in vitro 上皮オルガノイド-T細胞共培養システムを用いた常駐記憶CD8 T細胞分化

サマリー

CD8 T細胞の分化と機能をin vitroで研究するために、CD8 T細胞をマウスから分離し、既存の感染マウス膣上皮オルガノイドと長期共培養することができます。ここではこの過程を説明し、共培養時の常駐記憶T細胞マーカーの獲得状況を評価します。

要約

バリア粘膜組織は、レジデントT細胞の分化と機能に重要な役割を果たします。これらの組織内の多様な細胞群の中で、上皮細胞はT細胞分化の重要な推進力です。しかし、粘膜環境におけるT細胞生物学を形作る上皮由来のシグナルについての理解は限られており、これは主に特定のツールの不足と利用可能なモデルシステムの複雑さによるものです。ここでは、感染した上皮細胞とウイルス特異的CD8 T細胞間の動的相互作用をモデル化するマウス膣上皮オルガノイド-CD8 T細胞共培養システムを記述します。このプロトコルは、生理学的に関連性の高い三次元上皮微小環境内でのT細胞応答の表現型および機能的解析を可能にします。このシステムを用いて、エフェクターのCD8 T細胞が組織常駐メモリーT細胞(TRM)へと分化することを示しました。この多用途 なin vitro 培養システムは、障壁臓器における保護免疫や免疫病理を支配するCD8 T細胞分化の背後にある上皮的な手がかりの分子詳細を還元的に調査する機会を提供します。

概要

CD8常在記憶T細胞(TRM)は、血液やリンパ組織を日常的に循環することなく末梢組織に恒久的に保持される、記憶CD8 T細胞の独特な集団です。これらのTRM細胞は、皮膚、肺、腸、生殖管などの障壁器官に戦略的に配置され、病原体や未成熟腫瘍に対する見張り役として機能します^1,2。病原体検出後、CD8 TRM細胞は細胞毒性顆粒を迅速に放出して感染細胞を直接排除しつつ、同時に炎症性サイトカインを分泌して周囲の組織細胞に警告し、循環中の免疫効果器を動員して病原体拡散を抑制します。^3,4。CD8 TRMの抗病原体免疫およびがん免疫療法の有効性はすでに実証されています^5,6。したがって、機能的に正常なCD8 TRMをバリア粘膜組織に豊富に配置することは、ワクチンおよび免疫治療戦略にとって重要な目標です。

末梢臓器におけるCD8 TRMの形成と維持は、局所的な組織特異的プログラミングに極めて依存しています。これらの局所的な環境的手がかりには、特有の組織由来サイトカインや代謝因子、さらに組織特異的TRM同一性を強化する細胞間相互作用が含まれます^7,8,9。この組織プログラミングにより、TRMは免疫監視任務の遂行において組織特異的な要求に適応できます。しかし、これらの相互作用の性質については、これらのプロセスを忠実に捉える堅牢なモデルシステムが存在しないため、不完全です。小動物モデルは非常に有益である一方で、しばしば高度に相互に絡み合った複雑な相互作用の網に悩まされており、迅速なハイスループット研究を妨げています。

ここでは、CD8 TRM分化の背後にある上皮細胞由来の手がかりの分子詳細を調査できるマウスモデルの in vitro 代替案を説明します。活性化されたCD8 T細胞と共培養する膣上皮オルガノイド(VEO)を合成することで、 in vitroでCD8 TRMを生成しました。CD8 T細胞の活性化と共培養プロセスの詳細な記述は、組織全体でのこのプロセスのより広範な採用を可能にし、前線組織におけるCD8 T細胞記憶を形成する細胞相互作用の理解を深めることにつながります。

