イムノブロッティングによるアフリカ ツメガエル 卵母細胞および胚からのタンパク質の最適化分析

サマリー

この記事では、アフリカ ツメガエル の卵母細胞および胚からのタンパク質をイムノブロッティングによって分析するためのプロトコルについて説明します。収集ステップが説明され、その後、サンプル処理、SDS-PAGE、転写、抗体染色、およびイメージングに対応するステップが続きます。このプロトコルは、内因性抗体およびタンパク質アフィニティータグに対する抗体による翻訳調節タンパク質複合体の研究に重点を置いています。

要約

ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)とそれに続くイムノブロッティング(ウェスタンブロッティング)によるタンパク質の分析は、分子生物学者のツールキットの重要な部分です。この技術は、複雑なタンパク質混合物を分子量で分離し、特定の抗体を使用して標的タンパク質の存在をアッセイします。イムノブロッティングにはさまざまな用途があります。例としては、タンパク質間相互作用因子を研究するための標的アプローチとして、またはタンパク質標的の発現または枯渇を確認するためのコントロールとしての使用が含まれます。ただし、イムノブロッティングを成功させるには、複雑な多段階の実験が必要です。プロトコルは、各生物、標的タンパク質、およびアプリケーションに合わせて最適化する必要があります。したがって、モデルカエルアフリカツメガエルを含む多くのモデルでのイムノブロットの使用には知識のギャップが存在します。

X . laevis は、そのサイズが大きく、生化学実験用の材料が豊富で、取り扱いが容易であるため、翻訳制御の原理を研究するために不可欠でした。ただし、この種には、堅牢で日常的なイムノブロッティングのための特定のプロトコルが欠けています。ここでは、アフリカ ツメガエル の複数の発生段階のサンプルに最適化されたウェスタンブロッティングの詳細なプロトコルを提供します。次に、開発全体のトランスレーショナルレギュレーターを分析します。

概要

細胞メカニズムを理解するには、特定のタンパク質種を監視する必要があります。一般的な質問には、それらが空間的および時間的に発現がどのように変化するか、それらがどのようなタンパク質と相互作用するか、およびそれらがさまざまな条件に応答して修飾されるかどうかが含まれます。口語的に「ウェスタンブロッティング」として知られるイムノブロッティングは、これらの課題に対処するための重要な方法論です。イムノブロット実験では、複雑なサンプル(全細胞ライセートなど)からタンパク質を分離し、抗体を使用して同定します。具体的には、タンパク質を変性させた後、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によってサイズ別に分離します。サイズ分画されたタンパク質は、ニトロセルロース膜などの固体支持体に移され、目的のタンパク質は抗体試薬を使用して同定されます。イムノブロッティングは、分子生物学者のツールキットの標準的な部分になっています。これは、さまざまな状況でのタンパク質発現のモニタリングや、免疫沈降アッセイなどの実験のエンドポイントとして一般的に使用されます。これらの利点にもかかわらず、イムノブロッティングによる定常状態のタンパク質レベルの分析は、アッセイを各ステップと実験コンテキストに合わせて最適化する必要があるため、困難であることが判明しています(図1)。

困難な状況の 1 つは、アフリカのツメガエル アフリカツメガエルの物質を分析することです。X. laevis は、RNA とタンパク質の相互作用を研究するための重要な生物です。このシステムには多くの利点があり、その主なものは、X. laevisが一度に数百の卵母細胞を生成し、その後同時に胚を発達させることです。各卵母細胞には~25μgの非卵黄タンパク質¹が含まれており、生化学実験に豊富な材料を提供します。卵母細胞と胚のサイズが大きい(~1250 μm)¹は、mRNAマイクロインジェクションを容易にし、タグ付きまたは変異したタンパク質をスケール²で外因的に発現させます。これらの性質により、翻訳制御タンパク質がmRNAに及ぼす影響を、そのタンパク質のRNA結合能力に関係なくアッセイできるテザー機能アッセイなど、X.laevisの翻訳制御をアッセイする強力な実験が可能になります3,4,5,6。しかし、アフリカツメガエルの卵母細胞および胚における免疫ブロッティングには、これらの^{初期細胞7}における卵黄血小板の大量の塊による干渉など、困難が伴い、除去しないと結果が不明瞭になります。

ここでは、翻訳調節タンパク質の検出に重点を置いて 、X. laevis の効果的な免疫ブロッティングのための最適化されたプロトコルを提示します。卵母細胞と胚を収集して処理し、最終的な免疫ブロットをイメージングする方法について説明します。また、最適なタンパク質のローディングとイメージング、およびサンプルの卵黄汚染を防ぐための詳細な手順も含まれています。さらに、アフリカ ツメガエル タンパク質と適合する抗体を見つけるためのプロトコルの変更の可能性と戦略について説明します。私たちは、この十分に活用されていないモデル生物での独自の実験の一環として、免疫ブロッティングを簡単に実行するためのガイダンスを研究者に提供するつもりです。

図1:アフリカツメガエルサンプル調製とその後のイムノブロット分析のワークフロー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

このプロトコルに代表される動物 (X. laevis) に関するすべての作業は、UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee に準拠しており、承認されています。使用した装置、試薬、使用した抗体濃度の詳細は、 材料表に記載されています。機器の選択は、以下の 図2に示されています。

