マウス心臓組織からのエンドソーム単離と心筋細胞との共培養の革新的な方法

サマリー

エンドソームは、エンドサイトーシス膜輸送経路の一部である細胞内選別細胞小器官の集合体です。私たちは、自動ナノろ過装置を用いて心臓組織からエンドソームを単離する新しい方法を確立し、エンドソームを初代心筋細胞と共培養することにより、エンドソームの細胞取り込みを調べました。

要約

エンドソームは、細胞内輸送、シグナル伝達、膜リサイクルにおいて重要な役割を果たす膜結合細胞小器官です。心血管生物学におけるエンドソームの機能は認識されつつありますが、心臓組織からのエンドソームの効率的な単離は依然として重大な技術的課題です。細胞内分画と超高速ナノろ過単離プラットフォームを組み合わせることにより、マウス心臓組織からエンドソームを単離するための迅速かつ高収率のプロトコルを開発しました。この方法には、逐次遠心分離、ナノろ過、および小胞のナノ多孔質膜ベースの回収が含まれます。単離されたエンドソームは、ウェスタンブロッティング、動的光散乱(DLS)、およびナノフローサイトメトリー(NanoFCM)分析によって特徴付けられました。生物活性を評価するために、精製されたエンドソームを初代新生児心筋細胞と共培養しました。エンドソームマーカーEEA1およびRab7は、単離された小胞に高度に濃縮されていました。DLS分析により、平均小胞直径は187.30 ± 23.42 nm、ゼータ電位は-26.60 ± 5.79 mV(n = 12)であることが明らかになりました。NanoFCM定量により、100 mgの心臓組織から約1.07 ± 0.31 × 10¹² 粒子/mL(n = 12)が得られました。in vitro 共培養後に心筋細胞によるエンドソームの機能的取り込みが観察され、小胞の完全性と活性の保存が示されました。この統合された単離プラットフォームは、心臓組織から高純度のエンドソームを抽出するための再現性のある効率的な方法を提供します。このプロトコルは、下流の生化学的および機能的研究を促進し、心血管生理学および疾患におけるエンドソームの役割を調査するための貴重なツールを提供します。

概要

エンドソームは、エンドサイトーシス、貨物の選別、およびシグナル伝達^経路を調節する必須の細胞内細胞小器官です^1,2。活性化されたシグナル伝達受容体およびその他のダウンレギュレーションされたタンパク質は、最初に初期エンドソーム (EE) 内の内腔内小胞 (ILV) に分類され、その後、多小胞体 (MVB) またはエンドソームキャリア小胞 (ECV) に成熟します。これらの小胞はその後、後期エンドソーム (LE) と融合し、貨物をリソソーム分解または代替経路に誘導するための二次選別ハブとして機能します。ILVは、原形質膜とのエンドソーム融合後にエクソソームとして分泌されることもあります^3,4。並行して、オートファジー経路はオートファゴソームを介して細胞質ゾル物質をLEに送達し、オートファゴソームは後期エンドサイトーシスコンパートメントと融合すると分解能力を獲得し^ます5。エンドソームは現在、ニューロンや心筋細胞などの特殊な細胞に特に関連する受容体のリサイクル⁶、イオンチャネル局在⁷、エクソソーム生合成⁸、および細胞間コミュニケーション⁹ プロセスの重要な調節因子として認識されています。

新たな証拠により、心血管機能におけるエンドソーム経路の極めて重要な役割が浮き彫りになっています。Eps15相同性ドメインタンパク質3(EHD3)は、Na⁺/Ca²⁺ 交換体やL型Ca²⁺ チャネルなど、主要な心臓イオントランスポーターのエンドソームリサイクルを調節します。マウスのEHD3欠損は徐脈、伝導異常、およびCa²⁺ 処理の変化を引き起こします¹⁰。血管平滑筋細胞における機能的エンドソーム-リソソーム輸送は、慢性腎臓病およびアテローム性動脈硬化症に関連するリン酸塩誘発性内側石灰化を防ぎます¹¹。それにもかかわらず、心血管疾患におけるエンドソームの機能的役割と治療標的としての可能性は依然として完全には理解されておらず、さらなる調査が必要です。

