方法論記事

グリコムの質量分析を用いた空間分子イメージング

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DOI:

10.3791/69154

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2025年11月28日

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1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

この記事について

サマリー

このプロトコルは、質量分析イメージングを用いてグリコーゲンおよびN結合糖団の厳密かつ再現性のある測定を可能にするための主要なステップを詳述しています。

要約

グリコムの組織内の空間的組織構成は、生理機能の分子基盤の鍵となります。多様で動的なグリコムは、代謝、シグナル伝達、接着など基本的な細胞プロセスに不可欠です。空間生物学の革新により、多様なグリコムクラスの空間分子イメージングの新たな道が開かれました。ここでは、新鮮凍結マウス肝臓におけるグリコムの空間的生体分子イメージングのための最適化プロトコルを説明します。ワークフローは、(1) 迅速な収穫と凍結、(2) 最適な厚さと位置でのクライオスタット切片、(3) 炭水化物有効酵素を用いた組織調製および組織上酵素消化、(4) マトリックス支援レーザー脱着/イオン化質量分析イメージング(MALDI-MSI)によるマトリックス適用およびデータ取得、(5) 生物学的文脈に結びつけるためのデータ処理および可視化で構成されています。この手法を用いることで、N連結グリカンやグリコーゲンの詳細な空間マップを取得し、重要な生理学的および細胞的特徴を明らかにします。これらのデータは、肝機能や機能障害に関連する主要な空間的糖素異質性の定義を可能にします。このワークフローにより、マウス肝臓の空間的グリコミクスの再現性が高く感度が高いことが可能となります。さらに、他の組織や種にも容易に適応できるため、グリカムの健康や疾患における生物学に関する新しい空間的洞察を可能にしています。

概要

空間生物学の分野は急速に拡大しており、生物の動的な空間的生体分子複雑性に関する重要な洞察を提供しています。生物学的文脈で異なる生体分子を研究するために、複数のアプローチが用いられています。一部は非常に専門的な技術ですが、質量分析(MS)は細胞、組織、生物の文脈で幅広い生体分子を定量化するための重要な一般技術として浮上しています。

マトリックス支援レーザー脱着/イオン化質量分析イメージング(MALDI-MSI)は、多組ム空間バイオ分子イメージングの新たな一般的な技術の一つです。これはもともと組織スライス中のタンパク質とペプチドの可視化のために確立されました。それ以来、多くの多様な生物サンプルや分子に拡張されています。この技術は細胞サンプル3、オルガノイド4、モデル動物5、患者サンプル6,7に適用可能です。一部の分子クラスはMSIベースの手法で直接測定可能で、多くの代謝物や脂質が含まれますが、タンパク質や糖団のようなより複雑な生体分子は、MSIベースの検出に適するために酵素的または化学的処理が必要です2,8。

MALDI-MSIはまた、N連結糖やグリコーゲンの空間解析にも応用されており、MSI検出に適した糖団断片を生成するために酵素処理を必要とするワークフローを活用しています。N-グリカンはPNGase Fでタンパク質のアスパラギン残基から切断され、グリコーゲンのグルコース鎖はイソアミラーゼで切断されます。MALDIグリコーゲン解析の主な利点は、生物学的サンプル内のグリコーゲン分布の空間的定義、相対定量、そしてグルコース鎖の分岐に関する情報を提供することです。N-グリカンとグリコーゲンの両方のワークフローはMSI分析のために酵素処理を必要とするため、グリコム分析用の統合ワークフローに統合されています(図1A)。このワークフローには、生物学的サンプルの慎重な準備と特定の処理が必要で、グリコームのMS解析を行い、その後データ取得と処理を行います。ワークフローには専門的なステップが必要ですが、高度に再現性が高く、多様なサンプルタイプに適応可能な豊かで高品質な空間グリカムデータを生成します。さらに、ワークフローはモジュール化されており、サンプル処理の手順は独立した研究所が実施し、その後MALDI-MSIのデータ取得・分析の後期段階を専門施設に提出します。

プロトコル

この研究はフロリダ大学の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)ガイドラインに準拠して実施されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 肝臓の採取