図2:処理された胚抽出物と免疫ブロッティング用装置。 (A)遠心分離した X.laevis ステージVI卵母細胞抽出物。脂質と脂溶性タンパク質が上部に上昇し、ビテロゲニン(卵黄)と色素沈着した破片がペレットを形成します。(B)タンパク質を分子量で分離するためのSDS-PAGE用装置。(i)電源、(ii)垂直電気泳動タンク、(iii)電気泳動タンクの蓋、(iv)電極アセンブリ、(v)バッファーダム、(vi)プレキャスト電気泳動ゲル。緑色の櫛(上)と青色のステッカー(下)は、それぞれ取り除く必要があります。(C)膜転写用装置。縦型電気泳動タンクと蓋は、徹底的なすすぎ後に移送するために再利用されます。(i)気泡を除去するためのローラー、(ii)転写クリップ、(iii)小さな攪拌バー、(iv)2枚の保護用の青い紙の間のニトロセルロース膜、(v)セルロースクロマトグラフィーろ紙、(vi)転写スポンジクッション、(vii)転写アセンブリ用のガラスベーキング皿、(viii)アイスパック、(ix)転写コア。(D) その他の機器。(i)ゲルリリーサー(転写前のゲルウェルトリミング用)、(ii)ゲルカセット開閉レバー、(iii)鉗子(メンブレン取り扱い用)、(iv)コンテナ(メンブレン保持用)、(v)コンテナ蓋。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. アフリカツメガエル の卵母細胞と胚の収集

1. 卵母細胞の準備
   1. 市販の供給業者(Ecocyte Bio Science、テキサス州オースティン)から脱泡された X.laevis 卵母細胞を入手するか^{、または記載}されているように単離して脱泡する8。
   2. 単離された卵母細胞を修飾バルス溶液(MBS、88 mM NaCl、1 mM KCl、0.4 mM CaCl₂、0.33 mM Ca(NO₃)₂、0.8 mM MgSO₄、5 mM Tris-HCl、2.4 mM NaHCO₃、pH 7.4)で使用まで培養します。
2. 胚の準備
   1. X.laevis卵を分離し、説明^{されている}ように受精させます^9,10。
   2. 0.25x Marc's Modified リンゲル液¹¹ (MMR)(1x MMR:0.1 M NaCl、2.0 mM KCl、1 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、5 mM HEPES)で受精胚を培養します。
   3. NaOHを使用してpHを8.2に調整した0.1x MMRの2%システイン溶液を調製します。
   4. 受精に使用する皿から0.25x MMRを取り除き、胚をシステイン溶液で覆い、ゼリーコート¹²を取り除きます。胚が均一に露出するように溶液を穏やかに混合します。
   5. 実体顕微鏡で2倍から25倍の倍率で胚を綿密に監視します。ゼリーコートが溶解した後(通常は3〜5分)、胚は密着します。システインへの長時間の曝露を避けてください。
   6. システイン溶液を取り除き、0.25x MMRで胚を複数回すすぎます。
   7. 目的の成長段階まで0.25倍MMRで培養します。
3. 1.5 mLチューブに必要な数の胚または卵母細胞(サンプルあたり少なくとも5個を推奨)を収集します。
4. 細胞の損傷を避けて、ピペッターで余分な培地を取り除きます。
5. サンプルをすぐに使用するか、使用するまで-80°Cで保管してください。卵母細胞と胚は数年間保存できます。

2. アフリカツメガエル 抽出物の調製

1. 凍結した場合は、氷の上でサンプルを解凍します。
2. 胚/卵母細胞ごとに、二重脱イオン水( 材料表を参照)で1倍に希釈した10 μLの冷却10倍細胞溶解バッファーを加え、氷上のマイクロペストルでサンプルを均質化します。
3. サンプルを卓上遠心分離機で4 °Cで5000gで10分間回転させ、卵黄や不溶性色素などの破片をペレット化します。
4. ペレットを避けるように注意しながら、上清を別の1.5mLチューブに除去します(図2A)。
5. 5% w/v 2-メルカプトエタノールを添加した2x Laemmliサンプルバッファーを同量上清に加え、95〜100°Cで10分間沸騰させてサンプルタンパク質を変性させます。
6. サンプルをすぐに使用するか、-20°Cで数か月から数年保存してください。

3. SDS-ページ

1. SDSランニングバッファーを調製する:1x Tris-MOPS-SDSバッファー(トリス塩基6.06 g、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸[MOPS]10.46 g、SDS 1.0 g、エチレンジアミン四酢酸0.3 g、1000 mLまでの二重脱イオン水)。
2. 4〜12%のビストリスSDSプレキャストゲルをパッケージから取り出します。ジェルの底にあるステッカーをはがします。
3. ゲルをバッファーダムの反対側の電極アセンブリに挿入します。電極アセンブリを垂直電気泳動タンクに入れます(図2B)。
4. 電極アセンブリと電気泳動タンクの底に、1x Tris-MOPS-SDSランニングバッファーを入れます。
5. ゲルからゲルコームをそっと取り外し、バッファーをピペットでウェルに流し込み、気泡を除去し、バッファーを平衡化します。
6. 5 μLの染色済みタンパク質標準試料を最初のウェルに、各サンプル10 μLを追加のウェルに慎重にロードします。
7. (オプション)残りのウェルに10 μLの1x Laemmliサンプルバッファーをロードして、ゲルをより均一に実行します。
8. 電気泳動タンクに蓋をし、電源に接続します。200 Vを印加します。
9. サンプルバッファー色素の前面がゲルから出たら電気泳動を停止します。