複数の方法により、機能的に無傷のエンドソームの生化学的単離が可能になりました。Marshらはまず、密度勾配遠心分離とフリーフロー電気泳動を組み合わせて、初期および後期エンドソームを回収し、酸性化と構造的完全性を維持しました¹²。スクロース勾配アプローチなどの最近の方法論は、下流のプロテオミクスおよびリピドミクス研究に不可欠な、初期および後期のエンドソーム集団を分離するための標準化されたルートを提供します¹³。スピンカラムベースの市販キットは、ハイスループットアプリケーション向けに開発されました。

自動超高速分離システムによるエクソソーム単離は、革新的な超音波ナノろ過技術を利用しており、周期的な負圧振動と二重結合高調波振動を統合した二重膜ナノろ過システムを備えており、生体液から高純度のエクソソームを分離することができます¹⁴。ここでは、自動超高速単離システムを用いた細胞内分画とエンドソーム単離を組み合わせ、マウス心臓組織から高収率・高純度でエンドソームを迅速に単離する新しい方法を実現しました。

さらに、抽出したエンドソームを初代心筋細胞(CM)とin vitroで共培養したところ、外因性エンドソームがCMにうまく入ることがわかりました。エンドソームに局在したタンパク質NumbをmCherry赤色蛍光タンパク質^15,16と融合させたエンドソームレポーターを用いて、mCherry蛍光が点状パターンでCM内に局在することを観察しました。

プロトコル

すべての動物実験は、実験動物の使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従って、ヒューストン大学の施設動物管理および使用委員会の承認を得て実施されました。

注:単離手順を開始する前に、必要なすべてのバッファーが新たに調製され、4°Cに冷却されていることを確認することが重要です。 滅菌された器具、組織培養プレート、および適切なチューブは、特に指定がない限り、すべての材料を氷上または4°Cに維持して、指定されたワークステーションに配置する必要があります。遠心分離機とローターは、使用前に最低2〜3時間、4°Cに事前に平衡化する必要があります。分画バッファーは、実験当日の前に調製し、4°Cで保存し、実験中は必要になるまで氷上に保管する必要があります。特に明記されていない限り、すべてのインキュベーションおよび遠心分離ステップは4°Cで行う必要があります。

1.心臓溶解物の調製

1. 70%エタノールを使用して手術領域を消毒し、続いて滅菌された手術器具を配置した作業面に滅菌吸収パッドを配置します。
2. マウス(C57BL / 6雄、8〜12週間、20〜25 g、およびmCherry:NumbKI雄、8〜12週、20〜25 g)をCO₂ 吸入(10〜30%CO₂ で3〜5分間)または関連する施設の動物管理および使用委員会によって承認された代替方法によって。
   注意: 漏れを防ぐために、オープンスペースで操作し、_CO2 シリンダーが時間内に閉じるようにしてください。安楽死中は、意識喪失と適切な処置を確認するためにマウスを監視する必要があります。意識を失ったら、子宮頸部脱臼、開胸術、失血などの二次的な方法を使用して死を確実にします。
3. マウスを仰臥位に置き、胸部を70%エタノールで洗浄します。
   1. 胸腔を素早く開いて心臓を採取し、氷の上に置いた60mmの皿に入れた氷冷のハンクバランスソルト溶液(HBSS)に心臓を移します。
   2. ピンセットを使用して心腔から残留血液をそっと取り除き、心腔に血液が残らなくなるまで心臓をよく洗います。処理中は心臓を氷の上に置いてください。
      注:ウェスタンブロット(WB)分析用に50〜100 mgの心臓組織をポジティブコントロールとして保存します。心臓は液体窒素で急速凍結し、-80°Cで最大6か月間保存できます。
4. 8 mLの分別バッファー(表1)を氷上の50 mLチューブに加えます。100〜120 mgの新鮮または凍結マウス心臓組織を、分画バッファーを含むチューブに移します。
   注:マウス心臓組織の任意の部分を使用してエンドソームを抽出できます。その後の分析に十分なエンドソームを生成するには、最低 100 mg の心臓組織が必要です。実験グループ間で一貫性を確保するために、分画バッファーに添加する前に組織を正確に計量する必要があります。
   注意: 分別バッファーを操作するときは、身体との直接接触を避けるために、適切なPPEを着用してください。
5. 常に氷上の分画バッファーで顕微手術用ハサミを使用して、組織を約^{1 mmの} 3個にみじん切りにします。
6. 電気ホモジナイザーで中速で均質化し、40秒の作業で30秒の停止サイクルで均質化します。5〜7サイクル均質化します(図1A)。
   注:徹底的な均質化プロセスが不可欠であり、エンドソームの最終濃度を高めるのに役立ちます。
7. 均質化された心臓溶解物を超音波浴で氷水浴中で10分間超音波処理します(図1A)。

