Mettl3/Nrf2軸はセロトニンニューロンにおけるNLRP3誘発性超下死を阻害することによりパーキンソン病の進行を抑制する

パーキンソン病(PD)は、高齢者の間で2番目に多い神経変性疾患であり、65歳以上の約2〜3%が罹患しており、家族と社会の両方に大きな負担をもたらしています¹。PD の背後にある正確なメカニズムはまだ部分的に理解されていませんが、蓄積された証拠は、PD の発症と、老化した脳や PD を含むさまざまな神経変性疾患に見られる一般的な形質であるミクログリア細胞によって引き起こされる神経炎症とともに、ニューロン伝達の課題との関連性を示しています 2,3,4,5 .ミクログリアは中枢神経系 (CNS) 内の自然免疫細胞として機能し、脳の恒常性を維持するために不可欠です⁶。しかし、これらのミクログリアの持続的な過剰活性化は慢性神経炎症反応を引き起こし、最終的には神経変性疾患の進行に寄与する可能性があります。

中枢炎症過程と末梢炎症過程の両方が PD ^7,8 の病理に大きな影響を与えます。ミクログリア細胞の活性化は、ニューロンの生存に影響を与える炎症反応を促^し9、ユビキチンリガーゼ¹⁰によるプライミングを強調した新たな証拠があります。さまざまな炎症経路の中で、NOD、LRR、およびピリンドメイン含有タンパク質 3 (NLRP3) インフラマソームの活性化は、ミクログリアの炎症調節の主な寄与因子として機能します¹¹。活性化は、NLRP3の発現と、その後のカスパーゼ活性化およびリクルートメントドメイン(CARD)アダプタータンパク質とプロカスパーゼ-1で構成されるインフラマソーム複合体の集合につながり、タンパク質の切断とサイトカイン放出で最高潮に達します¹²。NLRP3 活性化の上昇が PD 患者およびこの疾患のさまざまな動物モデルで観察され、その結果、神経細胞死が引き起こされています。特に、NLRP3 の阻害はマウス モデルで PD 病状に対する保護効果を示しており、PD 発症における NLRP3 インフラマソームの重要な役割を強調しています^13,14。

セロトニン(5-HT)シグナル伝達は神経調節の重要なメカニズムであり、包括的な概要¹⁷で詳述されているように、CNS病理における役割を含む、少なくとも14のシナプス後受容体サブタイプ^15,16との相互作用を通じて、多くの行動と生理学的機能に影響を与えます。5-HTシステムの広範な神経調節の影響は、げっ歯類の脳の約26,000のニューロンによって支配されています¹⁸。実質的な文献では、PD は主にドーパミン作動性ニューロンの喪失と関連付けられていますが、5-HT ニューロンと PD との関係はあまり徹底的に調べられていません。

真核細胞で最も普及しているmRNA修飾であるN6-メチルアデノシン(m6A)修飾は、mRNAのスプライシング、安定性、およびエクスポートを調節する鍵であり、それによってさまざまな細胞活動に影響を与えます¹⁹。m6Aレベルは、メチルトランスフェラーゼとデメチラーゼによって調節されます。脳内のm6A修飾の上昇は神経発達に関連しており、その調節不全は、アルツハイマー病モデルにおけるMETTL3発現の変化を含む神経変性状態^20,21と密接に関連しています²²。たとえば、アルツハイマー病患者の死後脳組織の不溶性画分におけるメチルトランスフェラーゼ様 3 (METTL3) の蓄積は、不溶性タウタンパク質²³ のレベルと正の相関があります。さらに、線条体の m6A レベルの大幅な低下は、ドーパミン神経伝達物質レベルの大幅な低下につながる可能性があります²⁴。特に、12のm6A関連一塩基多型は、PD感受性と有意な関連を示しています²⁵。このプロトコルは、METTL3 を介した m6A 修飾が Nrf2/NLRP3 軸を介してミクログリアのパイロトーシスをどのように調節し、最終的に PD モデルにおけるセロトニン ニューロンの生存に影響を与えるかを調査するための包括的な方法論を確立します。急性MPTP in vivoモデルとLPS in vitroモデルは、神経炎症反応の強力な誘導のために選択されましたが、慢性パラダイムは以下で説明するように将来の研究を補完する可能性があります。

すべての動物実験は、肥城人民病院の施設動物管理および使用委員会(承認番号 IACUC-2024-118)の承認の下で実施され、実験動物研究の施設ガイドラインと確立された倫理原則に厳密に従って実施されました。研究プロトコルは、責任ある動物研究実践のための制度的基準と ARRIVE ガイドラインの両方を遵守しながら、苦しみと苦痛を最小限に抑えることに特に重点を置き、すべての動物の人道的なケアと治療を保証しました。