4. メンブレンへのタンパク質の湿式転写

1. サンプルを電気泳動している間に、1 Lの転写バッファー(トリスベース3.0 g、ビシン4.08 g、二重脱イオン水900 mL、メタノール100 mL)を調製します。転写バッファーを4°Cで予冷します。
   注意: 濃縮メタノールストックはヒュームフードで取り扱い、皮膚との接触を避けてください。メタノールはエタノールで置き換えることができます。
2. 電気泳動が完了する前に、転写クリップに転写「サンドイッチ」を組み立て始めます(図2C)。
   1. ガラス製のグラタン皿に冷やした転写バッファーを入れます。後続のサンドイッチ組立ステップでは、材料がこのバッファーに浸されていることを確認します。
   2. 転写クリップを皿の底に置き、白い半分を開いて上を向いて、転写クリップを左に開きます。
   3. 転写クリップの黒い半分に1つまたは2つのファイバースポンジを平らに置きます。
   4. 0.35 mmのセルロースクロマトグラフィーペーパー(ろ紙)を2枚サイズに合わせてカットし、スポンジの上に1枚を置きます。
3. 電気泳動が完了したら、電気泳動タンクからゲルを取り出します。
4. ゲルカセット開閉レバーでゲルのプレートを慎重にこじ開け、ゲルがプレートの1つに付着したままであることを確認します(図2D)。ゲルリリーサーでゲルの上部からウェルをトリミングします。
5. プラスチックカセットの半分に取り付けたままのゲルをろ紙の上に置きます。ゲルがろ紙に残るように、カセットの半分を取り外します。
6. ゲルの寸法に合わせて0.45μmのニトロセルロース膜の正方形をカットします。保護紙からメンブレンを取り除き、転写バッファーで短時間濡らし、ゲル上に置きます。
   注:メンブレンの不要なタンパク質汚染を避けるために、手袋または鉗子でメンブレンの角を慎重に扱ってください。
7. ニトロセルロース膜の上に2枚目のろ紙を置きます。ろ紙の上のローラーを使用して、気泡を優しくしっかりと取り除きます。
8. ろ紙の上にさらに1〜2つのファイバースポンジを積み重ねます。
9. 転写カセットを閉じてしっかりとクリップで閉め、「サンドイッチ」が完成します。
10. 転写クリップを上に向けて、転写クリップの黒い面がコアの黒い面を向くように、転写サンドイッチを転写コアに挿入します。
11. トランスファーコアを電気泳動タンクに入れます。アイスパックと撹拌バーをタンクに追加して、撹拌バーが自由に回転できるようにします。
    注:アイスパックに加えて、またはアイスパックの代わりに、ステップ4.13で4°Cの冷蔵室で移送を行うことができます。
12. タンクに冷やした転写バッファーを入れます。蓋をしっかりと固定します。
13. 転送装置を電源に接続し、電極の色を揃えてください。攪拌バーを回転させながら、4°Cで1時間、100 V、移送を実行します。

5. 転写膜処理

1. 10x Tris緩衝生理食塩水(100 mM Tris塩基、1.5 M NaCl)を調製します。pHを8に調整し、フィルター滅菌します。
2. 10x TBS溶液を500 mLの二重脱イオン水で1:10に希釈し、500 μLのTween-20を加えて、Tween-20を含む1xトリス緩衝生理食塩水(TBSTw)を調製します。
3. ブロッキングバッファー(500 mL TBSTw、25 gの脱脂粉乳)を調製します。
   注:脱脂乳は、ブロッキングバッファー中の2〜5%ウシ血清アルブミン(BSA)で置換できます。牛乳にはビオチンが含まれているため、実験用途にビオチン化タンパク質の視覚化が含まれる場合は、BSA を使用する必要があります。
4. 移送が完了したら、サンドイッチを慎重に取り外して分解し、ニトロセルロース膜を取り外します。メンブレンのどちら側がゲルに接触していたかをマークし、後続のステップでこの側を上に保ちます。
5. タンパク質可視化用の可逆染色であるポンソー染色剤(0.5%ポンソーS、1%酢酸)50 mLを調製します。
   注意: ポンソーの染みは腐食性があります。皮膚との接触を避けてください。
6. メンブレンを小さな容器( 図2Dを参照)に入れて、容器の底と同じ高さになるようにします。メンブレンをポンソーステインで覆い、浸漬し、ロッカーの上で5〜10分間穏やかに揺らします。
7. ポンソーの染みを注ぎます。
   注:ポンソーステインは複数回再利用できます。
8. 余分なポンソーが除去され、レーン内のタンパク質バンドが分解され始めるまで、二重脱イオン水の繰り返し洗浄でメンブレンをすすぎます。
9. バンドが明確に解決された直線で均一なレーンの存在により、転送の効率を確認します。
10. 残りの液体を注ぎ、ブロットをブロッキングバッファーに浸漬して、下流のステップで非特異的抗体がメンブレンに結合するのを防ぎます。
11. 室温で30〜60分間ロッカーの上でそっと揺らします。