プロトコル

動物を対象としたすべての手技は、ブラウン大学の動物ケア・利用委員会(プロトコル番号22-10-0001)によって審査・承認されました。

1. 活性化プレートの基本的な設置と準備

1. 実験開始の前日に、未処理の組織培養プレートを準備し、ナイーブCD8 T細胞をシードします。抗CD3ε(2C11)に対して1 μg/mLの最終濃度で、滅菌dPBS中の活性化抗体溶液を準備します。B7-1 Fcは0.167 μg/mLです。24ウェルプレートの場合、1ウェルあたり600μLの溶液を分散します。使用準備が整うまで4°Cで一晩培養します。
2. 滅菌dPBSに2%の木炭ストリップしたFBSと1mM EDTAを加え、無菌dPBSにリンパ球濃縮バッファーを準備します。使用準備が整うまで4°Cで保存してください。
3. ddH₂Oに10 mM重曹カリウム、155 mM塩化アンモニウム、0.1 mM EDTAを加えてアンモニウム塩化カリウム赤血球(ACK RBC)溶解バッファーを製製します。ろ過し、滅菌し、室温で保管してください。
4. RPMIで5%の木炭除去FBSを加えて適切な量の収穫媒体を準備します。使用準備が整うまで4°Cで保存してください。採取するマウス1匹には50mLの収穫用培地が推奨されます。
   注意:ペニシリン/ストレプトマイシンおよびアンホテリシンBは任意ですが、最終濃度のペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンホテリシンB0.2 μg/mLのアンホテリシンBが、組織分離時に細菌や真菌によるT細胞汚染を防ぐのに役立ちます。
5. RPMIでT細胞培地を準備するには、炭素ストリップしたFBS10%、L-グルタミン2m、ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、非必須アミノ酸1x、ピルビン酸ナトリウム1mを加えます。24ウェルプレートの場合、1ウェルあたり2mLのT細胞培地、フルプレートには50mLのT細胞培地を使用します。使用準備が整うまで4°Cで保存してください。
6. 滅菌パウチでオートクレーブするか、70%エタノールに浸して、解剖用ツール(0.4mmの微細解剖ハサミと0.8mmの細かい曲線ミクロ解剖鉗子)を準備します。

2. 成虫マウスの二次リンパ管器官の収穫と解離

1. 15 mLの円錐管を収容できる適切なアダプターを使って遠心分離機を4°Cまで速冷します。
2. 収穫および潜伏期間中に組織やリンパ球を運ぶための氷を準備してください。
3. 解剖対象マウス1匹あたり少なくとも5mLの収穫培地を用意した無菌の15 mL円錐形チューブを準備します。
4. 成人のCD8 T細胞トランスジェニックマウス(~8週齢)を、施設のプロトコルに従い、ラミナーフローフード内で麻酔し安楽死させます。
5. マウスの手足をきれいな発泡スチロールの表面にピンで固定し、どんなサイズの針でも使って、胴体に70%エタノールをスプレーして、毛が切開部を塞いで工具にくっつくのを防ぎます。
6. 清潔な微小解離用のハサミと鉗子を使い、腹部に垂直に切開し、その下の薄い結合組織から皮膚を切り離します。皮膚を発泡スチロールの表面にピンで固定し、サイズの針を使い、残った結合組織を切り裂いて胴体の臓器を露出させます。
7. 脾臓を慎重に見つけて切除し、曲がった鉗子を使って余分な脂肪を取り除き、収穫培地を含む15 mL円錐形チューブに移植します。脾臓は氷の上に置き、できるだけ多くのリンパ節(例:腸骨や鼠径)を分離し、同じ円錐形の管内で脾臓と結合させます。
   注:腸骨リンパ節は消化管下の下腹部の尾静脈の両側に位置し、鼠径リンパ節は胴体の下腹部皮膚の両側にある浅い上腹部静脈の分岐部付近に位置しています。増殖後のCD8 T細胞の収量を改善するために、より多くのリンパ節を単離すること;脾臓単独だけで、数百万個のCD8 T細胞を生成するのに一般的に十分です。
8. 脾臓とリンパ節を切り傷のある60mmの皿に移し、3mLのシリンジプランジャーの平らな端を使い、組織をすりつぶして大きな破片が残らなくなるまで機械的に脾臓とリンパ節を離します。
9. 懸濁液を無菌の70μm細胞ストレーナーに通し、新しい無菌の15mL円錐形チューブに通して採取します。60mmの皿を5mLの収穫培地で洗浄し、分解した細胞を完全に移植し、同じ15mLの円錐形チューブにフィルターをかけます。
10. サスペンションを584× g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄液を捨て、チューブの底を素早く力強く遠心分離機のグリッド上に通してペレットを緩めてチューブを張ります。
11. 緩んだペレットを2 mLのACK赤血球溶解バッファーに再懸浮させることで溶除します。ボルテックスして室温で2分間孵化します。
12. 2分後に2mLの収穫培地を加えて溶解バッファーを中和します。懸濁液を5mLの血清学ピペットで吸引し、無菌70μmフィルターを通して同じ15mL円錐形チューブに戻します。
    注意:このろ過はすべての塊を取り除くために重要です。
13. サスペンションを584× g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清液を廃棄し、ペレットを950μLのリンパ球濃縮バッファーに再懸濁します。