2.細胞内分画

1. 40 μmの細胞ストレーナーを50 mLの遠心分離チューブの上に置き、均質化された心臓溶解物をストレーナーを通してろ過します(図1A)。
2. 核ペレットの場合:心臓溶解物を1,000 × gで4°Cで5分間遠心分離します。 上清を移し、新しい標識チューブに入れます。
   注:核画分であるペレットを回収し、核画分がWBに必要な場合は、核ペレットを200 μL WB Lysis Bufferに再懸濁します。放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーで核ペレットを上下に20回静かにピペットし、10分間超音波処理します。核溶解物を14,000 × gで10分間遠心分離します。上清を回収し、-80°Cで保存してさらに使用します。ステップ 2.2 はオプションです。小胞のみが必要な場合はスキップできます。
3. ミトコンドリア画分の場合:上清を10,000 × gで4°Cで10分間再度遠心分離します。 ペレットにはミトコンドリア画分が含まれています。上清を移し、新鮮な超遠心分離チューブに入れます。
   注:WBにミトコンドリア画分が必要な場合は、前の注で説明したように、ペレットをステップ2.2として保存します。
4. チューブのバランスを慎重に調整します。各チューブの重量を量り、軽いチューブに冷間分別バッファーを追加して、同じ重量を確保します。超遠心分離機のローターとアダプターを4°Cで2〜3時間予冷します。 上清を160,000 × gで4°Cで30分間超遠心分離します。
   注:超遠心分離ステップでは、すべての超遠心チューブのバランスが適切に取れ、リムの約0.5〜1 cm下までバッファーで満たされていることを確認することが重要です。充填が不十分な場合、高い遠心力が加えられ、チューブが変形したり崩壊したりする可能性があります。
5. 上清を新しいチューブに取り出します。上清にはエンドソームが含まれています。50 mL遠心分離チューブの上に0.45 μmのシリンジフィルターに取り付けられた10 mLシリンジをセットアップし、上清をチューブにろ過します。滅菌PBSバッファーを5 mL加えて溶液を希釈し、フィルターの目詰まりを防ぎます。
   注:フィルタリングステップは、単離ステップを開始するときに、上清内のすべてのエンドソームが<450 nmであることを保証します。
6. ステップ2.4の滅菌PBSバッファー5 mLでペレットを再懸濁し、ペレットをよく混合するために少なくとも20回上下にピペットを動かします。ペレットには他の細胞内小胞が含まれています。50 mL遠心分離チューブの上に0.45 μmシリンジフィルターに取り付けられた10 mLシリンジをセットアップし、ペレット溶液をチューブにろ過します。さらに5 mLの滅菌PBSバッファーを追加して、溶液を希釈し、フィルターの目詰まりを防ぎます。
   注:フィルタリングステップは、単離ステップを開始するときにペレットからのすべての小胞が<450 nmであることを保証します。

3. エンドソームおよびその他の細胞内小胞の単離プロセス

1. ステップ2.5のろ過した上清とステップ2.6のろ過したペレット溶液を滅菌PBSバッファーでそれぞれ50 mLチューブで30 mLの最終容量に希釈します。サンプルを4°Cで保存します(図1A)。
   注:サンプルは4°Cで24時間保存できます。同じ日に次の手順を実行するのに十分な時間がない場合は、4°Cの冷蔵庫に保管し、翌日待って実験を続けることができます。
2. 機器の電源を入れ、通常20分かかる毎日のクリーニングプログラムを開始します。
3. 分離には、ミディアムEXODUS分離装置(M EID)を選択します。50 mLチューブアダプターを取り付け、サンプルの入った50 mLチューブをサンプルの位置に入れます。画面上の EID をタップし、 M EIDをロードします。
   注:培地EIDは20〜50 mLのサンプル用で、30 mLを推奨します。
4. プログラムをセットアップします。
   1. サンプル名とサンプル容量を入力します。
   2. サンプルタイプを選択します: プラズマ。
   3. プログラムの選択: プラズマ。ストロング-マサチューセッツ州。答え03.
   4. 遠心分離管を選択します: 50 mL。
   5. 高純度モードをオンにします。
   6. プログラムオプション3000を選択します。
   7. [ OK ] をタップして開始します。
      注:分離プロセス全体が完了するまでに1〜2時間かかります。サンプルの濃度が高いほど、時間がかかります。
5. エンドソームおよび他の細胞内小胞を回収します。
   1. EIDを取り出し、次の手順のためにボンネットに持っていきます。
   2. 200 μLの滅菌PBSバッファーを200 μLピペットでEIDに移します。ナノ多孔質膜の両面をそれぞれ20回すすぎます。
   3. エンドソームまたは他の細胞内小胞を収集し、1.5 mLチューブに200 μLで再懸濁します。24〜48時間使用する場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで保管してください。
      注:溶出液はエンドソームまたは他の細胞内小胞を含み、さらなる分析および心筋細胞との共培養に使用されます。得られたデータに基づいて、エンドソームのサンプルは、-80°Cで5か月間保存すると安定しています。
6. WBのエンドソームおよびその他の細胞内小胞を溶出します。
   1. EIDを取得します。80 μLのWB溶解バッファーをEIDに移します。ナノ多孔質膜の両面をそれぞれ20回すすぎます。
   2. EIDを氷上で30分間インキュベートして完全に可溶化し、10分ごとにEID内にバッファーをピペットします。エンドソームまたは他の細胞内小胞溶解物を1.5mLチューブに集めます。4°Cで14,000 × gで10分間遠心分離します。 上清を回収して-80°Cで保存し、長期保存します。チューブ内にペレットが残っている場合は、ペレットを廃棄します。