  1. 動物の安楽死と解剖
    1. 子宮頸部脱臼および頭部切断を行い、施設で承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させます。
      注:この例では、生後6か月の野生型C57BL/6Jマウスが使用されました。この年齢のマウスは~25〜33gです。この分析には年齢、体格、株の幅広い人が適しています。
    2. すぐに動物を吸収性の下敷きに置き、滅菌メスで腹部を露出させます。
    3. 滅菌鉗子とハサミを使い、最小限の操作と組織損傷で肝臓を隔離します。
      注意:代謝の変化は急速に起こります。可能であれば灌流や鎮静を避け、解剖の手順はできるだけ迅速に行うようにしてください17。
  2. ティッシュを素早く洗い、きれいにしてください。
    1. 肝臓をリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)1回に優しく浸して血液を除去します。
    2. 組織を脱イオン水(DI)に2回浸します。
    3. 余分な水分を清潔な作業用ワイパーに優しく当てて拭き取ります。
      注意:標準的な顕微鏡スライドに収まるサイズを超えるサンプルは、凍結前に切断してください。
  3. サンプル凍結
    1. 洗浄したレバーを、液体窒素の上に浮かぶ事前冷却済みの使い捨て発泡スチロール製の計量艇に直接入れます。
    2. 組織の色が光沢のある不透明に変わったら約3分後に、組織をあらかじめ用意されラベル付きのアルミホイルパックに入れてドライアイスに入れます。
    3. サンプル入ったアルミホイルの袋を-80°Cの冷凍庫に入れて保管してください。サンプルは-80°Cで長期保存可能です。

2: 生物サンプルの準備

  1. 冷凍解剖の準備
    1. クライオスタットを作動させ、組織に適した温度(-16°Cから-20°C)に平衡させてください。 正確な温度は組織の種類によって異なります。肝臓は組織裂けを防ぐために、やや高温の約-16°Cから-17°Cで切片し、他の組織は-20°Cで切片します。
    2. 最低でもチャックを2本、細いペイントブラシ2本、細いピンセットを2本、そしてクライオスタット内の温度で70mmのガラスインサートを用意してください。さらに、ラベルを鉛筆でスライドしてからクライオスタットに入れて慣れさせてください。
    3. 組織を-80°Cの冷凍庫からドライアイスのクライオスタットに移します。
    4. 組織をクライオスタット内で少なくとも30分間温度に慣らしてください。
    5. ガラスインサートの縁に損傷がなく、組織がアンチロールガイドと接する部分が滑らかであるかを確認するために、手袋をした指で縁に沿ってなぞります。
    6. ガラスのインサートをアンチロールガイドに入れます。
    7. ロープロファイルの刃を慎重に開いたブレードホルダーに滑り込ませ、ブレードホルダーを閉じます。赤い刃のガードを刃の上に下ろして、切断するまで置きます。
    8. 組織をM1マウンティングメディア(MS対応)でチャックに取り付けます。室温のM1マウンティングメディアをクライオスタット内のチャックに置き、チャックの少なくとも2つのリングを覆って組織を固定します。
      注:最適切断温度(OCT)化合物は、クライオセクションでよく用いられます。しかし、MS用途ではイオン抑制を引き起こすため避ける必要があります。OCTを使用する必要がある場合は、OCTを最小化または削除するために追加の多段階プロトコルを用いるべきです。さらに、一部のMSリソースセンターではOCTに埋め込まれたサンプルを分析しません。
    9. 冷やしたピンセットを使って、アルミホイルのティッシュを取り出します。ピンセットを使って組織をチャックに所定の向きで配置します。
    10. チャックをクライオスタットに入れて、取り付け媒体を約2分間凍らせます。凍結されると硬化し不透明に見えます。
  2. 肝組織の冷凍解剖
    1. 埋め込んだティッシュをチャックホルダーに入れます。組織が刃に対して90度の角度で切断されるようにチャックを位置づけます。
    2. チャックホルダーを組織が刃に接触しなくなるまで引き戻します。組織が刃にすぐ隣接するまでゆっくりとチャックを巻き込み、セクション分けを始めます。
    3. 不要な組織を除去するために、厚さ30μmの切片から切片を始めます。
    4. ロールプレートの深さが滑らかな断面を作り、組織がロールプレートの上で転がらないようにしてください。もしそうなら、ロールプレートを少し緩めてください。組織がロールプレートを動かし、回転のリセット時に2回目の衝突を起こしたら、ロールプレートを少し締めます。
    5. 希望する断面に近づくと、スライスの意図した厚さを10μm、または特定の用途に適した別の希望厚さに減らします。
    6. 10回転して、チャックの厚みが適切になるようにしてください。そうすればラグや不均一な部分が起きません。
    7. 冷やした筆を使ってステージをクリアし、区画の準備をしてください。ロールプレートを刃の上に閉じ、ゆっくりと組織の一部を取ります。
    8. ロールプレートを持ち上げ、冷やした細いペイントブラシ2本で刃から優しく部分を離します。スライドに取り付けやすくするために、セクションをステージの横に引き寄せてください。
    9. 冷凍保存機のスライドキャリアから冷やしたスライドを取り出し、組織が位置する場所とは反対側に人差し指を10秒置きます。
    10. スライドをそっとティッシュに置き、持ち上げます。強く押し下げると組織が裂けてしまうので注意してください。組織はスライドに溶けて透けていきましょう。
    11. スライドを素早く乾燥機に移して乾燥させます。スライドを乾燥機で1時間乾燥させます。
    12. 乾燥後、スライドは直接MS処理または真空パックで-80°Cで保存することができます。

