老化研究のためのマウスモデルからの多臓器コレクション

サマリー

このプロトコルは、若年および高齢マウスにおける複数の組織にわたる加齢関連の解剖学的および組織学的変化を評価するための標準化された臓器採取方法を提供し、倫理的かつ費用対効果の高い実験設計を支援します。

要約

老化は、ほぼすべての臓器や組織に段階的に影響を及ぼし、構造的、細胞的、分子的な変化をもたらす全身的かつ多因子的な生物学的プロセスです。本プロトコルは、マウスの年齢に関連した解剖学的および形態的変化を包括的な臓器採取を通じて評価し、その後の組織学的および分子解析を行う標準化かつ再現性のあるアプローチを示しています。若いマウス(2〜3ヶ月)と成年マウス(20〜24ヶ月)を用いて、主要な臓器の大まかな解剖学的解剖と体系的な採取のための段階的な手順を詳細に説明し、下流の切片、組織学的染色、顕微鏡的評価を行います。このプロトコルは、単一の動物から脳、目、食道、胸腺、心臓、大動脈、肺、リンパ節、肝臓、膵臓、胃、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、皮膚、骨格筋、骨、脂肪組織を含む幅広い臓器や組織を採取することを可能にします。被験者ごとのデータ収量を最大化することで、このワークフローは倫理的な動物利用を削減し、研究間での再現性を高め、有機体老化の統合的分析を促進します。

概要

加わることはほぼすべての臓器に影響を与える全身的なプロセスですが、多くの実験的研究は単一の組織に焦点を当てており、加齢に伴う変化がどのように共存したり、体全体で相互作用したりするかの洞察は限られています。加齢は、免疫機能障害、代謝シフト、再生能力の喪失、構造変性など、組織特異的および全身的な変化の両方で現れます^1,2。臓器特異的な研究は貴重な洞察をもたらしてきましたが、細胞老化がシステム全体にどのように寄与するかを理解するには、より広い視点が必要です。マウスなどの前臨床in vivoモデルにおける多臓器解析は、加齢関連疾患や生理的回復力の喪失に寄与する協調的な構造的、細胞的、分子的変化を特定するために不可欠です^3,4。

実験用マウスは、遺伝的扱いやすさ、短い寿命、保存された加齢経路、そして免疫機能障害、組織線維化、代謝低下、腫瘍増加など人間の老化の主要な特徴を再現できる能力により、老化研究において不可欠かつ確立されたモデルであり続けています^5,6,7.しかし、効率的かつ標準化された多臓器解離プロトコルは広く使われていません。このようなプロトコルは、組織学的比較の最適化、動物使用の削減、^{同一被験者の}組織間でのオミクスデータセットの統合に必要です^8,9。

ここでは、マウスにおける多臓器灌流、解剖、保存のための再現可能で時間効率の良いプロトコルを提示します。このプロトコルは、脳、目、胸腺、心臓、肺、大動脈、鼠径リンパ節、消化管(食道、胃、小腸、大腸)、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、膀胱、脂肪組織、骨格筋、骨、皮膚を含む主要臓器の解剖学的解離と採取のためのステップバイステップガイドを提供します。組織学的、分子的、クライオセクシングのワークフローに対応した組織保存の詳細な指示も含まれています。この標準化されたアプローチにより、研究者は同じ実験対象内で臓器特異的かつ全身的な加齢の特徴を評価することができ、統合的で質の高い老化研究を支えています^。

プロトコル

C57BL/6Jマウスはカリフォルニア大学サンフランシスコ校で管理されていました。すべての動物処置は、施設動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物資源センターが監督していました。マウスは12時間の明暗サイクルで飼育され、ケージにつき成マウスは5匹未満でした。安楽死は、アメリカ獣医師会(AVMA)の動物安楽死ガイドライン¹³に従って行われました。このプロトコルでは、若いマウスは生後3か月で、成年マウスは生後22か月で生け贄にされました。解剖および臓器採取を進める前に、準備チェックリスト(表1)および組織採取チェックリスト(表2)を印刷し、完了してください。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 頸椎脱臼