6. 抗体インキュベーション

1. 一次抗体を10 mLの新鮮なブロッキングバッファーで所望の濃度に希釈します。
   注:最適な濃度は、新しい抗体ごとに経験的に決定する必要があります。一般的な開始点は 1:1000 で、それ以外の場合はメーカーの推奨に従ってください。
2. ブロッキングバッファーを取り除き、抗体混合物と交換します。4°Cで一晩(~16時間)穏やかに揺らしながらインキュベートします。
3. 一次抗体溶液を注ぎ、溶液に浸漬して素早く流し出して、TBSTwでメンブレンをすすぎます。
   注:ほとんどの抗体混合物は保存して2〜3回再利用できます。これは、抗体ごとに経験的に決定する必要があります。
4. メンブレンをTBSTwに浸し、室温で5分間穏やかに揺らして洗浄します。合計 3 回の 5 分間の洗浄を行います。
5. 二次抗体を30 mLのTBSTwで所望の濃度に希釈します。
   注:濃度は、各抗体の経験的に決定する必要があります。通常、1:30,000を使用します。
6. TBSTw洗浄液を注ぎ、二次抗体混合物と交換します。室温で45分間、穏やかに揺らしながらインキュベートします。
7. メンブレンをTBSTwで1回すばやくすすぎ、続いて5分間のTBSTw洗浄を3回行います。

7. フィルム現像液での膜のイメージング

1. 暗室で現像液の電源を入れ、温めます。
2. 膜を囲むのに十分な大きさのラップを2つの正方形に切ります。鉗子を使用して、ニトロセルロース膜をラップの最初の正方形に「上向き」に置きます。
3. 1.5 mLチューブに、同量の化学発光(ECL)ルミノール試薬とエンハンサー試薬を混合します。1 mLの混合溶液を使用すると、ほとんどの膜が覆われるはずです。
4. ECL試薬をメンブレンにピペットで移動させ、ラップを使用してメンブレンを優しく操作して、完全にカバーします。1分間インキュベートします。
5. 鉗子でメンブレンをつかみ、液体をそっと振り落とすか、メンブレンの角をペーパータオルに触れて液体を吸い取ることで、余分なECL試薬を取り除きます。
6. ラップの2番目の正方形にメンブレンを上向きに置き、ラップが緩く密閉されるまでメンブレンの上に折ります。包まれたメンブレンをオートラジオグラフィーカセットにしっかりとテープで留めます。
7. 暗室では、テープで留められた膜を覆うフィルムをカセット内に置きます。カセットをしっかりと閉じ、フィルムをメンブレンに1分間さらします。
8. 露出したフィルムを膜に沿って引きずらないように注意しながら、フィルムを慎重に取り除きます。フィルム現像液に供給します。
9. 現像フィルムを評価したら、目的のタンパク質の可視化が達成されるまで、後続のフィルムで露光時間を調整します。タンパク質の視覚化で弱いシグナルが得られる場合は、より感度の高いECL試薬でECL試薬のインキュベーションステップを繰り返し、再画像化します。
10. 現像フィルムを暗闇で光るマーカーに合わせ、この基準を使用して、膜上の染色済みタンパク質標準の位置をフィルムにマークします。
11. イメージングが完了したら、ラップからメンブレンを慎重に取り除き、TBSTwに浸して残りのECL試薬を洗い流します。

8. (オプション)追加の抗体インキュベーション

注:イムノブロットのストリッピングとは、変性溶液(ストリッピングバッファー)で最初の一次抗体と二次抗体を除去し、ブロットを別の抗体で再プローブできるようにすることを指します。リプロービングにより、同じイムノブロットで異なるタンパク質標的の発現を分析し、未知のタンパク質を標準として機能する十分に特徴付けられたタンパク質と比較することができます。比較的最も弱いシグナルを産生する抗体で最初にプローブします。そうすることで、その後の曝露で不完全に剥離された抗体によって引き起こされるアーティファクトを防ぎ、ブロットの繰り返しの剥離によるタンパク質損失の影響を最小限に抑えます。

1. メンブレンをストリッピングバッファーに浸し、5〜10分間穏やかに揺らすことにより、結合した抗体をストリッピングします。
2. ストリッピングバッファーからメンブレンを取り除き、TBSTwで短時間すすぎ、残留ストリッピング溶液を除去します。
3. メンブレンをブロッキングバッファーに浸し、30分間穏やかに揺らします。
4. ブロッキングバッファーに一次抗体の新しい溶液を所望の濃度で作ります。
5. 新しい一次抗体希釈液をメンブレンに加え、4°Cで一晩穏やかに揺らしながらインキュベートします。
6. 手順 6.3 以降に進みます。メンブレンは剥がし、さらに最大3回まで再プローブすることができます。