3. グリコミクスのMSIスライド準備

  1. 酵素の調製
    注:MS対応の低塩凍結乾燥PNGase Fは購入可能で、直接利用できます。
    1. イソアミラーゼはMSの応用で余分な塩分を除去するために透析が必要です。1つ以上の透析カップをHPLC水に15分間浸して準備します。
    2. 500μLの透析カップを14.3 mLのHPLC水に浸し、4°Cで2時間、攪拌せずに200 μLのストックイソアミラーゼを透析します。14.3mLのHPLC水を新鮮なHPLC水に置き換え、さらに16時間(1晩)4°Cで透析します。 14.3mLのHPLC水を新鮮なHPLC水に置き換え、さらに4°Cで8時間の透析を行います。
    3. ピペットでカップからイソアミラーゼを優しく取り出し、1.5インチのマイクロ遠心分離機チューブに入れます。透析後のイソアミラーゼ溶液の総体積(μL単位)を測定してください。ストックの初期活性(通常200ユニット/mL)と最終体積から、3単位のイソアミラーゼに必要な総体積を算出します。
    4. 3単位のイソアミラーゼを薄壁のPCRチューブにピペットでアリコートします。液体窒素にスナップ冷凍チューブを入れます。-80°Cで保存します。 各スプレープロトコルには透析されたイソアミラーゼ溶液のチューブ1本を使用でき、4枚のスライド分に十分です。酵素活性を維持するために凍結・解凍のサイクルは避けてください。
  2. 組織の固定と洗浄
    1. スライドをスライドホルダーに入れ、10%中性緩衝ホルマリン(NBF)を入ったガラス容器に1時間浸します。
    2. NBFからスライドを外してください。スライドを70%エタノールに2時間浸します。
    3. 70%、80%、90%、100%エタノールを含む4つのコプリンジャーを準備します。洗いの混乱を避けるために、各瓶に明確なラベルを貼ってください。
    4. スライドを順に移す順序は次の通りです:70%エタノール5分、80%エタノール5分、90%エタノール5分、100%エタノール5分。
    5. スライドを新鮮な100%キシレンで満たしたガラス製ペトリ皿に移します。スライドが完全に水没していることを確認しましょう。組織の脂質含有量に応じて、70rpmのシェイカーで1時間キュベートします。この工程をさらに2回繰り返し、洗うたびに新鮮なキシレンを使います。
      注:このプロトコルは、脂質がイオン抑制をもたらすことが知られているため、最大限の脱脂化を可能にするよう設計されています。しかし、これにより信号が非局在化し、得られる解像度が低下します。洗浄作業の減少、処理時間の短縮、湿度の厳密な管理により、非局在化を減らし、データ解像度の向上につながる可能性があります。
    6. スライドを乾燥機に一晩置いて乾かします。
    7. スライドを70%エタノールに1分間浸して再水和させます。スライドをDI水に3分間浸します。DI水を新鮮なDI水で繰り返し洗います。
    8. スライドを乾燥機で10分間、または完全に乾かすまで乾燥させます。
  3. 酵素塗布のためのスライド準備
    1. HTX湿度チャンバーを金属ラックの下に置き、DI水に浸したペーパータオルを置いて孵化させます。チャンバーを37°Cのインキュベーターに入れます。
    2. 水道水を水槽の上部まで満たして、食品スチーマーを用意します。タイマーを60分に設定してユニットを起動してください。
    3. 50 mLのFalconチューブに50 mLのHPLCグレード水、25 μLのシトラコニック無水物、2 μLの12 M HClを加えてシトラコニック緩衝液を準備します。溶液を10秒ほどボルテックスして十分に混ぜます。50mLの遠心分離機チューブ1本のシトラコニック緩衝液は4枚分のスライド分です。溶液のpHが3.0(許容範囲:2.5〜3.5)であることを確認しましょう。
    4. 各メーラーに準備済みのシトラコニックバッファーを入れます。組織が側面に接触しないようにスライドを内側に置き、抗原回収を効果的にします。1枚のメーラーにつき2枚のスライドを使い、両方のスライドの組織が内側を向いている2つのエッジポジションを使います。