1. 細胞培養とミクログリア活性化モデル

1. BV2細胞の調製と維持
   1. 凍結したBV2ミクログリア細胞ストックを37°Cのウォーターバスで2分間急速解凍し、熱衝撃を防ぐために穏やかに渦巻きさせます。
   2. 解凍した細胞懸濁液を室温(RT)で300 × g で5分間遠心分離し、凍結保護剤を除去します。
   3. 上清を廃棄し、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを添加した10 mLの完全高グルコースDMEM培地に細胞ペレットを再懸濁します。
   4. トリパンブルー排除法(10 μLの細胞懸濁液と10 μLの0.4%トリパンブルーを混合し、血球計算盤を使用してカウント)を使用して細胞生存率評価を実行し、続行する前に>95%の生存率を確認します。
   5. T75培養フラスコに細胞をフラスコあたり1×10〜⁶ 細胞の密度でプレートし、5%CO₂で37°Cの加湿細胞培養インキュベーターに維持します。
   6. 標準的なトリプシン化手順を使用して、80〜85%のコンフルエンスに達したら、48時間ごとに細胞を継代します。
      注:再現性のある炎症反応を確保するために、一貫した継代数(継代3〜8)を維持します。すべての細胞培養実験は、変動を最小限に抑えるために、条件ごとに3回の技術的反復で、少なくとも3回独立して繰り返しました。
2. LPS誘導性ミクログリア活性化
   1. 処理の24時間前に、BV2細胞を6ウェルプレートに2×10⁵ 細胞/ウェルで2 mLの完全培地に播種します。
   2. LPSストック溶液を滅菌PBS中で1 mg/mLで調製し、0.22 μmフィルターでろ過滅菌し、-20°Cで使い捨てアリコートで保存します。
   3. 各実験の前にエンドトキシン濃度を確認するために、Limulus Amebocyte Lysate (LAL) アッセイを使用して LPS 活性を検証します²⁶。
   4. 使用直前に、LPSストックを無血清DMEMで1 μg/mLの作業濃度に希釈します。
   5. ウェルから培地を取り出し、滅菌PBSで細胞を2回洗浄します。
   6. 2 mLのLPS含有培地(最終濃度1 μg/mL)を処理ウェルに加え、無血清DMEMをコントロールウェルに加えます。
   7. 炎症活性化のために細胞を37°Cで5%CO₂ とともに24時間インキュベートします。
   8. 炎症反応を検証するために、100 ng/mL の腫瘍壊死因子 (TNF) αで処理されたポジティブ コントロール ウェルと、ビヒクルのみ (PBS) を使用したネガティブ コントロール ウェルを含めます。
      注:一貫した生物活性を維持するために、実験ごとに新しいLPS溶液を調製してください。炎症反応が弱い場合(例:<サイトカインの2倍の増加)、試薬の安定性を確認するか、インキュベーションを48時間に延長します。
3. Mettl3の過剰発現とノックダウン
   1. 標準的なオリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用して、Mettl3およびスクランブルコントロール配列を標的とする低分子干渉RNA(siRNA)配列を設計および合成します。Mettl3 mRNA(GenBankアクセッション:NM_019721)のコード領域から19〜21ヌクレオチド長の標的配列を選択し、40〜60%²⁷のGC含有量を確保します。
   2. BLAST分析を使用してsiRNA配列を検証し、特異性を確認し、オフターゲット効果を回避します(非標的遺伝子との<70%の相同性を確保します)。
   3. 制限部位EcoRIおよびXhoIを使用して、pcDNA3.1ベクターにクローニングされた完全長Mettl3 cDNAを含む過剰発現ベクターを調製します。
   4. カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用して、70〜80%コンフルエントで細胞をトランスフェクションします。
      1. 2 μLのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を50 pmol siRNAまたは2 μgのプラスミドDNAと100 μLのOpti-MEM培地に混合します。
      2. 混合物をRTで15分間インキュベートします。
      3. トランスフェクション複合体を細胞に滴下し、4〜6時間インキュベートしてから、新鮮な完全培地に変更します。
   5. 適切なタンパク質発現変化を可能にするために、LPS処理の48時間前にトランスフェクトされた細胞をインキュベートします。
   6. 蛍光レポーター共トランスフェクション(ウェルあたり100 ngのpEGFP-C1)を使用してトランスフェクション効率を確認し、蛍光顕微鏡で>70%の効率を目標としてから続行します。