結果

免疫ブロッティングプロトコルの効率を実証するために、3種類のX.laevisサンプル(ステージVI卵母細胞、ステージ7胚(胞胚)、およびステージ10.5胚(原腸胚))でアフィニティータグ付きおよび内因性翻訳対照タンパク質を分析しました。これらの段階が選択されたのは、それらが中央胞胚移行(ステージ8.5)にまたがっているためであり、これは堅牢な接合転写の始まりを示しています^13,14。胞胚移行中期前の発達は転写の非存在下で起こるため、接合前(すなわち母体制御)胚は、正しい時間的および空間的分解能で細胞運命タンパク質を発現するために翻訳制御メカニズムに大きく依存しています¹⁵。したがって、胞胚の中間移行は、RNAとタンパク質の相互作用を研究するための重要なコンテキストです。

免疫ブロッティングによるタンパク質発現を分析するために、X. laevis 卵母細胞と胚に、X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) の C 末端半分をコードする 500 pg の mRNA を 3x 赤血球凝集素 (HA) アフィニティータグに融合させました。Bicc1の分析は、アフリカツメガエルの生物学およびタンパク質とRNAの相互作用との関連性から選択しました。Bicc1は、初期胚の細胞運命の決定を導くmRNA結合タンパク質および翻訳リプレッサーです16,17,18。発達の後半では、左右のパターン^{化 19、20、21} と腎臓を含む臓器の機能^{22、23、24、25} に影響を与えます。Bicc1には、翻訳抑制^{5および特定の}mRNA^への結合を媒介するhnRNP K相同性(KH)ドメインを指示する領域が含まれています5,26,27,28。

抽出物は、5つのHA-Bicc1を注入した卵母細胞または胚から、対応する未注入サンプルをネガティブコントロールとして調製しました。各抽出物の10分の1を4〜12%勾配のビストリスゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に湿潤転写しました。総タンパク質を検出するための膜のポンソー染色により、転移の成功が確認されました(図3A)。私たちの研究の一環として、ヒトBicc1タンパク質のC末端の半分を認識する抗体をウサギで生成しました。この抗体は、内因性および外因性の Xl-Bicc1タンパク質を検出するために使用されました(図3B)。以前の研究では、Bicc1タンパク質は X.laevis 卵母細胞には存在しないが、接合ゲノムが活性化する前に、MBT前の胚で発現することが示されました¹⁶。これは、Bicc1 mRNAが卵形成中に蓄積する一方で、翻訳的に抑制されていることを示唆しています。この以前の研究と一致して、内因性Bicc1は卵母細胞では検出されませんでした。対照的に、抗体はステージ7胚と10.5胚の両方で内因性Bicc1(~MW 107 kDa)を認識しました。まとめると、これらの結果は、抗体が内因性Bicc1タンパク質を認識することを検証します(図3B、上部パネル、赤い矢印)。Bicc1抗体は、mRNA注入サンプルから調製した抽出物で約70 kDaの小さなタンパク質を認識しました(図3B、上部パネル、黒い矢印、レーン2、4、および6をレーン1、3、および5と比較)。Bicc1抗体の特異性のコントロールとして、メンブレンを剥がし、HAアフィニティータグに対する抗体で再プローブしました。HA抗体は、注入されたサンプル中の70 kDaタンパク質を同定しましたが、内因性Bicc1は認識しませんでした(図3B、2番目のパネル、黒い矢印)。HA-Bicc1 C-termの検出は、異なる細胞型で注入されたmRNAからのタンパク質発現の違いにより、段階間で強度が異なります。

次に、Bicc1と相互作用する内因性翻訳調節タンパク質の発現をテストすることで、結果を拡張しました。まず、大きな足場タンパク質であり、Ccr4-Not デデニラーゼ(CNOT)複合体の一部であるCcr4-Not Transcription Complex Subunit 1(Cnot1)の発現を解析しました。マルチサブユニットCNOT複合体は、主要な真核生物のデデニラーゼの1つであり、主にメッセンジャーmRNAの分解の前奏曲としてメッセンジャーmRNAの末端にあるポリ(A)テールをトリミングすることで知られています。しかし、この複合体は、デデニル化²⁹を超えて広がる翻訳制御において多様な役割を果たします。mRNA調節に対するCNOT複合体の重要性と、Cnot1がBicc1と相互作用するという以前の観察により、Cnot1発現のアッセイに興味がありました^20,30。Cnot1の発現を解析するために、内因性のCnot1タンパク質を認識する抗体を使用しました。各サンプルで250 kDaと270 kDaの2つのタンパク質、つまりCnot1の予測サイズを同定しました(図3B、3番目のパネル)。したがって、このプロトコルにより、調節複合体の重要な構成要素を容易に特定できます。さらに、このデータは、高分子量タンパク質を正常に同定するプロトコルの能力を裏付けています。

これらの結果の一般化可能性をさらにテストするために、次に、翻訳抑制に関与する顕著なデッドボックスヘリカーゼであるデッドボックスヘリカーゼ6(Ddx6、以前はアフリカツメガエルではxp54、ショウジョウバエではme31bとして知られていました)の存在についてサンプルを分析しました。Ddx6はリボ核タンパク質顆粒の重要な成分であり、mRNA貯蔵に関与し、Bicc1およびCnot1と相互作用します6,31,32。内因性Ddx6を認識する抗体は、各サンプルで約54 kDaのタンパク質を同定しました(図3B、4番目のパネル)。発現は^、以前に報告されたように、接合胚で減少した(図3B、レーン5および6を1〜4に比較する)。