4. エンドソームタンパク質の定量と小胞の特性評価

1. ウェスタンブロット分析
   1. 各サンプルから5 μLを節約し、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用してタンパク質濃度を定量します。
   2. サンプルを4×Laemmliサンプルバッファーで希釈し、ボルテックスで完全に混合します。サンプルを95°Cで10分間加熱して、タンパク質を変性させます。
   3. 変性サンプルを14,000 × gで4°Cで10分間遠心分離し、得られた上清を分析のために収集します。
   4. 電気泳動装置でポリアクリルアミドゲルを組み立て、チャンバーにドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ランニングバッファーを充填します。
   5. 分子量マーカーと調製したタンパク質サンプルをゲルにロードし、ターゲットタンパク質の分子量に基づいて適切なアクリルアミドの割合を選択します。
      注:通常、心臓組織溶解物とエンドソーム溶解物の両方に対して、ウェルあたり20μgのタンパク質がロードされます。
   6. ゲルを6Vで約120分間、または色素の前面がゲルの底に達するまで実行します。
   7. ウェスタンブロッティング転写システムを用いて、ゲルからポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜への蛋白質の転写
      注:湿式転写法もうまく機能します。
   8. PVDFメンブレンを0.05%トゥイーン-20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水で短時間すすぎます。
   9. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加したTBSTで膜を室温で1時間ブロックします。
   10. 選択したエンドソームマーカーに特異的な一次抗体(材料表)とともに、穏やかにロッキングして、メンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。
   11. 翌日、メンブレンをTBSTで3回洗浄し、各洗浄をロッカーの室温で10分間持続させます。
       注:非特異的バックグラウンドを減らすには、適切な洗浄が不可欠です。プロセス全体を通じてメンブレンが完全に水分を補給したままであることを確認してください。
   12. メンブレンを適切な二次抗体( 材料表)とともに室温で1時間インキュベートする。
   13. メンブレンをTBSTで3回洗浄し、各洗浄は室温のロッカーで10分間持続します。
   14. 抗体結合タンパク質を検出するために、化学発光基質を膜に塗布します。
   15. ゲルイメージングシステムを使用して膜を露出し、タンパク質の画像を撮影します。
2. 動的光散乱(DLS)解析
   1. エンドソームの粒子サイズとゼータ電位は、動的光散乱(DLS)技術¹⁷を使用して測定されます。Kalliopeソフトウェアバージョン2.10.4を搭載したLitesizer 500(Anton Paar)を使用。DLS測定は、25°Cで90°の検出角度を持つ658nmレーザーを使用して3回実行されます。
   2. 超純水で「サイズ標準ナノスフィア」を希釈し、使い捨てキュベットに1mL容量を加え、チャンバーに入れます。
      注:未知のサンプルの予想されるサイズに応じて、標準的なナノスフィア(小さいまたは大きい)を使用してください。
   3. DLSソフトウェアを開き、新しい測定タブをクリックします。測定モードから粒子サイズを選択します。[無題]フィールドにファイルに名前を付け、入力パラメータ(溶媒、温度など)を入力して、[開始]をクリックします。標準粒子のサイズを決定した後、チャンバーからキュベットを取り出します。
   4. 「ゼータ電位標準物質」を超純水で希釈し、ゼータ電位オメガキュベットに入れ、キュベットチャンバーに入れます。ソフトウェアの新しい測定タブをクリックします。測定モードからゼータ電位を選択します。ファイルに「無題」フィールドに名前を付け、入力パラメータ(溶媒、温度など)を入力して、「開始」をクリックします。
   5. エンドソームの粒子サイズとゼータ電位を測定するには、エンドソームサンプルを超純水で希釈し、それぞれのキュベットに入れ、キュベットチャンバーに入れます。規格に記載されているのと同じ方法で測定します。
      注:超純水中のサンプルの濃度に応じて、未知のサンプルを希釈します。
3. NanoFCM分析
   注:エンドソーム粒子濃度は、Professional Suite V2.3ソフトウェアを備えたNanoFCM Flow NanoAnalyzerを使用して測定されます¹⁸.粒子信号の取得は、0.2%のSS減衰で20 mWに設定された488 nmの青色レーザーおよび/または10%のSS減衰で8 mWに設定された638 nmの赤色レーザーを使用して、1.0 kPaのサンプリング圧力で2分間実行され、空気ベースの圧力モジュールによって変調および維持されます。サンプルは、重力供給を介してシース液としてウルトラプール水を使用して1.4μmに集束されます。最適なレーザーアライメントは、シリカナノスフィアカクテルQCビーズ(S16M-Exo)を使用してテストおよび校正されます。サイズキャリブレーション測定は、S16M-Exoサイズ標準ビーズ(直径68、91、113、および155 nmの粒子を含むシリカナノ粒子カクテルで、既知の濃度が2.17×10¹⁰/mL)です。