注意:頸椎脱臼は、頸部構造への過度な外傷を最小限に抑えるために、訓練を受けた専門家によって行われます。

1. 片手で尾の根元をしっかり掴んでネズミを拘束します。
2. 反対側の手の親指と人差し指を頭蓋骨の付け根に置きます。
3. 頸椎を脱臼させるために、しっかりとかつ素早い圧力をかけてください。首を触診して、頭蓋骨と隣接する椎骨の分離を確認してください。
4. 呼吸停止と有害刺激への反応がないことを確認し、安楽死が成功した(機関承認のプロトコルに従い)を確定してから進めます。
5. 灌流と組織採取前にマウスの体重を記録してください。

2. 開胸術と灌流

注意:灌流は任意です。パラホルマルデヒド(PFA)を含むすべての処置は、認証済みの化学煙処理フード内で、白衣、ニトリル手袋、安全メガネなどの適切な個人用防護具(PPE)を着用して行ってください。PFA溶液は、機関の化学物質安全ガイドラインに従って処分してください。すべてのPFA廃棄物および汚染物質(例:手袋、ティッシュ、容器)を明確にラベル表示された有害廃棄物容器に収集し、地方・州・連邦の規制に準拠したプロトコルに従い、機関の環境衛生・安全事務所を通じて処分してください。

注意:固定のためにパラホルムアルデヒド(PFA)を使用する場合は、ホルムアルデヒド蒸気への曝露を避けるために、フームフード下のすべての手順を必ず行ってください。

1. 吸水性のある材料で覆われた発泡スチロールの蓋を設置し、灌流による液体を収集トレイに集めます。マウスをこの解剖面に仰向けで置き、体を安定させるためにピンで四肢を固定します。前肢は胸腔を開くように横向きに位置し、後肢は後方に伸ばして腹壁に優しい緊張をかけます。
   注:この位置は視界を改善し、障害物を最小限に抑え、臓器採取のための作業スペースを最大化します。
2. 胸部に70%のエタノールを塗布します。
3. 鋭いハサミを使って横断膜のレベルに横切開を行い、その後2つのV字型の切開をして肋骨を露出させます(図1A)。
4. 鈍い鉗子を使って皮膚を優しく持ち上げ、残った付着部分を慎重に切り取って胸郭を完全に露出させます。
5. 肋骨の両側に約2cmのV字型の切開を2つ開け、胸腔を開きます。
6. 胸骨を引き上げて、マウスの肩に頭の隣で固定します。
7. 鈍い鉗子を使って、慎重に心臓を露出させてください。灌流ラインから閉じ込められた気泡を取り除き、左心室の先端にバタフライニードルまたはカニューレを約3〜4mmの深さまで挿入します。右心房に約5mmの切開を入れ、灌流液の流出を図1Bにします。
8. 循環系をクリアにするために、カルシウムおよびマグネシウムを含まない生理用溶液(例:PBS、生理食塩水、HBSS)で灌流を開始します。
   注:灌流は20mLの注射器、ポンプ、または重力給餌システムで行うことができます。平均して、マウス1匹あたり1匹あたり15〜20mLの灌流液が必要で、血管から血液を完全に除去します。良好な灌流は、肝臓と肺の急速なクリア(白さ)や、口の周りや舌が青白く見えることで示されます。完全な灌流により、心臓からの血液は透明で血の流れません。
9. 必要に応じて、カルシウム・マグネシウムフリーの生理用溶液(事前洗浄や血液除去に使用)から、4%パラホルマルデヒド(PFA)を含む50mLのシリンジに切り替え、針を固定したままPFA灌流を開始します。配管内に気泡を入らないように注意してください。4%のPFAで継続して、身体の徐々に硬直する程度が判断されるまで。約30mLの固定液で1匹のマウスに十分です。

3. 臓器および組織の収集

注:若マウスと高齢マウスを比較する際には臓器採取の順序が非常に重要です。高齢動物の臓器は脆弱で自己溶解や機械的損傷を受けやすいため、迅速かつ一貫した組織の取り扱いが不可欠です。採取順序の標準化は死後の変動を最小限に抑え、取り扱いの遺物を減らし、動物間で均一な固定品質を確保します^14,15。一貫性は、年齢に伴う微妙な形態変化を検出するために非常に重要です。遅延または不均一なサンプリングはバイアスを引き起こす可能性があります。PFA灌流が行われていない場合は、臓器を迅速に摘出すべきです。膵臓、胃、肺、脳は、すぐに処理されなければ急速な自己溶解や組織学的劣化を起こしやすいです。高齢マウスは腫瘍性病変を頻繁に発症するため、脾臓、肝臓、リンパ節、肺、胸腺を注意深く検査し、非対称、肥大、結節、変色がないか確認してください。これらの所見は全体の疾患負担の一部として記録してください(表2参照)。

