1)

1. 定規を使って膝関節のラインをマークし、膝の遠位2cmと3cmの位置にさらに2つの印をつけます。
2. メスを使って膝の3cm先に環状の皮膚切開をします。
3. 鈍く鋭い剥離を使い、皮膚を下の筋肉から円周方向に切り離し、筋肉が自由に引っ込めるまで続けます。
4. この下の筋肉でも同じように、組織面を保存しながら骨まで慎重に解剖します。無菌焼灼またはマーカーで、周囲切開から1cm近位の脛骨/腓骨をマークしてください。
5. 小さな骨ハサミを使って、指定された場所の脛骨と腓骨を横断します。止血を得るために焼灼を使いましょう。骨の端に鋭い刃がないか調べ、必要に応じて鈍くしたりトリミングしたりしてください。
6. 4-0吸収性編み縫合糸を使い、前後の筋肉区画を骨の上で閉じて筋肉パッドを作ります。まず、前縁を脛骨(主要な圧迫点)の上に縫合します。通常、4〜6本の中断縫合が使用されます。
7. 皮膚は、体重を支える切断部に直接置かないように、4-0吸収性編み縫合糸で皮膚を横方向に閉じます。切開部に沿って皮膚接着剤を塗ります。

3. TMR介入手術(図1)

1. 大腿骨の約5mm後方に1.5〜2cmの縦方向の臀筋分割切開を行います。
2. 鈍的解離を用いて臀部筋とハムストリング筋を分離し、坐骨神経が脛骨神経、総腓骨神経(CP)、褥膜神経への三つ分岐のすぐ近くに露出させます。
3. 近位運動枝を特定する:1本の大きな枝は尾大腿筋(CFM)の下を通り、CFM、半膜筋(SM)、および大腿二頭筋(BF)に分岐します。
4. 綿棒でCFMを持ち上げて分けます。SMとBFの枝を、顕微鏡下で鈍く解剖し、顕微鏡下のデュモント鉗子を慎重に神経分解します。
   1. 鉗子を使って神経外膜を掴み、細かい湾曲したバネハサミで神経外膜を開けて縦方向に分け、異なる枝を互いに分離します。
   2. CFM枝は保存し、他の枝は坐骨神経幹の近くで分けてください。曲線運動は下側に枝分かれし、共転を促します。
5. 神経分解して坐骨神経の三分岐を神経分解し、神経外膜を開き、細かい湾曲したスプリングハサミで分割します。細かい鉗子で神経枝を優しく広げてください。三つの枝(CP、脛骨、髀)それぞれを鉗子で掴みます。三叉から遠位5〜10mmの位置で。
6. 緊張をかけて、できるだけ遠くに各神経を横断します。切断端の遠位端を掴み、少なくとも5〜10mmを切除して近位端まできれいに切ります。
7. 10-0ナイロン縫合糸でコアプテーションを行います:CPからSMまでは1本の縫合糸で、脛骨から大きなBF枝までは1〜2本の縫合糸で、suralから小さなBF枝までは1本の縫合糸で行います。1針あたり最低3ノットを使い、張力のない位置を確保し、神経に折り目ができるほど強く締めすぎず、鋭い角度をつけずにアプタメントを配置してください。

4. 切断のみのグループ

1. 5-0シルク縫合で結紮(CP)、脛骨神経、褥膜神経を結紮します。シルクはデュモン縫合鉗子で扱ってください。結び目が神経にしわをつけ、4つの四角い結び目で固定されていることを確認してください。
2. 結び目を使って各神経を近位から優しく引っ張り、結紮から1〜2mm遠位まで横断します。遠位神経節の10mmを切除します。
3. 第2節に詳述された切断手術を進めてください。

5. 術後ケア

1. ラットは温まったケージに戻し、外出可能になるまで待ってください。24時間後に2回目のメロキシカム(0.2 mL)を皮下投与します。
2. 7日間毎日、創傷の健全性、感染の兆候、痛みや苦痛の兆候を観察し、必要に応じてIACUCのガイドラインに従って介入してください。