3. CD8 T細胞の濃縮と活性化

1. 市販の分離キットを使ってリンパ球からナイーブCD8 T細胞を濃集します。メーカーのプロトコルに従ってください。
2. CD8 T細胞が濃縮されたら、濃縮懸濁液を新しい無菌の15 mL円錐形チューブに移し、最大10 mLまで収穫培地を充填します。
3. 血球計を使って数えてください。
   注:成マウス1匹から、少なくとも500万〜1000万個の純度>95%の純度でナイーブCD8 T細胞を分離することが可能です。
4. 24ウェルプレートのウェルごとに、少なくとも50万個の細胞を2mLのT細胞培地でプレートプレートします。プレートの前にT細胞を十分に混合し、均一な単一細胞懸濁液を確保します。最終濃度100ユニット/mLのIL-2、2.5 ng/mLのIL-12、55μMのベータメルカプトエタノールをT細胞培地に加えます。
5. 抗体でコーティングされた組織培養板を4°Cから取り出し、ウェルの底に触れずに慎重に被覆液を吸引します。
6. すぐにT細胞をプレート状にします。37°Cで5%の_CO2 で2日間培養します。

4. 活性化シグナルの除去と安静に活性化されたCD8 T細胞の投与

1. 活性井戸を光学顕微鏡で観察してください。活性化から2日後、ウェル全体に小さなT細胞のクラスターがないか確認してください。クラスターが大きいほど、活性化が増えていることを示します。クラスターがほとんどない場合は、5%_CO2 を含んだ37°Cでさらに1日孵育してから休ませます。
2. 潜伏期間中および使用していない時にはT細胞懸濁液を保存するための氷を準備してください。
3. P1000ピペットを使って、ウェルの各隅を上下にピペットで再懸浮させます。T細胞が浮上したら、ウェルの内容物を無菌の50 mL円錐形チューブに移し、カウントします。
   注意:各ウェルに1 mLのdPBSで洗浄することは任意ですが、T細胞懸濁液とdPBSウォッシュをプールするとT細胞の収量が増加する可能性があります。
4. T細胞をステップ3.4と同じ濃度で再プレートし、1ウェルあたり2 mLで250,000細胞/mLを投与します。適切な量のT細胞培地を100単位/mLのIL-2と55μMのベータメルカプトエタノールを補足して準備します。
5. 584 × g で4°Cで5分間懸濁液を遠心分離し、上清液を廃棄し、前段階で準備した適切な容量のT細胞培地にペレットを再懸浮させます。均一な単細胞懸濁液を確保するために十分に混ぜてください。
6. 抗体被覆なしの新しい未処理組織培養プレートに2 mLのT細胞懸浮液(500,000細胞/ウェル)をプレートします。37°Cで5%の_CO2 で2日間培養します。

5. 既成マウスの膣上皮オルガノイドにウイルスを感染させる

注:オルガノイドのウイルス感染には単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)とリンパ球性絨毛膜膜炎ウイルス(LCMV)の両方を用いました。両者ともバイオセーフティレベル2(BSL-2)エージェントと見なされています。感染性物質に関するすべての手順は、認証済みBSL-2のバイオセーフティキャビネット内で行ってください。使用前後に70%エタノールで作業エリアを清潔にし、すべての材料は機関のバイオセーフティガイドラインに従って廃棄されます。このプロトコルでは、¹⁰以前に記載されたC57BL/6雌マウスの膣上皮から採取した膣上皮細胞からVEOを確立しました。