2. 動物モデルの開発と実験計画

1. 動物の準備と無作為化
   1. Vital River LaboratoryからC57BL / 6Jマウスを入手し、8週齢、体重19〜26 gの男女比を均等にします。
   2. 12:12時間の明暗サイクル、制御された温度(22±2°C)、および湿度(50〜60%)を備えた特定の病原体のない(SPF)条件で動物を飼育します。
   3. 標準的な食料と水に自由にアクセスできる7日間の順応期間を許可します。
   4. 順応中にベースラインの行動評価を実行する: 前肢配置テスト (片側 10 回の試行)、加速ロータロッド評価 (5 分間で 4-40 rpm)、およびオープンフィールド自発運動分析 (50 cm × 50 cm × 50 cm の装置での 10 分間のセッション) を含む包括的な行動評価を実施します 28,29,30。
   5. バイアスを最小限に抑えるために、コンピューター化されたランダム化を使用して動物を実験グループ(グループあたりn = 6)にランダムに割り当てます:偽、モデル、モデル+ Nrf2-KD、モデル+oe-Nrf2。
   6. 行動評価を行う研究者がグループの割り当てを認識しない盲検実験計画を実装します。
2. 1‐メチル‐4‐フェニル‐1,2,3,6‐テトラヒドロピリジン(MPTP)誘発パーキンソン病モデル
   1. 注射直前に、15 mgの塩酸MPTPを5 mLの滅菌生理食塩水に溶解し、動物の体重に基づいて容量を調整して、滅菌生理食塩水中で30 mg / kgのMPTP溶液を調製します。
      注意:MPTPは神経毒性が高いです。二重手袋や白衣などの適切な個人用保護具を着用した化学ヒュームフードで取り扱ってください。
   2. MPTP を 30 mg/kg 体重 (注射量 10 mL/kg) で腹腔内注射により、毎日同じ時間に 3 日間連続して投与します (09:00 ± 30 分)。
   3. 同一の注射スケジュールに従って、偽のグループ動物に等量の滅菌生理食塩水を注射します。
   4. 標準化されたスコアリングシートを使用して、MPTP 投与期間中、苦痛、体重減少 (>15% がエンドポイントと見なされる)、または副作用の兆候がないか動物を毎日監視します。
   5. 神経変性の発症を可能にするために、最終注射後8日間動物を維持します。
      注:この期間中、動物は継続的な監視で通常どおり飼育できます。
3. 定位ウイルス注射
   1. ポリエチレンイミン(PEI;1:3 DNA:PEI比)を使用してHEK293T細胞のトリプルトランスフェクションによってAAV9ウイルスベクターを調製し、トランスフェクション後72時間で回収し、ヨオジキサノール勾配超遠心分離(2時間で177,000 × g )を使用して精製し、遠心フィルター装置を使用して濃縮して、1 × 10¹² ゲノムコピー/mLを達成します。
   2. ITR領域を標的とするプライマーを使用して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介してウイルス力価を検証し、標準曲線分析で力価が1×10¹²ゲノムコピー/mLに達することを確認します。
   3. ITR特異的プライマーを用いたSYBR Greenベースの定量的PCRを使用してウイルス力価を検証し、既知の標準の連続希釈を実行し、標準曲線分析を使用してゲノムコピーを計算します。p24 ELISAを使用して、複製能力のあるウイルス汚染がないことを確認します。
   4. ノーズコーンを通して0.8〜1.0 L / minの酸素流量で送達されたイソフルラン(3%誘導、1.5〜2%維持)でマウスを麻酔し、手順全体を通して呼吸数(60〜100呼吸/分)とつま先のつまみ反射を監視します。マウスを定位フレームに固定し、角膜の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。
   5. マウスを定位フレームに固定し、角膜の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。
   6. 滅菌メスの刃を使用して1.5cmの正中線頭皮切開を行い、0.1mmの精度で定位座標を使用してブレグマのランドマークを特定します。
   7. 線条体の注射座標を計算します: 前後 -0.5 mm、内側外側 ±2.0 mm、背腹 -3.0 mm。
   8. 蛍光トレーサー(緑色蛍光タンパク質[GFP]など)のパイロット注射を実行してターゲティング精度を検証し、実験注射前に免疫組織化学を介してミクログリアマーカー(Iba1)との>80%の共局在を確認します。
   9. 注射針(33-G)を1 mm/分の速度で目標深さまで下げ、自動コントローラー付きのマイクロシリンジポンプを使用して、0.2 μL/分で2 μLのウイルス懸濁液を注入します。注射針を目標の深さまで下げ、マイクロシリンジポンプを使用して2 μLのウイルス懸濁液を0.2 μL/分の速度で注入します。
   10. 逆流を防ぐために、注射後5分間針の位置を維持します。
   11. 針を0.5 mm / minの速度でゆっくりと引き抜き、断続パターンを使用して4-0シルク縫合糸で切開部を閉じ、加熱された回復パッドで麻酔からの回復を可能にします。
   12. 術後鎮痛剤(カルプロフェン5mg/kgを1日1回皮下投与し、3日間)し、詳細な観察シートで回復を24時間監視します。