   1. 濃度標準取得:
      1. nanoFCMの流体工学を起動して初期化します。QCビーズを0.22 μmの膜ろ過超純水で希釈(1:100)し、0.5 mLチューブに加え、ローディングベイに入れます。[サンプル Inf] ドロップダウン メニューから [QC FL SiNP] を選択し、QC ビーズ サンプルの希釈係数を入力します。
      2. サンプル フロー ドロップダウンメニューからブーストを選択して、QC サンプルを高速で導入し、洗浄液をシステムから 45 秒間除去します。ブースト中は、レーザー出力を 488 nm 青色レーザーの場合は 20/50 mV、638 nm 赤色レーザーの場合は 20/100 mW に設定し、SS 減衰は 0.2% です。
      3. [ サンプルフロー ]ドロップダウンメニューからサンプリングを選択し、大きな信号のしきい値調整を行います。サンプリング中は、信号集光レンズのアライメントを手動で調整し、必要に応じてソフトウェアからレーザー集束レンズのアライメントを調整します。大きな信号の自動しきい値調整は、側面散乱チャネルで50〜120、両方の蛍光チャネルで75未満にとどまる必要があります。
      4. [ 記録する時間 ] をクリックして、120 秒間のデータを取得します。データを取得するときは、関心領域 (ROI) が 1500 から 15000 の間であることを確認してください。結果ファイルを「nfa」拡張子のポップアップフォルダに保存し、サンプルチューブをアンロードします。
         注:各サンプル実行後、洗浄液(1x)を使用して、処理されたサンプルを45秒間ブーストしてチューブから取り除きます。次に、キャピラリーチップを超純水に浸して、次のサンプルをロードする前にキャピラリーの外側から残留洗浄液を除去します。
   2. サイズ標準取得:
      1. 「サイズ標準ビーズ」(1:100)を0.22 μmの膜ろ過水で希釈し、ローディングベイに入れます。サンプル Inf ドロップダウン メニューから 68-155 S16M-Exo を選択し、サイズの標準ビーズ サンプルの希釈係数を入力します。
      2. [ サンプルフロー] ドロップダウンメニューから、[ブースティング]を選択してサイズの標準ビーズを導入し、45秒間システムから洗浄液を除去します。ブースト中は、レーザー出力を 488 nm 青色レーザーの場合は 8/50 mV、638 nm 赤色レーザーの場合は 20/100 mW に設定し、SS 減衰は 10% です。
      3. [サンプルフロー]ドロップダウンメニューから[サンプリング]を選択し、小さな信号のしきい値調整を行います。4つの異なるピーク(68 nm、91 nm、113 nm、155 nm)がウィンドウに表示されるはずです。[記録する時間] をクリックして、120 秒間のデータを取得します。結果ファイルをポップアップフォルダに「nfa」拡張子で保存し、サンプルチューブをアンロードします。
   3. ブランク標準取得:
      1. 超純水または(サンプルの緩衝液/希釈液)を使用して、上記と同じプロセスで測定を行い、拡張子が「nfa」のフォルダに「blank」という名前のファイルを保存し、サンプルチューブをアンロードします。
   4. エンドソームの粒子濃度の決定
      1. エンドソームサンプルを超純水で希釈し、ローディングベイに入れます。
      2. サンプルをブーストしてサンプリングした後、[ 記録時間] をクリックして測定を開始します。しきい値が側面散乱チャネルの 50-120 の範囲内にない場合、または ROI が 15,000 を超える場合は、サンプルの希釈を検討してください。
   5. データ分析:
      1. ソフトウェアの [取得] タブから[ 解析 ]タブに切り替えて、保存した「nfa」ファイルを開きます。 FL SnNPs.nfa date__QC QC結果の保存ファイルを開いて濃度標準を設定し、 しきい値設定ツールをクリックして大きな信号のしきい値を設定します。
      2. サークルゲーティングツールを使用して粒子濃度を選択します。[Count STD]をクリックし、QCビーズの濃度(2.17 ×^{10 10}/mL)を確認してから、ウィンドウを閉じます。
      3. サイズの標準を設定するには、 date_68-155 S16M-Exo.nfaファイルを開きます。サイズ ツール をクリックして標準曲線生成ウィンドウを開き、 しきい値設定ツールをクリックして小信号のしきい値を設定します。
      4. [User Defined]ドロップダウンメニューから[S16 exo 68-155 nm]を選択します。[ピークの検索] をクリックして、4 つのサイズの母集団のピーク SS 強度を特定します。
      5. 空白のファイルを選択し、[ ブランクに設定 ]をクリックして、サンプルの除去のための偽陽性の数を特定します。エンドソーム濃度を分析するには、まずサンプルを選択し、 しきい値の設定ツールをクリックして小さな信号にしきい値を設定します。定量化されたデータをサイズ(nm)と濃度(粒子/mL)のレポートとして提示します。