    5. 食品スチーマーから蒸気が出ているか確認してください。郵便物をフードスチーマーに入れて30分間孵化させます。
    6. 郵便物をDI水浴に移して5分間やり取りします。メーラー内のシトラコニックバッファーの半分をDI水に替え、さらに5分間放置します。この希釈をさらに2回繰り返します。
    7. すべての溶剤を取り除き、スライドを洗うときは、スライドメイラーに100%離子水を加え、その後離子水を取り除きます。白紙で組織が見つからない部分の部分を拭き取ってください。
    8. 各スライドの裏面に円と三角形を描いて、内部の標準的な位置を示します。スライドの前面に1 μLのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP、円)と10 mg/mLのウサギ肝グリコーゲン(三角形)1 μLを塗布します。
    9. スライドを乾燥器に15分間置いて完全に乾かします。
  4. 酵素噴霧と消化
    1. 100μgの凍結乾燥PNGase F(500単位/μg)チューブ1本とアイソアミラーゼ3単位のチューブ1本を取り出し、10分間解凍します。マイクロ遠心分離機管内で~2000 x g の真空管を5秒間回転させます。これは4枚のスライドを噴霧するのに十分な酵素です。
    2. 各凍結乾燥PNGase Fチューブに50μLのDI水をピペットし、10秒間優しく渦を巻き、マイクロフュージで~2000 x g の圧力で5秒回転させます。50μLのPNGase F溶液を直接イソアミラーゼチューブにピペット移液します。HPLC水を最終体積1 mLに加えます。
    3. デュアル酵素のマイクロ遠心分離管を10秒回転させ、5秒間~2000 x g で回転を下げます。
    4. HTX M5のスプレーヤーをオンにして、HTX M5のソフトウェアを開きます。システムタブでトレイタイプがAmbientに設定されていることを確認してください。
    5. Knauerポンプを止めるには、右前方のストップボタンを押してください。外部シリンジポンプの背面パネルのスイッチを使って電源を入れてください。
    6. HTXソフトウェアの 「方法 」タブで、デュアル酵素噴霧に適した方法を選択します。パラメータはノズル温度45°C、15回通過、流量0.025 mL/min、速度1200 mm/min、トラック間隔3 mm、CCパターン、圧力10 psi、ガス流量3 L/min、ノズル高さ40 mmに設定される必要があります。
    7. 温度タブに移動し、スプレーノズルの温度を45°Cに設定します。レンチを使ってスプレーラインをトップコネクターに移してください。
    8. 超高純度窒素ガスバルブを開け、スプレーヤーの圧力が10 psiであることを確認してください。シリンジポンプでは流量を95 μL/minに設定します。
    9. 新しい注射器と針を使い、4mLのHPLC水を注ぎます。すべての気泡を取り除きましょう。スプレーラインの約6インチの区間に2mLの水を流し、廃棄ビーカーに注ぎます。
    10. 注射器をスプレーヤーのラインに接続し、95 μL/minで5分間稼働させてシリンジポンプに水を流します。
    11. シリンジポンプをフラッシュする際、金属のアライメントガイドを使ってスライドを加熱トレイの左下隅にテープで貼り、組織がスプレー範囲内に収まるようにしてください。 サンプル タブで、スプレー領域のXおよびYパラメータを定義し、スライド全体をカバーするためにわずかなオーバースプレーを許容します。
    12. 5分後にポンプを一時停止し、注射器を外して空気を吸い込み、スプレーラインを通して残った水分を排出します。必要に応じて繰り返します。
    13. デュアル酵素溶液を新しい注射器に注入し、ポンプに接続して気泡が残らないようにしてください。
    14. 注射器をスプレーヤーのラインに接続してください。シリンジポンプでは流量を25μL/minに調整します。
    15. スプレーノズルが45°Cに達したら、サイクルタブのスタートボタンを押してください。Knauerポンプをオンにするよう促されたら「いいえ」をクリックしてください。シリンジポンプのスタートボタンを押してスプレーを開始します。