3. 分子生物学の技術と検証

1. RNA抽出と品質管理
   1. CO₂ 吸入とそれに続く頸部脱臼によって動物を人道的に安楽死させることにより、実験エンドポイントの直後に細胞または線条体脳組織サンプルを採取します。氷上で組織を解剖し、細かく刻み、細胞を採取する場合は37°Cで10分間0.25%トリプシンで酵素的に解離します。
   2. TRIzol試薬(1、10、⁶ 細胞あたり1 mL、または組織100 mg)を使用して、機械的ホモジナイゼーション(ダウンスホモジナイザーで20〜25ストローク)およびクロロホルム相分離(TRIzol1 mLあたり0.2 mLのクロロホルム)を使用してトータルRNAを抽出します。
   3. 分光光度法(A260/A280比1.8-2.0)とゲル電気泳動(1%アガロース)を使用してRNAの品質を評価し、28Sおよび18Sリボソームバンドを確認します。
   4. 分光光度計を使用してRNA濃度を定量します。
   5. RNAサンプルを-80°Cのヌクレアーゼフリー水に-80°Cで保存し、分析までRNase阻害剤(40単位/μL)を添加します。
2. 核細胞質分画
   1. 細胞を採取し(最小2×10⁶ )、氷冷PBSで2回洗浄します(洗浄ごとに5 mL、300 × gで5分間遠心分離)。
   2. 次のプロトコルで市販の細胞分画キットを利用します。
      1. 細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含む200 μLの細胞質抽出バッファーに再懸濁します。
      2. 氷上で10分間インキュベートし、3分ごとにボルテックスします。
      3. 16,000 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清(細胞質画分)を収集します。
      4. ペレットを細胞質抽出バッファーで2回洗浄します。
      5. ペレットを100 μLの核抽出バッファーに再懸濁します。
      6. 氷上で40分間インキュベートし、10分ごとにボルテックスします。
      7. 16,000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、上清 (核画分) を回収します。
   3. ウェスタンブロットを使用して核マーカー(U6)と細胞質マーカー(GAPDH)の分布を分析することにより、分画効率を検証します。
   4. 核画分と細胞質画分からRNAを別々に抽出します。
   5. フラクション特異的参照遺伝子を用いたRT-qPCRを使用して、各フラクションのNrf2 mRNAレベルを解析します。
3. 定量的リアルタイムPCR(RT-qPCR)
   1. ランダムプライマーを含む逆転写試薬キットを使用して、1 μgのトータルRNAからcDNAを合成します。
   2. リアルタイムPCRシステム上で遺伝子特異的プライマーを含むPremix Ex Taq IIキットを使用してqPCRを実行します。
   3. メルトカーブ分析を使用してプライマーの特異性を検証し、ゲル電気泳動によって単一のアンプリコンを確認します。
   4. 次の熱サイクル条件を使用します:95°Cで10分間の初期変性、その後95°Cで15秒、60°Cで30秒、72°Cで30秒の40サイクルが続きます。
   5. β-アクチンを内部参照として、^2-ΔΔCt 法を使用して相対的なmRNA発現レベルを計算します。
   6. テンプレートなしのコントロールを含め、geNorm分析を使用して実験条件全体で参照遺伝子の安定性を検証します(安定性値M<0.5)。
      注:再現性スコア:アッセイ内変動係数(CV)<3回の独立した実行で10%。
4. m6A修飾分析のためのMeRIP-qPCR
   1. トータルRNA(最小20 μg)を抽出し、RNAフラグメンテーション試薬(10 mM ZnCl₂、10 mM Tris-HCl、pH 7.0)を使用して100〜200ヌクレオチドにフラグメント化し、70°Cで5分間。
   2. m6A特異的抗体(RNA 20 μgあたり2 μg)を4°Cで一晩、免疫沈降バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、750 mM NaCl、0.5%NP-40)で回転(10 rpm)して免疫沈降を行います。
   3. 既知のm6A修飾および未修飾のRNAコントロールを使用して抗体特異性を検証します。
   4. 免疫沈降複合体を洗浄バッファーで5回洗浄します。
   5. 結合RNAを溶出し、ランダムプライマーを用いて逆転写します。
   6. ランダムプライマーを使用して溶出したRNAを逆転写し、潜在的なm6A部位をカバーするNrf2特異的プライマーを使用してqPCR分析を実行します。
   7. Nrf2特異的プライマーを使用してqPCR解析を実行し、入力RNAに対する濃縮を計算します。
      注:検出に一貫性がない場合は、フラグメンテーション時間(4〜6分)を最適化して再現性を向上させます。定量的ベンチマーク:IgGコントロールと比較したS/N比>15:1。