1. 灌流または頸椎脱臼後、動物を仰臥させて胸腔および腹腔の主要臓器を採取するところから始めます(図1C)。
2. ピン留めた後はガーゼやスプレーボトルで70%エタノールを優しく塗布すると、毛皮の汚染を最小限に抑え、敏感な部位の組織の水分補給を維持できます。この方法は、私たちの手で毛皮の破片を減らし、解剖時の視界を改善しつつ、完全な浸水の欠点を回避する上で効果的であることが証明されています。
3. ハサミと鈍い鉗子を使い、横隔膜から骨盤にかけて中央線の切開をして腹部を慎重に開き、その後図 1Aの赤い線に示されるように2つの側面切開を行います。皮膚と腹壁をめくって内臓を完全に露出させます。
4. 胃、小腸、結腸:食道接合部で胃を切り離し、幽門端は小腸と連続したままにします。消化管を優しく解放し、支持する靭帯を切断し、その後小腸と大腸を含む管を除去します。直腸の遠端を切ってください。
   1. 腔内内容物を除去するには、十二指腸空腸屈曲部の近位部と回尾部接合部の遠位部を切断します。大腸の場合は、盲腸の近位部で切断してください。小腸と大腸を約20mLの生理用溶液で洗浄し、給餌針を装着した注射器で組織を優しく固定し、損傷を防ぐために細かい鉗子で組織を優しく固定します。
5. 食道:頸部から胃接合部までの食道を隔離します。
6. 脾臓と膵臓:精細な解剖を用いて脾臓と膵臓を周囲の組織から隔離し、機械的損傷を最小限に抑えます。膵臓を脾臓から慎重に切り離してください。直ちに膵臓を切り離し、小さな片状(≤5mm)に切り分け、安楽死後5分以内に固定剤に浸して自己溶解を最小限に抑え、最適な組織形態を保ちます。脾臓を調べ、大きさ、色、形、目に見える異常の有無を確認しましょう。
7. 肝臓:細い先端鉗子を使い、肝葉の間の中央結合組織を掴み、優しく上方に引っ張って緊張を作ります。解剖ハサミで肝臓と隣接臓器の間のすべての付着部を慎重に切断します。肝臓の色、形状、結節やその他の異常の有無を調べてください。
8. 内臓脂肪:内臓脂肪のサンプルを採取します。
   注:若い動物は通常、内臓脂肪がほとんどありませんが、高齢動物は特に腸、腎臓、性腺周辺で脂肪の蓄積が増加する傾向があります。
9. 腎臓と膀胱:両方の腎臓と付属の尿管、膀胱を切除します。細かいハサミや鈍い鉗子を使って、腎臓を周囲の脂肪組織や結合構造から慎重に切り離します。尿管を遠位に向かって膀胱まで進み、残った付着物を切断して尿路全体を隔離します。腎臓や膀胱の大きさ、色、異常を検査してからさらに処理してください。
10. リンパ節:腹膜から皮膚を引き抜き、鼠径部を露出させます。リンパ管に沿って乳腺脂肪パッド内のリンパ節を特定します。細かい先端の鉗子で結節を隔離し、周囲の脂肪や結合組織の破壊を最小限に抑えてください。
11. 心臓:主要な血管を切断して心臓を慎重に取り出します。
12. 胸腺:胸腺を慎重に切除し、その構造を保ちます。胸腺は年齢とともに内旋し、高齢マウスでは胸腺組織がほとんど存在しないか全く存在しないことが多いので注意してください。
13. 肺:鋭いハサミと細い鉗子を使い、肺と付属気管を一体に慎重に取り出します。
14. 大動脈:大動脈と脊椎の間に閉じた鉗子を挿入し、大動脈を優しく外して背側側に沿って分離させます。血管を破らないように注意してください。細かい鉗子を使い、解剖顕微鏡の下で大動脈から周囲の脂肪組織と結合組織を慎重に除去します。
15. 骨格筋:後肢の皮膚を切除し、大腿骨と周囲の筋肉を露出させます。細かいハサミを使い、大腿骨に付着する筋肉を周囲の結合組織から切り離し、腱の挿入部で切断して線維の完全性を保ちます。
16. 骨(脛骨):解離はさみを使い、上にある皮膚と筋肉を切除して脛骨を露出させます。解剖はさみと鈍い鉗子を使い、膝と足首の脛骨を慎重に切り離します。骨を傷つけずに残った軟部組織を取り除きます。
17. 目:大きな解剖ハサミを使ってネズミの首を切り落とす。細かいピンセットで目を慎重に取り除いてください。
18. 脳:頭皮を切除して前頭蓋骨を露出させます。鋭いハサミやメスを使い、頭蓋縫合線に沿って骨節を持ち上げて脳を露出させます(図1D)。嗅球と腹側の付着部を切断してください。頭蓋骨腔から脳を優しく取り出します。形態を維持するために組織を即座に処理します。
19. 皮膚:下流の施術で脱毛が必要な場合は、電動トリマーで脱毛します。鈍い鉗子で背中の皮膚の一部をつまみ、ハサミで切除し、組織を採取してさらなる処理を行います。
20. 関心のある臓器をすべて摘出した後、マウスの死骸全体を450mLの容器に4%のPFAがあらかじめ充填され、予期せぬ発見やウェット固定組織に戻す必要がある査読者の質問に答えるために保管します。