5.初代心筋細胞培養

注:最大50個の新生児マウスまたはラットの心臓から心筋細胞を単離するのに十分な試薬を提供する一次心筋細胞分離キットを使用して心筋細胞を単離します。このキットには、初代心筋細胞培養をサポートするのに適した成分も含まれています。細胞を乱さないように、すべての培地とバッファーは注意して除去する必要があります。1000 μLのピペットチップを使用した手動ピペッティングが推奨され、真空吸引は避けてください。ハンク平衡塩溶液(HBSS)は、手順を開始する前に4°Cに予冷する必要があります。

1. キットで入手可能な心筋細胞単離酵素 1 (パパインを含む) を 2 を追加して再構成します。1 バイアルに mL の冷却 HBSS。約5分間、または酵素が完全に溶解するまで穏やかに混合します。手順中は酵素溶液を氷の上に置いてください。
   注:再構成酵素1の1つのバイアルは、10個の新生児心臓から心筋細胞を単離するのに十分です。-20°Cで最大6ヶ月間保存でき、2回の凍結融解サイクルで安定しています。4°Cで保存する場合は、酵素活性を確保するために1週間以内に溶液を使用する必要があります。
2. 解剖したばかりの新生児心臓を個々の無菌1に入れます。微量遠心チューブをmLにし、すぐに500 μLの氷冷HBSSを各チューブに加えます。
   注:収量と再現性を最大化するために、チューブごとに1つの心臓を処理することをお勧めします。
3. 滅菌解剖ハサミを使用して、心臓組織を1mm³の断片に細かく刻みます。各サンプルを500 μLの氷冷HBSSで2回洗浄し、残留血液を除去します。
4. 各チューブに、キットに収められている再構成心筋細胞単離酵素 1 (パパイン) 200 μL と心筋細胞単離酵素 2 (サーモリシンを含む) 10 μL を加えます。チューブを穏やかに混合し、37°Cで30〜35分間インキュベートします。
   注:心筋細胞分離酵素2はHBSSの懸濁液として提供され、使用前に氷上で解凍する必要があります。サンプルに添加する前に、均一な懸濁液を確保するために、上下にピペッティングして酵素を均質化します。
5. 酵素消化後、酵素溶液を注意深く吸引し、各サンプルを500 μLの氷冷HBSSで2回洗浄します。
6. 初代細胞単離用の完全DMEMを各チューブにmL添加します。滅菌1.0 mLピペットチップを使用して上下に25〜30回ピペッティングして、組織を穏やかに粉砕します。このステップでの気泡の形成を最小限に抑えます。
   注:ピペッティングによって組織を破壊すると、細胞収量が向上します。ただし、過度のピペッティングは細胞の損傷につながる可能性があります。
7. 上清を300×gで5分間遠心分離します。
8. コンプリートDMEMをピペットで慎重に取り出します。1 mLの新鮮な完全DMEMをチューブに加え、滅菌済みの1.0 mLピペットチップを使用して上下に25〜30回ピペットします。ピペッティングの際は気泡を避けてください。
9. 組織が主に単一細胞懸濁液になった後、初代細胞単離用の完全DMEMを各チューブに0.5 mL添加し、総体積を1.5 mLにします。個々の細胞懸濁液を組み合わせて、細胞濃度と細胞生存率を測定します。