最後に、サンプル間で観察された違いが発現の違いによるものであることを確認するために、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh)酵素を認識する抗体で免疫ブロットを剥離し、再プローブしました。Gapdhは、ユビキタスに表現された「ロードコントロール」として機能します。同等レベルのGapdh発現は、ポンソー染色を裏付けています:同量の総タンパク質がサンプル全体で分析されています(図3B、5番目のパネル)。

これらの結果を総合すると、この免疫ブロット法の有効性が確認されます。RNAとタンパク質の相互作用の研究に関連する複数の X.laevis 発生段階にわたって外因性および内因性Bicc1を特定することができました:母体が沈着したmRNAのみを含む卵母細胞とMBT前胚、および接合転写されたmRNAも含むMBT後の胚。これらの結果は、さまざまな分子量(Bicc1、Cnot1、Ddx6)およびローディングコントロール(Gapdh)での複数の翻訳制御タンパク質の発現を解析することにより一般化することができました。また、このプロトコルは、X .トロピカリス 胚に、その小さなサイズを説明するために使用される材料の量を増やすために変更を加えて使用できることも示しています(補足図1)。

図3: X. laevisのイムノブロッティングによる翻訳調節タンパク質のレベル同定。 (A)X . laevis ステージVI卵母細胞、ステージ7胚、およびステージ10.5胚からの総タンパク質を同定するための免疫ブロットのポンソー染色。各レーンは、抽出物(0.5個の卵母細胞または胚)から調製されたタンパク質の10%を表します。(B)ステージVI卵母細胞、ステージ7胚、およびステージ10.5胚における選択された X.laevis 翻訳調節タンパク質の免疫ブロット分析。レーン2、4、および6は、分析前にHA-Bicc1 mRNAをマイクロインジェクションしたサンプルに対応し、レーン1、3、および5はネガティブ(未注入)コントロールとして機能します。α-Bicc1抗体を使用して、ステージ全体で内因性Bicc1の発現をアッセイしました(トップパネル)。続いてブロットを剥がし、α-Bicc1抗体特異性のコントロールとしてHAアフィニティータグに対する抗体で再プローブしました(2番目のパネル)。ブロットを剥がし、α-Cnot1(3番目のパネル)とα-Ddx6(4番目のパネル)を使用して追加の調節タンパク質を再プローブしました。α-Gapdh(下パネル)は、タンパク質負荷を均等にするためのコントロールとして機能しました。赤い矢印は内因性Bicc1の位置を示し、黒い矢印は外因性に発現したHA-Bicc1 Cターの位置を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1: アフリカツメガエル とアフリカツ メガエルのBicc1タンパク質の免疫ブロット分析。 α-Bicc1抗体を使用して、異なる量の X.laevis および X.tropicalis 胚抽出物にわたる内因性および外因性Bicc1の発現をアッセイしました。レーン1:0.5の未注射の X.laevis 胚。レーン2:0.5 HA-Bicc1注射された X.laevis 胚。レーン3:3つの注射されていない X.トロピカリス 胚。レーン4:1個の未注射の X.トロピカリス 胚。レーン5:0.5未注射の X.トロピカリス 胚。内因性Bicc1を認識する2つの抗体を使用し、1つはヒトBicc1に対して産生され(上のパネル)、もう1つは X.laevis Bicc1(中央のパネル)に対して産生されました。α-Gapdh(下のパネル)を使用して、タンパク質負荷が均等であることを制御しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

イムノブロッティングは概念は単純ですが、数日間にわたる複数のステップがあるため、実際には困難です。そのため、一貫した高品質の結果を達成することは、多くの場合困難です。それにもかかわらず、イムノブロッティングは現代生物学の重要かつ遍在する要素です。たとえば、免疫ブロッティングは、 X. laevis 卵母細胞および胚におけるマイクロインジェクションされた mRNA の翻訳と発現の成功を確認するために重要であり、 X. laevis 研究におけるその重要性が強調されています。さらに、免疫沈降実験では、免疫ブロッティングを利用して in vivo タンパク質間相互作用を分析します。特定のタンパク質の効率的な検出は、その存在量と抗体検出試薬の品質に大きく依存します。この研究では、分析した内因性タンパク質の推定濃度は、 アフリカツメガエル の卵でほぼ500倍の範囲でした(Bicc1:37.22 nM、Cnot1:115.08 nM、Ddx6:980.55 nM、Gapdh:17,907.26 nM)³⁴、しかし、すべて容易に検出されました。この範囲を下回ると、必要に応じて、サンプル収集からイメージングまで、イムノブロットのほぼすべてのステップでワークフローを変更して、検出の精度と効率を向上させることができます。