4. 組織保存と処理

注意:組織の完全性を保つために、解剖と保存の間の時間を最小限にしてください。遅延は組織の形態や分子質を損なう可能性があります。組織採取と保存の重要なタイミングに関するさらなる詳細は 表2に示されています。

注意:固定のためにパラホルムアルデヒド(PFA)を使用する場合は、ホルムアルデヒド蒸気への曝露を避けるため、すべての手順をフルーム内で行ってください。

1. 解剖直後に組織を処理し、意図された下流の応用に応じて適切なプロトコル(ステップ4.1、4.2、または4.3)を選択します。
   1. パラホルマルデヒド(PFA)固定:組織学的分析用の組織を4% PFAに4°Cで12〜24時間浸置します。固定後は、残留固定剤を除去するためにリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で組織を徹底的に洗浄し、その後パラフィンの埋め込みと切片処理まで70%エタノールに移して保存します。
2. 最適切断温度(OCT)化合物埋め込み:新しい組織をOCT化合物に埋め込む。組織をOCT化合物で満たした埋め込み型に入れ、気泡を除去し、室温で5分間培養した後、液体窒素の蒸気相で凍結します。アルミホイルで封印し、OCTブロックは−80°Cで保存し、断片をします。
3. 液体窒素蒸気相でのスナップ凍結:液体窒素の蒸気相でRNA、タンパク質、代謝物の分析を目的としたスナップフリーズ組織で、氷結晶の形成を最小限に抑えます。組織を標識付きのクライオチューブに入れ、液体窒素の上に吊るして急速凍結します。完全に凍結したら、サンプルを−80°Cの保存に移します。

結果

解剖時には、老化マウスに腫瘍性病変が見られることが多く、病理的所見を記録するために慎重な検査が必要です(13,14,16,17,18)。図2Aは灌流後に仰向け状態の22か月齢オスC57BL/6マウスを示しています。肺の完全な白さは効果的な灌流を確認させる一方で、肝臓は部分的な白みしか見られません。肝臓の詳細な検査では複数の悪性結節(図2B)、肥大した精嚢(図2A)および脾腫(図2C)が見られました。これらの所見は高齢マウスによく見られ、総疾患負荷の一部として記録されるべき^です。

図3 は解剖と灌流後に採取された巨視的に正常な臓器を示しており、解剖学的完全性と灌流効率の評価を可能にします。消化管は生理用溶液で洗浄され消化物を除去し、胃、大腸、小腸は清潔で半透明な外観にされました(図3A)。食道、膵臓、脾臓、内臓脂肪貯留所、膀胱を持つ腎臓、リンパ節、心臓、胸腺などの追加構造も明確に識別可能で、下流解析のために無傷で分離可能でした(図3B、C、E-I)。