6. 心筋細胞とのエンドソームの共培養

1. 心筋細胞を60 mmの皿に播種し、コンプリートDMEMを総体積に加えます。
   注:各新生児マウス心臓は1つの皿に播種され、各ウェルの総容量は5 mLであると予想されます(図1B)。
2. 60 mmディッシュを37°Cで5%CO₂ インキュベーターで24時間インキュベートします。24時間後、培地を1000倍に希釈した心筋細胞増殖サプリメントを含む初代細胞単離用の新鮮な完全DMEMと同等の量と交換します。
3. ステップ3で生成したエンドソーム溶出液を-80°Cから-20°Cに1時間移します。次に、エンドソームを氷の上に置き、徐々に解凍します。
   注:氷上で徐々に解凍すると、エンドソームの膜がより無傷になり、劣化が軽減されます。
4. 48時間後、100 μLのエンドソーム溶出液ごとに5 mLの新鮮な完全DMEMと混合し、各皿の古い培地を交換します。エンドソームを心筋細胞と24時間共培養します。
5. 心筋細胞を2 mLの低温滅菌PBSで洗浄します。氷冷溶解バッファーを80〜100 μLの溶解バッファーとともに各ディッシュに加えます。冷たいプラスチック製のセルスクレーパーを使用して細胞をこすり落とし、細胞を1.5mLチューブに集めます。
6. 手順 4.1 で説明した WB プロトコルを実行します。
7. 免疫染色(IF)の場合は、以下に説明する手順に従います。
   1. 8ウェルチャンバースライドで心筋細胞をシードします。完成したDMEMで単一細胞懸濁液を1.5 mLから3 mLに希釈します。
   2. 各チャンバーに300 μLの懸濁液を播種します。手順 6.2 から 6.4 を繰り返します。
   3. 心筋細胞を200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で20分間固定し、200 μLの滅菌PBSで3回洗浄します。8ウェルチャンバースライドはIFの準備ができています。
      注意: 4% PFA を取り扱う場合は、適切な PPE を着用してください。使用後は、4%PFAを適切な容器に入れて廃棄してください。

結果

ステップ2.6とステップ3.6の心臓組織ライセート、核画分、ミトコンドリア画分、その他の細胞内小胞、ステップ2.5とステップ3.6のエンドソームの5つのグループで、初期エンドソーム、後期エンドソーム、リソソーム、オートファゴソームのマーカーの発現量を調べました。ウェスタンブロットの結果、EEA1(Early Endosome Antigen 1)はエンドソームで最も高い発現レベルを持ち、他のグループではほとんど発現していないことが示されました(図2A、B)。Rab7もエンドソームで最高レベルで発現し(図2A、C)、Lamp1およびLC3は他の細胞内小胞で最高レベルで発現した(図2A、D、E)。以前の複数の研究により、EEA1 が主に初期エンドソームに位置することが確認されています¹⁹

ディスカッション

この研究では、細胞内分画と超高速単離プラットフォーム¹⁴を組み合わせることにより、マウス心臓組織から高純度エンドソームを単離するための迅速かつ再現性のある方法を提示します。密度勾配遠心分離¹² や免疫単離などのエンドソーム単離のための従来のアプローチは、多くの場合、時間と労力を要し、大量の組織または特殊な抗体を必要とします。機械的均質化プロトコルとナノろ過技術を統合することにより、エンドソーム小胞の物理化学的および分子的完全性を維持しながら、単離プロセスを大幅に合理化しました。