    16. スプレーノズルの下に空のスライドを置き、酵素のスプレー沈着を確認します。観察されたら、ソフトウェアの 「続ける」 をクリックし、ガラスカバーをスプレーヤーに置き、均一な濡れで均一な噴霧を監視します。
    17. スプレーサイクルが終わったら、ポンプの停止ボタンを押して窒素ガスを止め、「 バルブ負荷確認」をクリックします。スプレーヤーのラインとステージを清掃し、スプレーヤーを停止してKnauerポンプが再び稼働していることを確認してください。
    18. スライドはHTX湿度チャンバーで37°Cで2時間孵化し、スライドは上向きに置きます。完成したら、スライドを乾燥器に15分間置きます。スライドは一晩乾燥器内に残すこともあれば、プロトコルを継続することも可能です。
  5. MALDIマトリックスの調製と応用
    1. マトリックス適用前に、スキャナーでスライドの光学画像を撮影してください。
    2. 40mgの固体CHCAを15mLの円錐形チューブに詰めます。CHCA粉末を0.1%トリフルオロ酢酸と50%アセトニトリル(ACN)の溶液に7mg/mL濃度で溶かします。
    3. マトリックス溶液を10分間ソニック化し、90秒オン、30秒オフのサイクルで処理します。これらのステップを5回繰り返し、完全に溶けて均質化します。
    4. HTX M5のスプレーヤーをオンにして、HTX M5のソフトウェアを開きます。窒素ガスバルブを開けて、システム圧力を10psiに設定します。
    5. HTXソフトウェアの 「方法 」タブから、CHCAマトリックススプレーに適した方法を選択します。パラメータはノズル温度79°C、10回通過、流量0.1 mL/min、速度1300 mm/min、トラック間隔3 mm、CCパターン、圧力設定10 psi、ガス流量3 L/min、ノズル高さ40 mmに設定されています。
    6. 温度タブに移動し、スプレーノズルの温度を79°Cに設定します。 「ポンプ」タブで流量を100 μL/minに設定します。
    7. スライドを加熱トレイの左下隅に金属ガイドでテープで固定し、スプレーエリアの正しい位置を確保します。 サンプル タブで、スプレー領域のXおよびYパラメータを定義し、スライド全体をカバーするためにわずかなオーバースプレーを許容します。
    8. 使い捨ての注射器と針を使って50%ACNを5.5mL抽出します(気泡を除去してください)。
    9. スプレーヤーを LOAD モードに設定してください。ACNシリンジを挿入し、ACNを注射します。ACNシリンジを取り外し、すぐに5.5mLのろ過CHCA溶液を含む新しい注射器に交換し、気泡を避けて注射してください。スプレーヤーを SPRAY モードに設定してください。
    10. スプレーノズルが79°Cに達したら、サイクルタブのスタートボタンを押してください。「はい」を促されたらクリックしてください。
    11. 空のテストスライドを使い、スプレーヤーノズルの下に置いてください。目に見えるマトリックス噴霧の堆積を確認するために、スライド上に黄色いマトリックス堆積が見られます。観察が完了したら「 継続」をクリックし、ガラスカバーを器具にかぶせ、スプレーの一貫性を監視します。一定のスプレーで均一な不透明性のスライドが得られます。
    12. スプレーサイクルが完了したら、スプレーヤーを LOAD モードに設定し、「 Valve load confirm」をクリックします。
    13. ポンプを300psiに設定し、温度を30°Cに下げてスプレーヤーを清掃してください。 50%アセトニトリル5mLを2回、50%メタノール5mLを2回取り込み、ラインに押し込む。ステージを100%メタノールできれいに拭き取れ。温度が30°Cに達したら LOADに切り替え、ガスを止め、スプレーヤーを停止し、Knauerポンプが再び稼働していることを確認してください。
    14. マトリックスが完全に乾燥するまでスライドを乾燥器に15分間置きます。スライドは散布後、最大14日以内に実行し、適切な信号対雑音比で信頼性の高いデータ収集を確実にするべきです。