4. タンパク質の分析と検証

1. タンパク質の抽出と定量
   1. プロテアーゼ阻害剤(1 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、1 μg/mLロイペプチン、1 μg/mLペプスタチンA)およびホスファターゼ阻害剤(1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、5 mMフッ化ナトリウム)を含む200 μLの放射免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーで、細胞(1×10^6細胞) を溶解するか、組織サンプル(100 mgの線条体組織)を均質化します。
   2. ライセートを氷上で30分間インキュベートし、定期的にボルテックスします(10分ごとに10秒間)。
   3. 12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離して、細胞破片を除去し、上清を回収します。
   4. ウシ血清アルブミン標準試料(0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 μg/mL)を用いたビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いて、タンパク質濃度を3回測定して定量します。
   5. ウェスタンブロットを使用して、すべてのサンプルのハウスキーピングタンパク質レベル(GAPDH、予想MW:36 kDa)を分析することにより、タンパク質の完全性を検証します。
2. ウェスタンブロット分析
   1. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ローディングバッファー(最終濃度:62.5 mM Tris-HCl、pH 6.8、2%SDS、10%グリセロール、5%β-メルカプトエタノール、0.003%ブロモフェノールブルー)に等負荷(30〜50 μg)でタンパク質サンプルを調製し、95°Cで5分間変性させます。
   2. 10%ポリアクリルアミドゲルを使用してSDS-PAGEによってタンパク質を分離し、80 Vで30分間実行し、続いてトリス-グリシン-SDSバッファー中で120 Vで90分間実行します。
   3. 転写バッファー(25 mM Tris、192 mMグリシン、20%メタノール)中のセミドライ転写システム(400 mAで90分間)を使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に転写します。
   4. 抗体インキュベーションに進む前に、可逆的タンパク質染色(ポンソーS:5%酢酸中0.1%で5分間)を使用して転写効率を確認します。
   5. TBST(TBS + 0.1%Tween-20)中の5%脱脂乳で膜を1時間、穏やかに攪拌しながらRTで1時間ブロックします。
   6. ブロッキングバッファーで1:1000に希釈した一次抗体と、4°Cで穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。
   7. メンブレンをTBSTで3回(各10分)洗浄し、HRP結合二次抗体(1:5000希釈)とRTで1時間インキュベートします。
   8. 強化された化学発光を使用してタンパク質バンドを検出し、デンシトメトリーを使用して定量します。
   9. 標的タンパク質の発現をローディングコントロール(GAPDH)に正規化し、適切なコントロール(一次抗体のペプチドブロッキング、二次のみのコントロール)を使用して抗体特異性を検証します。

5. 行動評価と機能分析

1. 前肢配置試験
   1. 評価する前に、マウスをテスト環境(静かな部屋、22°C、薄暗い照明)に30分間順応させます。
   2. マウスの背側皮膚をそっとつかみ、マウスがテーブルの表面が見えないようにしながら、テーブルの端から約0.5 cm上に4本の手足すべてを吊り下げます。
   3. テーブルの端に両側の触毛をブラシで当てて、配置反射をトリガーし、2秒以内に前肢の配置が成功したことを記録します。
   4. 片側に10回、試行間に30秒の間隔で、左右を交互に行います。
   5. 概日の影響を最小限に抑えるために、一貫した照明条件 (50-100 ルクス) と時間帯 (13:00-17:00) でテストを実行します。
   6. 成功率を成功したプレースメントの割合として計算します:(成功したプレースメント/合計試行回数)× 100。
2. ロータロッド試験の加速
   1. ロータロッド装置を初速度4rpmに設定し、線形加速度を40rpmに5分間かけて設定します。
   2. 学習効果を最小限に抑えるために、テスト前にロータロッドでマウスを3日間連続して訓練します(1日3回の試行、15分間隔)。
   3. RT(22 ± 2 °C)、照明(100ルクス)、バックグラウンドノイズレベル(<50 dB)などのテスト条件を標準化します。
   4. マウスを回転ロッドに前を向いて置き、すぐに加速プロトコルを開始します。
   5. 各試行について転倒までの潜時(マウスが転倒または5分間の試行を完了するまでの時間)を記録し、15分間の休憩間隔で動物ごとに5回テストします。
   6. 動機付け要因によるばらつきを最小限に抑えるために、最も長い 3 つの試行から平均潜時を計算します。
3. オープンフィールドテスト
   1. アリーナの上 50 m にビデオ追跡システムを備えたオープン フィールド 装置 (50 cm × 50 cm ×透明なアクリル ボックス) を使用してください。
   2. 動物の間に70%エタノールで装置を洗浄し(スプレーして拭き取り、5分間自然乾燥)、臭いの合図を除去します。
   3. マウスを装置の中央に置き、10 fps のビデオ キャプチャで一定の照明 (200 ルクス) 下で 30 分間アクティビティを記録します。
   4. 自動追跡ソフトウェアを使用して複数のパラメータを分析します。
      総走行距離(cm)
      センターゾーン時間(壁から10cmと定義され、秒単位で報告)
      移動速度(cm / s)
      周辺ゾーンと中央ゾーンで費やした時間
4. 中央ゾーンを壁から 10 cm と定義し、中心ゾーンと周辺ゾーンで費やした時間と移動距離を定量化します。