この手順を成功させるには、いくつかの手順が重要です。組織の初期均質化と温度制御された遠心分離は、細胞小器官の完全性を維持し、小胞画分を濃縮するために不可欠です。EXODUSベースの単離ステップ¹⁴、特に膜のすすぎと小胞の溶出中に慎重な取り扱いを行うことも、回収率と純度を最大化するために重要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
µ-スライド 8 ウェルハイ	イビディ	80806-90
1.5 mL目盛り付きマイクロ遠心チューブ	USAサイエンティフィック	1615-5500
10 x トリス/グリシンバッファー	バイオラッド	1610734
4x Laemmli サンプルバッファー	バイオラッド	1610747
卓上遠心分離機	エッペンドルフ	エッペンドルフ遠心分離機 5810R
ウシ血清アルブミン	シグマ	A9418
セルストレーナー	コーニング	CLS431750	細孔径40 &ミュー;m, 滅菌
CELLSTAR組織培養皿	VWRの	82050-546	ポリスチレン、滅菌、60mm、急性;15ミリメートル
ChemiDocイメージングシステム	バイオラッド	ケミドックXRS+
洗浄液	ナノFCM	17159
Pierce初代細胞分離キット用DMEM	フィッシャーサイエンティフィック	PI88287
DTTの	フィッシャーサイエンティフィック	BP172
ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモサイエンティフィック	10010023
ECLウェスタンブロッティング検出試薬	バイオラッド	1705061
EDTAの	シグマ	E4884
EEA1	細胞シグナル伝達	3288秒	白平衡 (1:1000)
エグタ	シグマ	E-4378-25
EIDの	出エジプト記	MA03 EID
ERp72	細胞シグナル伝達	5033秒	白平衡 (1:1000)
エタノール	UHリサーチストア		200プルーフ、5ガロン
エクソダス H-600	出エジプト記	H-600型
GAPDH	プロテインテック	10494-1-APです	白平衡 (1:5000)
ハンク」平衡塩溶液(HBSS)	サーモサイエンティフィック	14175095
ヘペス	シグマ	H3375
ホモジナイザー	フィッシャーサイエンティフィック	15340167
KCl	シグマ	P3911
ランプ1	アブカム	AB320851	WB(1:2000)
LC3	細胞シグナル伝達	2775秒	白平衡 (1:1000)
Litesizer 500	アントンパール社	ライトサイザー500	Zetasizer (Malvern) や DLS  などのその他の機器。(ワイアット)を使用できます
mチェリー	ビオルビット	オーブ66657	白平衡 (1:500)
MgCl2	フィッシャーサイエンティフィック	BP214-500
NaCl	シグマ	S7653
ナノFCM	ナノFCM	フローナノアナライザー
ナノスフィアサイズ標準	サーモサイエンティフィック	3020A型
ニコンAXR共焦点顕微鏡	ニコン	AXRの
PBS中のパラホルムアルデヒド溶液4%	サンタクルーズバイオテクノロジー	SC-281692
ファロイジン標識プローブ	インビトロゲン	A22284	IF (1:500)
Pierce BCAプロテインアッセイキット	サーモサイエンティフィック	23227
Pierce初代心筋細胞分離キット	サーモサイエンティフィック	88028
ポリエーテルスルホンシリンジフィルター	ミリポール	SLHPR33RS	細孔サイズ0.45 &ミュー;m, 滅菌
プレキャストプロテインゲル	バイオラッド	4561093
QCビーズ	ナノFCM	QS2503
ラブ7	細胞シグナル伝達	9367秒	白平衡 (1:1000)
RIPA溶解および抽出バッファー	サーモサイエンティフィック	89900
ロシュ フォスストップ (PIカクテル)	ロシュ	4906837001
シリカナノスフィア	ナノFCM	S16M-エクソ
蔗糖	シグマ	84097
スイングバケットローター	ベックマン・コールター	SW55Ti
トランスブロットターボ転写システムRTA転写キット	バイオラッド	1704270
トゥイーン20	バイオラッド	1662404
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマXE-90
超遠心分離管	ベックマン・コールター	326819
超音波洗浄浴	ブランソン超音波	CPX952238R
VWR チューブセント 50 mL	VWRの	89039-656
VWRチューブ遠心分離機 15 mL	VWRの	89039-666
ゼータ電位標準物質	アントンパール社	175108