1. 感染の7〜10日前に、24ウェルプレートの20μL基底膜抽出物(BME)1ウェルあたり10,000細胞の密度でプレートVEOを行います。
2. 共培養の前日に、VEOを1個確保してトリプシン化し、正確な感染多数(MOI)を得るためにカウントします。0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴で5分間予温めます。
   注:0.25%のトリプシン-EDTAは感染時には使用しません。MOI計算時にVEOを解離するためのみ必要です。この段階では、プラスチック器具(例:ピペットチップや円錐形チューブ)に2.5%のBSAをdPBSでコーティングすることは任意ですが、より正確な計数のためにオルガノイドや細胞の損失を減らすのに役立つ可能性があります。
3. 指定されたウェルから細胞培養培地を吸引し、dPBSで洗浄します。
4. 600μLの予温済み0.25%トリプシン-EDTAをウェルに注入し、BSAコーティングされたP1000ピペットで完全に再懸濁してBMEを機械的に遮断します。井戸の内容物をBSAコーティングされた無菌15 mL円錐形チューブに移します。
5. 37°Cの水浴で5分間孵化します。5分後にRPMIに10mL 10% FBSを加えてトリプシン化を抑制します。
6. 500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清液を捨て、BSAコーティングされたピペットチップを100〜300μLのT細胞オルガノイド培養培地または単なるDMEM/F12に再懸濁します。
   注意:体積はペレットのサイズによって異なります。ペレットがほとんど見えない場合は、低容量で再懸浮してください。
7. 血球計を使って数えてください。既知のウイルス価とVEOのウェルあたりの細胞密度を用いて、0.1 MOIを達成するために必要な適切なウイルス量を以下の式に従って計算します。
   
8. 感染対象のVEOウェルから細胞培養培地を吸引し、予温(37°C)dPBS500μLで洗浄します。37°CでdPBSで5分間インキュベートします。
9. 5分後にdPBSを廃棄し、1ウェルあたりウイルス粒子を含む500μLのオルガノイド培地を加え、MOIを0.1にします。37°Cで5%_CO2 を含み、1時間培養し、20〜30分ごとに組織培養プレートを手で優しく回します。
10. 1時間の培養後、ウイルスオルガノイド培地を吸引し、予温された37°CのdPBS500μLで洗浄します。dPBSを吸引し、新しいオルガノイド培地に置き換えます。