どのタイプのSDS-PAGEゲルとメンブレンを使用するかは、イムノブロッティング実験の主要な考慮事項です。私たちの経験では、プレキャストゲルは社内で製造されたゲルよりも簡単で再現性があります。プレキャストゲルには、ゲルのポリアクリルアミド濃度が上から下に徐々に増加するグラジエント形式で利用できるという追加の利点があります。グラジエントゲルを使用すると、研究者は分子量が大きく異なる幅広いタンパク質を分離および分析できます。そうすることで、高分子量タンパク質を分解する低アクリルアミドの割合のゲル(<7%)と、低分子量タンパク質の分解に適した高の割合のゲル(>12%)を選択することの間の典型的なトレードオフを回避できます。タンパク質の転写にニトロセルロースとポリフッ化ビニリデン (PVDF) のどちらを使用するかを検討することも重要です。各膜タイプのメカニズムと利点については、広く議論されています^35,36。つまり、PVDFはニトロセルロース膜よりもタンパク質結合能が高く(したがって感度が高い)、繰り返し使用しても耐久性があります。ただし、PVDF はメタノール インキュベーションによる活性化という形で追加の取り扱いが必要であり、より高価です。どちらの膜もほとんどの用途に適していることがわかりましたが、コストを考慮してニトロセルロースを日常的に使用しています。

イムノブロットのイメージングは、プロトコルの重要な要素です。このステップでは、研究者は、必要な情報をすべて伝えながらバックグラウンドノイズを最小限に抑えた免疫ブロットの画像をキャプチャするために判断を下す必要があります。標準的なHRP結合抗体には、X線フィルムまたはデジタルイメージングシステムの2つの主なイメージング方法があります。私たちの経験では、X線フィルムで画像をキャプチャすることには多くの利点があります。一般に、X 線フィルムはデジタル イメージング システムよりもはるかに感度が高く、存在量の少ないタンパク質の検出が容易です。X線フィルムは、高解像度で注釈を付けたりデジタル化したりできる実験の物理的記録も生成します。ただし、デジタルイメージングシステムは、フィルム現像機よりもはるかに優れた線形範囲(信号強度と画像強度の関係)を持ちます。X 線フィルムは感度が高いため、すぐに露出オーバーになり、定量的な情報が失われる可能性があります。したがって、結果の正確な定量を求める研究者は、デジタルイメージングシステムを使用するか、X線フィルムで発生中のイムノブロットを露出しすぎないように特別な注意を払う必要があります。

イメージング時にかすかなまたは「ぼやけた」バンドなど、概説したプロトコルに従った後、免疫ブロッティングの結果が満足のいくものでない場合は、結果を改善するために複数の調整を行うことができます。たとえば、分析する アフリカツメガエル タンパク質混合物の量を調整できます。胚のわずか5分の1からの総タンパク質は強力な結果を生み出すことができますが、ゲルレーンごとに最大2つの胚または卵母細胞をロードすることは可能です。タンパク質の負荷が多すぎると、イメージング中にアーティファクトや偽の高バックグラウンド信号が発生する可能性があります。さらに、より低い電圧(100 V)でより長い実行時間で電気泳動を行うと、一般にタンパク質バンドがより鮮明になります。同様に、タンパク質転写を100Vで1時間ではなく、低電圧(30V)で4°Cで一晩行うと、特に高分子量種の場合、タンパク質の検出が改善される可能性があります。最後に、一部の一次抗体インキュベーションでは、4°Cで一晩インキュベートするのではなく、室温で1時間のインキュベーションを使用して、より確実にターゲットを検出します。このプロトコルの変更は、一次抗体ごとにテストする必要があります。

内因性タンパク質を検出する抗体の同定は、アフリカツメガエルの免疫ブロッティングにとって大きな課題となります。研究者は、Xenbase³⁷ (https://www.xenbase.org/xenbase/)、Developmental Studies Hybridoma Bank (https://dshb.biology.uiowa.edu/)、European Xenopus Resource Centre (https://xenopusresource.org/) などのアフリカツメガエル抗体の非商業的な供給源から恩恵を受けることができます。あるいは、ヒトまたはマウスのタンパク質を認識するために生成された抗体は、抗体産生に使用される領域の保存に応じて、相同アフリカツメガエルタンパク質の検出に有用である可能性があります。例えば、このプロトコルで提示されたBicc1抗体は、ヒトBicc1タンパク質に対して産生された。このような試薬の場合、アフリカツメガエルタンパク質との交差反応能力は経験的に決定されなければなりません。企業が抗体の作成に使用する正確なエピトープは一般的に独自のものですが、多くの企業は要求に応じてエピトープのアミノ酸範囲を提供します。この領域は、相同アフリカツメガエルタンパク質の対応する領域と整列させることができます。成功は保証されていませんが、標的種の抗体産生に使用されるエピトープがアフリカツメガエルの同等の配列と少なくとも75%以上の類似性を示す場合、通常成功しています。抗体の不適切な検証は再現不可能な研究の主な原因であるため、非アフリカツメガエルタンパク質に対して生成された抗体は、広範囲に使用する前に検証する必要があります^38,39。これは、mRNAマイクロインジェクション⁴⁰を介して、目的のタグ付きアフリカツメガエルタンパク質を胚に発現させることによって行うことができる。次に、アフィニティータグに対する抗体を使用して同じサンプルを分析して、内因性タンパク質に対する抗体とタグ付きタンパク質に対する抗体の両方が同じ実体を認識することを確認します(図3Bを参照)。