6. 高度な顕微鏡とイメージング

1. ROS検出のためのDHE染色
   1. 使用直前にPBS中で10μMの新鮮なジヒドロエチジウム(DHE)溶液を調製します(光から保護します)。
   2. DHEとトリプトファンヒドロキシラーゼ2(TPH2)抗体(1:500希釈)を組み合わせた共免疫蛍光染色を行い、セロトニンニューロンを特異的に同定します。
      注:この二重標識アプローチは、DHEがスーパーオキシドによる酸化時に、起源の細胞内に局在したままの膜不透過性蛍光生成物を形成するという原理に基づいて、TPH2陽性ニューロン細胞体内のROS産生を周囲のグリア細胞の酸化ストレスから識別することができます。
   3. 組織切片(厚さ20μm)をDHE溶液とともに、加湿チャンバー内の暗所で37°Cで30分間インキュベートします。
   4. ROS検出特異性を検証するために、ネガティブコントロール(DHEなし)とポジティブコントロール(100 μM H₂O₂ 処理を30分間)を含めます。
   5. PBSで切片を3回洗浄し、退色防止封入剤でマウントします。
   6. 蛍光顕微鏡(DHE:518 nm励起/ 605 nm発光、TPH2:488 nm励起/ 525 nm発光)を使用した画像は、サンプル間で一貫した露光設定(200 ms)です。イメージングシステムは、標準蛍光ビーズ(S/N比>20:1)を使用して毎週校正されました。
   7. 標準化された分析プロトコル(閾値:50-255、粒子サイズ:10-∞ピクセル²)を備えたImageJソフトウェアのみを使用して、TPH2陽性細胞の蛍光強度を定量します。TPH2免疫反応性に基づいてROI境界を確立し、隣接するミクログリア、アストロサイト、またはその他の細胞型からのシグナルを排除しながら、セロトニン作動性ニューロン内で特に酸化ストレスを確実に測定します。各動物について、複数の組織切片にわたって最低50個のTPH2陽性ニューロンを分析します。
2. 免疫組織化学
   1. 組織切片をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで4°Cで24時間、穏やかに攪拌しながら固定します。
   2. 段階的なエタノールシリーズ(70%、80%、90%、95%、100%×各2、1時間)で脱水し、自動プロセッサを使用してパラフィンに埋め込みます。
   3. ミクロトームを使用して5 μmの切片を切断し、帯電したスライドガラスに取り付け、スライドごとに3〜4切片を確保します。
   4. キシレンを使用して切片を脱パラフィン化し(2×10分)、段階的なエタノールを介して水に再水和します。
   5. クエン酸緩衝液(10 mMクエン酸ナトリウム、pH 6.0)をマイクロ波(750 W、10分間、2分間の冷却間隔で)で使用して抗原検索を実行します。
   6. 適切な陰性対照(一次抗体なし)および陽性対照組織(標的タンパク質を発現することが知られている脳切片)を使用して抗体特異性を検証します。
   7. メタノール中の3%過酸化水素でRTで10分間内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。
   8. 一次抗体を加湿チャンバー内で4°Cで一晩塗布します。
   9. HRP結合二次抗体(1:500希釈、RTで1時間)およびDAB発色原(茶色が現れるまでインキュベート、通常は2〜5分)を使用して検出します。
   10. ヘマトキシリンで対比染色(30秒)、脱水、透明化、永久封入剤でマウントします。
   11. 体系的なランダムサンプリング(5セクションごと、セクションごとに3カウントフレーム、40×倍率)を備えた立体学的方法を使用して陽性細胞を定量化します。