6. ウイルス感染済みのミズ膣上皮オルガノイドとCD8 T細胞の共培養

1. 共培養の前(理想的には4〜24時間前)に、BMEを-80°Cから4°Cに移して解凍してください。共培養実験設計に基づいて、解凍に適量のBMEを予測してください:96ウェルプレートのウェルごとに8μLのBMEを、24ウェルプレートの1ウェルあたり20μLのBMEをプレートする計画を立てます。
   注:BMEは粘性が高く、4°Cで解凍期間が長くなると粘度が低くなり、機動性が向上します。
2. dPBSに2.5%のBSAを準備し、ろ過で滅菌します。このBSA溶液を使って、VEOに接触するすべてのプラスチック表面(ピペットチップや円錐形チューブ)をコーティングします。
   注意:このコーティングにより、VEOがプラスチック表面に付着し取り扱い中に失われるのを防ぎます。
3. 光学顕微鏡でVEOの大きさや全体的な健康状態を確認してください。VEOは培養後7〜10日で、平均直径約100ミクロンであることを確認しましょう。健康なVEOは、ほとんどまたは全く単一の細胞を呈さず、均一で丸い形態を特徴とします。
   注意:24ウェルプレートで培養し、再プレートを24ウェルプレートで再培養する場合(つまり、VEOの1ウェルがT細胞オルガノイド共培養のウェルを1つ再シードする場合)、共培養でVEOを1:1で再プレートします。24ウェルプレートから96ウェルプレートに再プレートする場合、VEOsは1:2で再プレートします(つまり、VEOのウェル1つでT細胞オルガノイド共培養ウェル2つを再シードします)。
4. 共培養用の無菌96ウェルまたは24ウェルの組織培養プレートを37°Cのインキュベーターに設置します。
   注意:温めたプレートはBMEの接着と固化を早めます。
5. DMEM/F12でT細胞オルガノイド培養培地を2%のB-27サプリメント、2 mM L-グルタミン、100単位/mLのペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシン、1×非必須アミノ酸、1 mMのピルビン酸ナトリウム、0.2 μg/mLのアンフォテリシンBを加えて調製します。使用準備が整うまで4°Cで保存します。
6. VEOウェルから細胞培養培地を吸引し、各ウェルに500μLの冷水(2〜8°C)無菌dPBSを洗浄します。
7. dPBSを吸引し、200〜500μLの冷たいオルガノイド収穫液(少なくとも10倍のオルガノイドBME液滴)を加えます。BSAコーティングされたP200ピペットで上下にピペットを動かし、BMEを機械的に妨害します。
8. 4°Cの軌道シェーカーで20分間、優しく振って(~100rpm)キュベートプレートを培養します。冷たい軌道シェーカーがない場合は、5分ごとに手動で振って氷の上に皿を孵化させてください。20分経っても脱重合しない場合は、必要に応じて培養時間を延長してください。
9. ウェルの内容物をBSAコーティングされたピペットチップを使って、BSAコーティングされた滅菌15mLまたは50mLの円錐形チューブに氷上に移します。サスペンションを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
10. 上澄液は捨て、VEOを5〜10mLの冷水(2〜8°C)dPBS(結合オルガノイドBME液滴の少なくとも10倍)で洗浄します。サスペンションを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
11. dPBSを廃棄し、BSAコーティングされたP1000ピペットチップを使って1mLのT細胞オルガノイド培養培地に再懸浮させます。T細胞が共培養できる準備ができるまで、VEO懸濁液は氷の上に置いておきましょう。
12. 共培養のためにT細胞の採取を開始します。光顕微鏡で安静性T細胞の大きさや全体的な健康状態を確認してください。信号を活性化しなければ、T細胞は増殖を遅らせますが、それでもいくつかのクラスターは形成されるはずです。細胞の破片や断片がないこと、そしてT細胞の形態が拡大していることを確認しましょう。P1000ピペットを用いて、ウェルの各隅で上下にピペットを行い、生体CD8 T細胞の総数を数えます。
    注:96ウェルプレートのウェルあたり、8μLのBMEに共培養1回あたり100,000Tの細胞をシードしてください。24ウェルプレートのウェルごとに、20μLのBMEで共培養ごとに20万T細胞をシードします。
13. サスペンションを584× g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清液を廃棄し、ペレットを10 mLのT細胞オルガノイド培養培地に再懸濁します。T細胞とVEOを組み合わせるには、VEOを含む円錐形チューブにウェルを移植する適切な数のT細胞を移植します。
14. 遠心分離機で584× g 、4°Cで5分間加熱します。 上清液は廃棄し、適切な量のBMEでVEOとT細胞を再懸濁します。BSAコーティングされたピペットチップで十分に混合し、予温された組織培養プレートにプレートを塗ります。24ウェルプレートのウェルあたり20μL、または96ウェルプレートのウェルあたり8μLです。
    注意:メッキ中は氷や冷却ブロックで4°Cの状態で保管してください。ピペットチップを4°Cの冷蔵庫に30分間置くことで、BMEの早期固化を防ぐことができます。
15. プレートを逆さまに37°Cのインキュベーターに入れ、完全にBMEの接着と固化を30分間待ちます。
16. この培養期間中、既存のT細胞オルガノイド培養培地に100 ng/mLのマウスEGF、55μMのベータメルカプトエタノール、10単位/mLのマウスIL-2を加えて、完全なT細胞オルガノイド培養培地を準備します。
17. 培養期間終了後、24ウェルプレートのウェルごとに500μLの完全T細胞オルガノイド培養培地、または96ウェルプレートのウェルごとに250μLの完全T細胞オルガノイド培養培地を慎重に添加します。BMEの液滴を乱さないように、井戸の側面に培地を分散させてください。収穫するまで2日ごとに培地を交換して分析してください。