結果

この後肢切断モデルは、ラットの歩行能力と探索能力を維持しつつ、神経障害性疼痛関連行動を確実に誘発しました。 図2に示すように、切断時に末梢神経が遠位標的なしで切断されると、結紮部位の軸索成長と神経腫形成が乱れ、B-チューブリンおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫染色によって可視化されます。対照的に、TMRで治療された切断神経は、受容枝への組織的な軸索成長を示し、運動軸索(B-チューブリン)軸索と感覚軸索(CGRP)の両方が存在し、再神経支配が成功し、神経腫様形態が存在しないことを示しました。

行動検査では、切断後も安定した長期的な痛み関連行動が示されました。フォン・フレイ検査で測定された機械的離脱閾値はベースラインから有意に低下し、切断後時点を通じて減少したままで、持続的な機械的過敏症を示しました(図3A)。アセトン検査で評価された寒冷過敏症は研究期間を通じて強靭かつ持続的であり、...

ディスカッション

このプロトコルは、後肢切断モデルの再現性を確保するための重要な外科的手順を詳述し、切断後の検査における歩行および行動の関与の保存を示します。解剖学的同定、神経操作の最小限、切断された神経の緊張のない取り扱いなど、外科医間での一貫性と再現性を確保するために、重要な外科的原則が強調されています。これらの技術的配慮は、切断後の神経病理を確実に誘導し、手術外傷に関連する意図しない変動を最小限に抑えるために極めて重要です。

切断時の末梢神経切断は、切断後の介入がない場合に軸索再生と神経腫形成を不規則に引き起こします。このモデルで示されたように、切断は機械的および寒冷過敏症を含む持続的な痛み関連行動を引き起こし、動物は歩行可能であり、これはOFTとEPMによって示されています。不安と痛みによる歩行への影響の関係は、介入によってさらに解明する必要がありますが、現時点ではこれらの検査で歩行能力を示しています。これらの発見を総合すると、全体的な可動性にもかかわらず神経障害性疼痛が持続する臨床シナリオを反映しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)	AROSurgical	T04A10N07-13	細い神経接合縫合糸。10-0マイクロステッチ。
4-0 ポリグリコール酸縫合糸	Ethicon	AQ1268	筋肉と皮膚の閉鎖縫合糸。吸収性4-0縫合糸。
5-0 シルク手術用縫合糸	Generic	Generic	神経結紮縫合糸
成体スプラーグドゥーリーラット	Charles River Laboratories	Generic	実験用動物
アルコール製剤パッド	Dukal Corporation	Generic	皮膚消毒
Betadine 10%	Avrio Health LP	Generic	消毒剤
骨用はさみ	FST	16030	骨切断器具
焼灼装置	FST	18010-00	止血装置
コットンチップアププケーター（ProAdvantage）	ProAdvantage	Ref 76100	組織操作
湾曲マイクロ分離はさみ	FST	15019-10	神経分離用の細かいはさみ
フォーセプス（ファインデュモン）	FST	11254-20	神経取り扱い器具
フォーセプス（縫合糸結びデュモン）	FST	11063-07	縫合糸取り扱い器具
ガーゼUSPタイプVII（Cardinal Health）	Cardinal Health	Ref 2146	無菌フィールドの維持
加熱パッドウォーマー（TC1000温度コントローラー）	Generic	TC1000	温度制御装置
誘導チャンバー（Braintree Scientific）	Braintree Scientific Inc.	Generic	麻酔誘導用
イソフルラン（Isospire）	Phoenix	Generic	麻酔薬
メロキシカム（Ostilox）	VetONE	5 mg/mL	鎮痛薬
定規	Generic	Generic	解剖学的ランドマークの測定ツール
滅菌生理食塩水	Baxter	0.9 Sodium Lot Y425131	灌漑溶液
外科用刃15	FST	10015-00	皮膚切開ツール
ツベルクリン注射器	Generic	Generic	薬剤投与
気化器（Surgivetモデル100）	Surgivet	Model 100 S/N W2211123	麻酔維持用
Vetbond組織接着剤	World Precision Instruments	Generic	皮膚接着剤