7. 統計分析とデータ検証

1. 統計的計画と分析
   1. 検出力分析を実行して、G*Power 3.1.9.7 ソフトウェアを使用して、生物学的に意味のある差 (効果量 ≥ 0.8、検出力 ≥ 0.80、α = 0.05) を検出するための適切なサンプル サイズを決定します。
   2. Shapiro-Wilk 検定を使用してデータの正規性を検証し、パラメトリック分析の前に Levene 検定を使用して分散の均一性を評価します。
   3. 実験計画とデータ分布に基づいて適切な統計テストを行い、統計ソフトウェアを使用してデータを分析します。
   4. 単一因子比較には一元配置分散分析(ANOVA)を適用し、要因計画(時間相互作用×処理など)には二元配置分散分析を適用します。
   5. ANOVAが有意性を示す場合(p < 0.05)、多重比較にはTukeyの事後検定を使用し、必要に応じてボンフェローニ補正を適用します。
   6. すべての分析で統計的有意性しきい値を p < 0.05 に設定し、p < 0.01 と p < 0.001 の追加表記を行います。
   7. 効果量 (Cohen's d または η²) と 95% 信頼区間を p 値とともに報告して、包括的な統計的解釈を提供します。
   8. 少なくとも3つの独立した実験からの平均±SEMとしてデータを提示し、n≤10のときに個々のデータポイントを表示します。
      注:すべての細胞培養実験は、適切なコントロールと複数の技術的反復を含む各実験で、少なくとも3回独立して繰り返す必要があり、観察された変動性(例えば、CV<行動データの場合は15%)は、盲検化と標準化されたタイミングによって最小限に抑えられました。

このプロトコルは、対照群と比較してmRNAとタンパク質レベルの両方の低下によって証明されているように、LPS処理されたミクログリア細胞でMettl3発現が減少することを首尾よく実証しています(図1B、C)。ELISA分析により、培養上清中のIL-6およびTNF-αレベルの上昇によるLPSを介した炎症活性化の成功が確認されています(図1A)。

MeRIP-qPCR分析により、Mettl3の過剰発現がNrf2 mRNA m6Aメチル化を増強し、逆説的に分解を促進するのではなく、タンパク質の安定性と発現を増加させることが明らかになり、m6A修飾が特定の細胞コンテキスト下で翻訳効率を高めることができるという新たな証拠と一致しています(図2A、B)。核細胞質分画実験は、Nrf2 mRNAの分布が細胞コンパートメント全体で変化しない一方で、タンパク質レベルがMettl3発現状態によって有意に調節されることを示しています(図2C、D)。

MPTP 誘発 PD モデルを使用した in vivo 実験では、行動障害が Mettl3/Nrf2 軸の分子変化と相関していることが示されています。すべての組織サンプルは、線条体領域から採取されました(座標:ブレグマから+0.5〜-0.5 mm、外側±1.5〜±2.5 mm、腹側-2.5〜-3.5 mm)。モデル群のマウスは、偽対照と比較して、前肢配置精度の低下、ロータロッド性能の低下、およびオープンフィールド活動の低下を示します(図3A)。Nrf2ノックダウンはこれらの欠損を悪化させますが、Nrf2の過剰発現は部分的な保護を提供します。免疫組織化学的分析により、PDモデルの線条体領域におけるミクログリア集団(Iba1陽性細胞)の減少が明らかになり、それに応じてNrf2調節がミクログリアの生存に影響を与えます(図3B)。

炎症誘発性サイトカインレベル(IL-1β、IL-18、TNF-α)は、予想どおり疾患モデルで有意に増加し、モデル群は偽対照と比較してレベルが上昇し、Nrf2の過剰発現は抗炎症効果をもたらします(図3C)。分子分析では、MPTP処理動物においてGSDMD-N、切断カスパーゼ-1、NLRP3などのパイロトーシスマーカーの上昇が実証され、補正されたウェスタンブロットの結果は適切な分子量マーカーを示しています(図3D)。走査型電子顕微鏡は、Nrf2変調がパイロプトーシス細胞死の程度に影響を与えることで、罹患動物におけるパイロプトーシス体形成の増加を確認します(図3E)。