7. フローサイトメトリー解析のための共培養CD8 T細胞の採取

1. 共培養が少なくとも7日目に達したら、分析のために収穫します。T細胞が7日目までに共培養でTRM様マーカーを発現しない場合は、表現型獲得やVEO、T細胞の生存率に応じて、収穫日を7日目から14日目の間に最適化します。
2. 蛍光活性細胞選別(FACS)バッファーを、0.2%w/vウシ血清アルブミンと0.1%ワウトアジドナトリウムをdPBSに加えてフローサイトメトリーの染色および分析を行います。
   注:アジ化ナトリウムは非常に有毒な化学物質です。すべての廃棄物の取り扱いおよび処分に関しては、機関のバイオセーフティ規則に準拠して機関の推奨事項に従ってください。
3. 分析対象のマーカーに応じて、FACSバッファーで蛍光抗体カクテルを表面染色用に準備します。各ウェルごとに少なくとも50μLの抗体カクテルを摂取してください。
4. dPBSで蛍光性染料を準備します。各井戸ごとに少なくとも50μLの生存性染料を含みます。
5. 各ウェル内の培地を慎重に取り出し、冷たい(2〜8°C)FACSバッファーに完全に再懸濁させ、ピペットで上下に10〜20回繰り返してBMEを機械的に妨害します。各井戸の内容物をラベル付き96井戸の丸底板に移します。
6. 遠心分離機で859× g 、4°Cで2分間。 ペレットの再混合によるサンプル損失を防ぐため、遠心分離以降のすべての減速ランプを下げてください。
7. プレートを反転させて、液体を一度しっかりと下向きに排出して上清液を除去します。抗体カクテル50μLに再懸濁します。マルチチャンネルピペットで少なくとも5回上下にピペットを使い、細胞ペレットの完全な再懸濁を確保してください。
8. 必要に応じて4°Cまたは室温で30分間孵育し、光を遮断してください。インキュベーション期間終了時に、マルチチャネルピペットと遠心分離機を用いて各ウェルに150μLのdPBSを859 × g で4°Cで2分間追加します。
9. 上清液を皿を逆さまにして、連続して下に一度はじいてデカントします。生存性染料50μLに再懸浮します。マルチチャンネルピペットで少なくとも5回上下にピペットを使い、細胞ペレットの完全な再懸濁を確保してください。
10. 室温で15分間、光を遮って孵化させます。孵育期間終了時に、多チャネルピペットと遠心分離機を用いて各ウェルに150μLのFACSバッファーを859× g で4°Cで2分間追加します。
11. 上清液を前回同様にデカントし、サンプルをフローサイトメーターで直ちに処理する場合は150μLのFACSバッファーに再懸濁するか、0.5%パラホルマルデヒド150μLに固定して4°Cで放置します。 マルチチャンネルピペットで少なくとも5回上下にピペットを使い、細胞ペレットの完全な再懸濁を確保してください。フィルターは器具の詰まりを防ぐために固定サンプルを設置し、蛍光の喪失を防ぐために12〜36時間以内にフローサイトメーターで動作させます。
    注:パラホルムアルデヒドは有害化学物質とみなされています。取り扱いと処分に関しては、機関のバイオセーフティ規則を遵守してください。

結果

CD8 T細胞感染オルガノイド共培養の顕微鏡的可視化
既存のマウスVEOをLCMVに感染させ、LCMV特異的CD8 T細胞と共培養しました。また、これらの共培養をHSV-2感染モデルと組み合わせてプロトコルの多様性を確立しましたが、LCMVモデルでは顕微鏡的データを示し、以下のHSV-2モデルにはT細胞分化データを含めています。LCMVは黄色蛍光タンパク質(YFP)を発現するため、感染細胞は通常の蛍光顕微鏡で可視化されます。このため、生後7日のVEOにCD8 T細胞培養の24時間前にLCMV-YFPを感染させました(図1A)。別途、LCMV特異的トランスジェニックP14 CD8 T細胞は、上記の活性化および安静プロトコルを用いて活性化されました。共培養当日に、感染したオルガノイドはBMEマトリックスから放出され、前述の適量の活性化CD8 T細胞と混合されました。この混合集団は新しいBMEマトリックスに再懸濁され、イメージングのために96ウェルプレートにプレートされました(...