灌流の質は、血管の多い組織における白えを検査することで評価されました。図3Dおよび図3Jに示すように、肝臓と肺は灌流されていない状態、十分な灌流状態、部分灌流状態の間で明確な違いを示しました。完全なブランチングは灌流の成功を確認し、不完全なブランチングは技術的な変異または基礎的な異常を示しました。大動脈、骨格筋、脛骨、脳、眼、皮膚などの他の組織は形態を保存した状態で分離され、さらなる組織学的、分子的、または画像診断の応用に適しています(図3K-P)。この標準化された解剖手順により、無傷で良好に保存された組織や臓器の一貫した回収が可能となり、さまざまな下流解析を支援するための大胆な解剖学的評価が可能となります。解剖および臓器採取は、操作者の経験や病理学的所見の有無により、1匹あたり約40〜60分かかりました。

図4は、パラフィン埋め込み、切片、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色後の、収集された臓器の加齢関連変化の例を示しています。老齢マウスの皮膚切片では、若年対照群と比較して上皮の薄毛と毛包の喪失が観察されました(図4A)。腎切開ではボウマン嚢の拡大、線維化性および壊死性の変化、さらにリンパ腫に一致する領域が認められました(図4B)。膵断片では、高齢動物でアポトーシー体¹⁹ およびリンパ腫領域の増加が観察され、これは加齢に伴う組織の完全性の低下を示しています(図4C)。脾臓切片には、老年動物のアミロイド沈着物やリンパ腫領域が示され、加齢に伴う病理の特徴がさらに示されていました(図4D)。

これらの結果は、複数の組織にわたる老化の代表的な組織病理学的特徴を示し、加齢に伴う衰退の構造的特徴を検出する上でこのプロトコルの有用性を示しています。

図1:マウス解剖および臓器露出手順の概説。 (A) 胸腔および腹腔を開く切開部位(赤線)、横隔膜の高さに横切開、肋骨両側にV字型切開をして胸腔を開け、横隔膜から骨盤への正中切開と両側切開で腹腔を完全に露出させる。(B)左心室にバタフライニーダーを挿入し、右心房を切開して効果的な血液排出を可能にする灌流装置。(C) 空洞露出後の主要な胸部および腹部臓器の解剖学的配置。(D) 頭部解離の手順で、頭皮の除去や頭蓋骨の開口を頭蓋縫線に沿って開いて脳を露出させる手術。赤い線は切開箇所を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:老マウスにおける腫瘍性病変の特定。 (A) 4% PFA灌流後の仰臥姿勢の代表的な22か月齢雄C57BL/6マウス。肺の完全な白さ(ピンクの矢じり)は効果的な灌流を確認し、肝臓(緑色の矢じり)は部分的な白さのみを示します。青い矢じりは精嚢が腫れていることを示します。(B) 肝臓の詳細な観察で複数の悪性結節(黒い矢じり)が確認。(C) 高齢のC57BL/6マウスの脾臓(右側)が若年動物の正常脾臓(左側)と比較して腫大している。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:解剖および灌流後の主要なマウス臓器と組織の完全性の概要。 (A) 消化された内容物を除去するために生理的溶液で洗浄される前後の胃、小腸、結腸。(B) 食道。(C)脾臓付きの膵臓。(D) 灌流なしの肝臓、効果的な灌流後に完全な白み直し、部分的な白みは不完全な灌流または基礎疾患を示す。(E)内臓脂肪組織。(女性)腎臓と膀胱の連結。(G)鼠径リンパ節。(H)心臓。(I)タイムス。(J) 灌流なしの肺、効果的な灌流後に完全な白水、部分的な白水付き。(K)大動脈。(左)後肢から分離した骨格筋。(男性)骨格が保存された脛骨。(N)脳。(O)目。(P)皮膚。スケールバー: A、 C、 D、 E、 F、 J、 L、 N、 Pで5mm;他のパネルは1mmです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を用いた主要臓器の組織学的解析。(A) 3か月齢(若生)および22か月齢(高齢)マウスの皮膚切片。老年動物の断片は上皮の薄化と毛包の喪失を示しています。(B)腎臓切片でボウマンのカプセルが強調される。老年動物の切片からは、嚢の拡大、線維化性および壊死性の変化、リンパ腫(オレンジ色の矢じり)が見られます。(C) 若年および高齢動物の膵切除、高齢動物はアポトーティックな体(青い矢じり)やリンパ腫領域(オレンジの矢じり)が増加する。(D) 3か月齢(若年)および22か月齢(高齢)マウスの脾臓切片。老年動物の断片からはアミロイド沈着(ライムグリーンの矢じり)やリンパ腫領域が見られます。スケールバー(A-C)100μm。スケールバー(D)500μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