TPH2免疫蛍光と組み合わせたDHE染色は、PDモデルのセロトニンニューロンで特にROSレベルの上昇を明らかにします(図4A)。TPH2陽性細胞体内のDHE酸化生成物の共局在は、炎症性サイトカイン誘発性ミトコンドリア機能障害および抗酸化防御障害と一致して、これらのニューロンにおける内因性スーパーオキシド生成を示しています。DHEシグナルの空間分布は、びまん性組織の酸化ではなくニューロンの形態と一致し、細胞型特異的な酸化ストレスをサポートします。免疫組織化学は、モデル群およびモデル+Nrf2-KD群でセロトニンニューロンマーカーTPH2およびSLC6A4の発現減少を示し、モデル+oe-Nrf2群で保護効果が観察されました(図4B)。これらの発見は、ミクログリアのパイロトーシスが酸化ストレスとそれに続くセロトニンニューロンの損傷につながることを示しています。

全体的なメカニズム経路を 図5に要約し、Mettl3を介したNrf2のm6A修飾がミクログリアのパイロトーシスを抑制し、セロトニンニューロンを保護する方法を示しています。

成功した実験は通常、Mettl3/Nrf2 発現レベルと下流の炎症マーカーとの間に明確な用量反応関係を示します。不完全なウイルス形質導入、不十分な LPS 活性化、または組織処理中の技術的な問題により、最適ではない結果が発生する可能性があります。対照実験は、免疫組織化学分析において適切な抗体特異性と非特異的結合の欠如を一貫して実証しています。線条体におけるウイルス感染効率は、Iba1 および NeuN マーカーとの共局在化によって検証され、ミクログリアの標的化が優勢であることが確認されました。

図1:LPS誘導ミクログリア細胞におけるMettl3の過小発現。 (A)LPS処理ミクログリア細胞におけるIL-6およびTNF-αレベルのELISA測定。(B)LPS処理ミクログリア細胞におけるMettl3 mRNAレベルのRT-qPCR測定。(C)LPS処理ミクログリア細胞におけるMettl3タンパク質レベルのウェスタンブロット測定は、64 kDaでMettl3と36 kDaでGAPDHを示しています。**データはSEM±平均を表し、グループあたりn = 6です。*p < 0.05、p < 0.01 対対照群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:Mettl3は、LPS誘導ミクログリア細胞におけるm6A修飾を介してNrf2の翻訳に影響を与えます。 (A)oe-NCおよびoe-Mettl3群におけるNrf2 mRNAレベルのRT-qPCR測定。(B)oe-NCおよびoe-Mettl3群におけるNrf2メチル化レベルのMeRIP-qPCR測定。(C)実験群の核および細胞質におけるNrf2 mRNAレベルのRT-qPCR測定。(D)実験群におけるNrf2タンパク質レベルのウェスタンブロット測定は、110 kDaでNrf2、36 kDaでGAPDHを示しました。**データはSEM±平均を表し、グループあたりn = 6です。*p < 0.05、p < 0.01 対対照群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:NLRP3インフラマソームを介してミクログリアのパイロトーシスを引き起こすMettl3 / Nrf2軸の in vivo デモンストレーション。 (A)前肢の配置、ロータロッド、およびオープンフィールドテストを含む行動評価。(B)脳組織におけるIbaタンパク質発現の免疫組織化学的検出(スケールバー= 50μm)。(C)脳組織中の炎症性サイトカインのELISA検出は、Nrf2過剰発現による減少を伴うモデル群で予想される上昇を示しています。(D)分子量注釈によるパイロトーシスマーカーのウェスタンブロット検出:110 kDaのNLRP3、22 kDaの切断カスパーゼ-1、31 kDaのGSDMD-N、および36 kDaのGAPDH。(E)パイロプトーシス体の走査型電子顕微鏡検出(特徴的な1〜5μmの膜結合小胞を示す白い矢印で示されます)。セクションごとに5つのフィールドに基づく定量化、n = 6匹/グループ。**データはSEM±平均を表し、グループあたりn = 6です。*p < 0.05、p < 0.01 対偽グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ミクログリアのパイロトーシスはミトコンドリアの損傷を引き起こし、5-HTニューロンのアポトーシスを促進します。 (A)5-HTニューロン(スケールバー= 50μm)で特異的にROS検出のためのTPH2免疫蛍光と組み合わせたDHE染色。共局在化アプローチにより、TPH2陽性ニューロン細胞体内の酸化ストレスを周囲のグリア細胞から識別できます。(B)5-HTニューロンにおけるTPH2およびSLC6A4タンパク質発現の免疫組織化学的検出(スケールバー= 50μm)。**データはSEM±平均を表し、グループあたりn = 6です。*p < 0.05、p < 0.01 対偽グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:Nrf2のm6A修飾と5-HTニューロン死の阻害によるパーキンソン病進行のMettl3を介した抑制の概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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