RNA結合タンパク質、特にBicc1などの調節機能を持つタンパク質の分析は、試薬が不足し、通常、強力な調節分子の発現が低いため、困難であることが判明する可能性があります。この問題は、各試薬を個別に最適化する必要があり、十分な特異性と感度の抗体を見つけることが困難な場合があるイムノブロッティングでより顕著になります。このプロトコルの意図は、 アフリカツメガエル における免疫ブロッティングの特定の制限に対処し、研究者がRNA結合タンパク質の分析の困難を克服できるように、他のシステムに適用できる手順を詳しく説明することです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100平方フィート ヘビーデューティプレミアムラップ	サラン	2570000130
10倍細胞溶解バッファー	細胞シグナル伝達技術	#9803
2-メルカプトエタノール	シグマ・オルドリッチ	M3148
2クォート長方形ベーキング/サービングディッシュ	パイレックス	71160010116
2x Laemmli サンプルバッファ	バイオ・ラッド	#1610737
抗HA高親和性抗体	ロシュ	11867423001	指示通りに調製し、1:10,000希釈で使用。
抗ウサギIgG、HRP連結抗体	細胞シグナル伝達技術	7074S	1:30,000の希釈で使用。
オートレントグラフィーカセット、5 x 7インチ	リサーチプロダクツ・インターナショナル	420057	デジタルイメージングシステムを使う場合は必須ではありません。
ベルアート使い捨てペストル	ミリポール・シグマ	BAF199230001
Bicaudal-C(ヒト)ウサギ抗体	エンヴィゴ・バイオプロダクツ(現イノティブ)	該当なし	特注品です。1:20,000の希釈で使用。
ビカウダルC(ツメガエル)ウサギ抗体	エンヴィゴ・バイオプロダクツ(現イノティブ)	該当なし	特注品です。1:20,000の希釈で使用。参考文献:パークら、2016年
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A3294	ブロッキングバッファーとして無脂肪ミルクの代替品です。
遠心分離機5425	エッペンドルフ	13-864-456
CL-Xオフシュア・フィルム	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	34091	デジタルイメージングシステムを使う場合は必須ではありません。
CNOT1(D5M1K)ウサギモノクローナル抗体	細胞シグナル伝達技術	#44613	1:2,000希釈で使用。
DDX6/RCK (D26C11) ウサギモノクローナル抗体	細胞シグナル伝達技術	#8988	1:5,000希釈で使用。
E-Zストア&ポアデベロッパー	MXRイメージング	103633	デジタルイメージングシステムを使う場合は必須ではありません。
E-Zストアとポアフィクサー	MXRイメージング	114511	デジタルイメージングシステムを使う場合は必須ではありません。
GAPDH モノクローナル抗体	プロテインテック	60004-1-Ig	1:40,000希釈で使用。
ジェルリリース	バイオ・ラッド	#1653320
ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、HRP	インビトロジェン	A16066	指示通りに調製し、1:40,000の希釈で使用。
アイスパック、8オンス、5×3×1"	ウリネ	S-18256
L-システイン	シグマ・オルドリッチ	C7352
医療用フィルムプロセッサー	コニカミノルタ	SRX-101A	デジタルイメージングシステムを使う場合は必須ではありません。
ミニプロテアン カセット開閉レバー	バイオ・ラッド	#4560000
ミニプロテアン テトラ垂直電気泳動セル	バイオ・ラッド	#1658004
MSE PRO 700ml ウェスタンブロット電気泳動タンク	MSEサプライズ	BB2369
ニトロセルロース膜、0.45および微量;m	バイオ・ラッド	#1620115
無脂肪ドライミルク	サナラック	1570000180
ペルオキシダーゼ アフィニピュアヤギ抗ネズミ IgG(H+L)	ジャクソン免疫研究	112-035-003	指示通りに調製し、1:100,000の希釈で使用。
ポリソルベート(トゥイーン)20	フィッシャー・バイオリエージェント	BP337-500
ポンソー S	VWRライフサイエンス	K793-500ML	ポンソーS0.5%、酢酸1%で近似的に計算できます
パワーパック基本電源	バイオ・ラッド	1645050
PR1MA 可変速度2Dロッカー	中等科学	R2D-30
Precision Plus Protein デュアルカラースタンダードラダー	バイオ・ラッド	#1610374	どのタンパク質ラダーでも使えます。
純セルロースクロマトグラフィーフィルターペーパー、0.35 mm	フィッシャー・サイエンティフィック	05-714-4
ウェスタンブロットストリッピングバッファーの復元	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	#21059
塩化ナトリウム	フィッシャー・ケミカル	S640-10
ストレージボックス 300 mL	ロスティ・メパール	RST46608	ニトロセルロース膜遮断、抗体培養、洗浄のために
SuperSignal West フェムト最大感度基板	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	#34094	ルミノールとエンハンサーの2成分を含む強化化学発光(ECL)基板です。このECL試薬はフェムトグラム感度が低いです。
SuperSignal West Pico PLUS 化学発光基板	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	#34580	ルミノールとエンハンサーの2成分を含む強化化学発光(ECL)基板です。このECL試薬はピコグラムからフェムトグラムの感度を持ちます。
SurePAGE、Bis-Tris、10 x 8、4–12%、10ウェルポリアクリルアミドゲル	ジェンスクリプト	M00652
転射バッファー粉末	ジェンスクリプト	M00652
トリス・ベース・ウルトラピュア	USBiological	77-86-1
Tris-MOPS-SDS ランニングバッファーパウダー	ジェンスクリプト	M00138