表1:準備チェックリスト。 マウス組織の解剖と保存に必要な準備のステップバイステップリスト。チューブおよびカビのラベリング、バッファーおよび固定液の準備、クライオ埋め込みのセットアップ、解剖ツールの滅菌、ワークステーションの配置、文書作成の計画などが含まれます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:組織採取チェックリスト。 テーブルを使って採取した組織を記録してください。採取時間と状態や異常に関するメモを追加してください。研究に不可欠な組織を優先し、組織の自己溶解や劣化を防ぐために推奨期間内に最も関連性の高い臓器を収集してください。*異常(臓器変色、結節、悪性腫瘍、異常な臓器サイズなど)に注意してください。**保存方法(PFA固定、OCT埋め込み、スナップフリージングなど)の記録を検討してください。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、若年マウスおよび高齢マウスにおける複数の臓器系を体系的に収集するための再現可能な戦略を提供し、解剖学的、組織学的、分子分析を可能にします。いくつかの技術的要因が結果の質に影響を与え、説明した方法の制限に対処する可能性があります。まず、灌流の質のばらつきは重要な要素です。不完全な灌流は残留血液を残し、組織学、免疫組織化学、分子分析に影響を及ぼすことがあります。頸椎脱臼後の灌流は頸部組織に外傷を与え、肺の血液汚染を引き起こす可能性があります。したがって、頸椎脱臼は訓練を受けた専門家のみが行うべきです。最適な結果を得るためには、IACUCおよびAVMAガイドライン¹³に従い、^他で説明されている末期麻酔下で灌流を行うべきです。第二に、固定は組織の完全性を決定する重要な要素です。4%パラホルムアルデヒド(PFA)は広く使用されていますが、大型または高密度の臓器への浸透が不十分で、組織学的および抗原保存が不十分になることがあります。この制限は、10%中性緩衝ホルマリン(NBF)を使用するか、組織を≤5mmの断片に切断して浸^{透性を向上させる}ことで緩和できます。第三に、特に膵臓、胃、脳などの一部の組織は急速な自己溶解を起こし、安楽死後5〜10分以内に固定または凍結が必要となり、事前に冷却された^{解剖器具の使用}が必要です。高齢マウスでは、腫瘍が解剖学をさらに歪め、解剖を複雑にすることがあります。固定容量不足や凍結によって追加のアーティファクトが生じ、収縮やエッジ効果が現れることもあります。これらの問題は、固定剤と組織の比率を少なくとも10:1に保ち、過密を避け、埋め込み前にOCT型を予冷することで最小限に抑えられます。最後に、PFAやホルマリンの使用は安全性や廃棄上の懸念を伴います。グリオキサール系の固定剤は毒性の少ない代替品を提供します。したがって、標準化された取り扱い、最適化された固定、慎重なタイミングは、再現性、組織の質、そして下流解析の信頼性を最大化するために^{不可欠です。}

同じ動物の15以上の臓器から組織を採取することで、被験者ごとの生物学的収穫量を最大化し、動物使用を減らす倫理的義務にも沿っています。この体系的な手法は、加齢に伴う生理学的衰退や臓器特異的病理を調査する中程度のスループット研究へと容易に拡大可能です²⁵。

自己溶解しやすい組織の迅速な処理は、組織学的な完全性を維持するために不可欠です。カルシウムおよびマグネシウムを含まない生理学的溶液を使用し、その後4%のPFAを使用することで、膵臓や消化器系のような敏感な組織の自己溶解を確実に保存し、自己溶解を最小限に抑えます。単一の臓器や疾患モデルに焦点を当てたプロトコルとは異なり、このアプローチは複数臓器の迅速かつ一貫した収集を可能にし、変動を減らしスループットを向上させます。灌流から最終組織切除までの全解剖は、動物1匹あたり60分以内に完了できるため、大規模または時間的に敏感な研究に適しています ^3,11,26。正確な灌流-固定シーケンスの遵守により、アーティファクトを最小限に抑え、再現可能な結果が得られます。