ディスカッション

CD8 TRMは、局所的な環境の手がかりに依存して分化と維持を行います。これらの手がかりは組織特異的なプログラミングを植え付け、CD8 TRMが周囲環境に適応し、必要に応じて免疫監視の役割を果たせるようにします。残念ながら、TRMは組織から抽出後はin vitroで生存できず、詳細な解析が制限されています^12,13。本プロトコルでは、CD8 T細胞を上皮細胞と共培養し、in vivo TRMに類似した表現型特徴を持つTRMへと発達させる方法を提供しました。この方法は長期的にTRMの研究に用いられるほか、他の組織、ウイルス、遺伝子改変に対応するために容易に操作可能です。

このプロトコルで最も重要な要素は細胞の健康に関するものです。共培養前にT細胞が増殖し生きている必要があります。十分に活性化され持続的なIL-2を提供していないT細胞は、IL-7やIL-15など他の生...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16%パラホルマルデヒド水溶液	電子顕微鏡科学	15710-S
24ウェルのポリスチレン非処理多孔ティスース培養プレート	VWRインターナショナル	10861-558
2-メルカプトエタノール	ギブコ	21985023
3 mL 滅菌注射器	フィッシャー・サイエンティフィック	14-955-457
5 mL、nbsp;スナップキャップ、そしてnbsp;無菌・丸底ポリスチレン試験管	ファルコン	352058
60mmペトリ皿	フィッシャー・サイエンティフィック	FB0875713A
70 & mu;m無菌細胞ストレーナー	フィッシャー・サイエンティフィック	22-363-548
96井戸未処理ポリスチレンラウンドボトムマイクロプレート	グライナー・バイオ・ワン	650101
96ウェルのポリスチレン非処理多孔組織培養プレート	VWRインターナショナル	10861-562
アルブミン牛/フラクションV(牛のアルブミン)	サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ	J6465518
塩化アンモニウム	フィッシャー・サイエンティフィック	A661-500
アンホテリシンB	シグマ・オルドリッチ	A9528-100MG
B-27補足	ギブコ	17504044
ioTek Cytation 5細胞イメージングマルチモードリーダー
DMEM/F12 1:1 ミディアム	シチバ	SH30271。FS
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩溶液 1回	コーニング	21031CV
エチレンジアミネテトラアセチン酸(0.5 M溶液/pH 8.0)	フィッシャー・サイエンティフィック	BP2482-500
超細微解剖ハサミ	ロボズ外科機器会社	RS-5882
胎児用牛血清 - 炭/デクトレン処理済み	R&Dシステムズ	S11650
Flowjo v10 ソフトウェア	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	フロージョ(RRID:SCR_008520)
グレーフェ鉗子	ロボズ外科機器会社	RS-5135
HEPESソリューション	シチバ	SH30237.01
L-グルタミン(200 mM)	ギブコ	A2916801
マグネット 5mL	バイオレジェンド	480019
マウスCD8 Naïve T細胞分離キット	バイオレジェンド	480044
マウスEGF組換えタンパク質	ギブコ	315091MG
非必須アミノ酸溶液(100倍)	ギブコ	11140050
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液	シチバ	SV30010
重炭酸カリウム	MPバイオメディカル	0215255780
精製された抗マウスCD3&エプシロン;抗体	バイオレジェンド	100360
組換えマウスB7.1(CD80)-Fcキメラ(キャリアフリー)	バイオレジェンド	555406
組換えマウスIL-12(p70)(キャリアフリー)	バイオレジェンド	577004
組換えマウスIL-2(キャリアフリー)	バイオレジェンド	575406
低減成長因子基底膜抽出物	R&Dシステムズ	BME001-10
RPMI 1640メディア	シチバ	SH30027.LS
アジ化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S227I-25
ピルビン酸ナトリウム(100 mM)	ギブコ	11360070
トリプシン0.25%プロテアーゼと豚トリプシン	シチバ	SH30042.02
バイアビリティダイ(レッド780)	サイテック・バイオサイエンス	13-0865-T100