組織採取、トリミング、埋め込みの一貫性は、特に縦断的または多施設研究において、正確な組織病理学的評価に不可欠です。組織の取り扱い方法のばらつきは、人工物を生み出したり、病理学的所見を曖昧にしたり、疾患負荷の誤解を招くことがあります。ラットおよびマウスにおける臓器採取およびトリミングのための改訂ガイド、例えばRENIトリムガイドは、このような不整合を最小限に抑えるための詳細かつ標準化されたプロトコル^{を提供しています。}これらの調和された手法の採用は、研究や機関間のデータの比較可能性を向上させ、再現性を強化し、老化研究における病理学に基づくアウトカムの整合性を高めます ^4,9。

多数の臓器を集めることは、加齢研究において特に重要であり、臓器系がどのように相互作用するかを理解することが、加齢とともに全身の生理的衰退を引き起こす過程を明らかにするために不可欠です。このアプローチは他のさまざまな研究課題にも有益ですが、このプロトコルの焦点は、加齢変化が複数の臓器系に同時に影響を及ぼす可能性のある加齢研究を支援することです。しかし、線維症、再生、老化に焦点を当てた研究、特にトランスクリプトミクスや多組織バイオマーカー発見の統合研究にも適用^{可能です。}

組織学的評価では、複数の組織にまたがる特徴的な年齢関連変異が明らかになりました(図4)。皮膚では、老年動物は上皮の薄毛と毛包の喪失を示しました。腎臓では、老年マウスの切片からボウマン嚢の拡大とともに線維化、壊死性、リンパ腫性の変化が認められました。高齢動物の膵組織からはアポトーシス体やリンパ腫の蓄積が認められ、脾臓切片ではアミロイド沈着物や追加のリンパ腫領域が見られました。これらの観察は確立されたマウスの老化表現型と一致しており^{、このプロトコル}が老化の代表的な組織病理マーカー1,18,19,27,29,30,31,32,33,34の検出に有用であることを示しています。

まとめると、このプロトコルは前臨床老化モデルにおける組織の収集と保存のための信頼性が高くスケーラブルなフレームワークを提供します。これは、組織特異的かつ全身的な老化、変性、回復力のメカニズムを明らかにするために、探索的研究および仮説に基づく研究の両方で採用可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
吸収パッド
熟成したC57BL/6Jマウス	ジャクソン研究所 & nbsp;	#000664
コレクショントレイ
コードレストリマー	BravMini+	CLP-41590	脱毛のために
エタノールスプレー 70%	フィッシャー・サイエンティフィック	50-163-3592
エクストラ・ピンセット5 INOX	デュモン	F6521-1EA	リンパ節用のエクストラファイント鉗子
鉗子	ミリポーアシグマ	XX6200006P	鈍端鉗子
鉗子5 INOX	デュモン	F6521-1EA	細い先端の鉗子
ハンクス・バランスソルト溶液(HBSS)1×500 mL	ギブコ	14025092
マイクロ解剖用のハサミ(直線、シャープ/シャープ、25mm)	ロボズ・サージカル	RS-5668	標準マイクロハサミ、ステンレススチール製、刃25mm(M-37)
マイクロディセクティングハサミ(まっすぐで鋭い/鋭い細い刃)	ロボズ・サージカル	RS-5918	ファインディセクティングハサミ、長さ4.5インチ(H-327)
NBF	シグマ	HT501128	固定のために
生理食塩水溶液	シチバ	76081-514
最適切断温度(OCT)	フィッシャー・サイエンティフィック	23730571
パラホルムアルデヒド(PFA) 4%	電子顕微鏡科学	15710	固定のために
ペトリ皿 100 mL x 15 mL	ミリポーアシグマ	P5856-500EA
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ギブコ	10010023
ピン	アイスコ研究所	DISPINS1	解剖中のマウスの固定
プラスチック製シリンジ 20 mL、ルアーロック	フィッシャーブランド	302830	灌流のために
シール&フリーズボックス(クライオ容器)	テッド・ペラ社	20956
シール・アンド・フリーズ・クライオトレイ	テッド・ペラ社	20956-1	クライオ容器内のサンプルの位置決め
Sol-Vetバタフライニードル(アダプター付き)	ソル・ミレニアム・メディカル	110301070003	灌流のために
発泡スチロールの蓋
組織技術サイロモルド(生検)	さくら	25608-922
若いC57BL/6Jマウス	ジャクソン研究所 & nbsp;	#000664