4. MALDI-MSIグリコミクスデータ収集

  1. データ収集の準備
    1. スライドアダプターでMALDIのサンプルホルダーにスライドを固定します。サンプルホルダーをMSに挿入し、画像撮影のために正しく装着されていることを確認してください。
    2. flexImagingソフトウェアを開き、以前に記録した光学スライド画像をインポートしてください。ステップ3.4.1を参照してください。必要に応じて、画像の整列を機器ステージと比較し、組織切片や標準スポットが領域選択のために正しく位置付けられるようにしてください。
    3. 組織切片の画像領域、HRP標準、グリコーゲン標準、コントロールマトリックスをソフトウェア内で定義します。それぞれを別々の地域としてアウトライン化しましょう。
    4. ラスタステップサイズを50μmに設定すると、ピクセル解像度は50 × 50 μmとなります。
    5. 計測機器制御ソフトウェアで 正イオンMS モードを選択し、スキャン範囲を m/z 500 - 4000 、低質量カットオフ 700.00 m/zに設定します。
    6. 機器制御ソフトウェアで事前最適化されたMALDIイメージングチューニングパラメータを読み込み(必要に応じて手動で値を入力)してください。ソースおよびイオンの光学電圧が指定された値に設定されているか確認してください:MALDIプレートオフセット50.0V;偏向1デルタ70.0V;ファンネル1 RF 500.0 Vpp;ファネル2 RF 500.0 Vpp;マルチポールRF 500.0 Vpp;イオンエネルギー5.0 eV。衝突セルとTOFタイミング設定を確認してください:衝突エネルギー10.0 eV;衝突 RF 4000.0 Vpp;転送時間 180.0 μs;プレパルスストレージ 25.0 μs。
    7. レーザータブでレーザー設定を確認してください。アプリケーションのデフォルトとして 「イメージング50μm 」を選択してください。
    8. チューンミックスなどの外部キャリブラント混合液を用いて質量分析計を校正します。キャリブラントを導入し、計器のキャリブレーションルーチンを実行します。質量精度誤差が0.001%以内に、校正精度スコアが100%になるように校正を調整します。
    9. 取得を10,000Hzの周波数で320発のレーザーショットのバーストを行うように設定しました。信号強度を最適なダイナミックレンジ内に保つために、レーザー減衰は37%に調整する必要があります。必要に応じてレーザーショットや減衰を調整してください。
    10. 機器の自動ビームアライメント機能、ターゲットプロファイル調整、フォーカス調整を活用し、レーザーが試料に正しく焦点を合わせていることを確認してください。組織から外れた領域では、制御ソフトのレーザータブでオートビーム調整を実行し、レーザーをイオン光学系に合わせます。これにより、レーザーとステージが最適なデータ収集に調整されます。最後に、サンプルキャリアタブでターゲットプロファイル生成とフォーカスチューニング調整を実行します。
    11. 内部標準スポットが予想通りのイオンピークを生み出し、データ収集の準備が整っていることを確認しましょう。HRPは1211.42で顕著なグリカンピークを持つはずです。グリコーゲンは、最も強いピークが1013.32、1175.37、1337.43で、顕著なピークを規則的に間隔で配置しているはずです。
      注意:強度に問題がある場合は、レーザー構成を再検討してください。質量精度に問題がある場合は、校正を再検討してください。
  2. MALDI-MSIデータ収集
    1. 画像診断ソフトウェアの スタート ボタンをクリックして、定義された領域のMALDI-MS画像取得を開始します。装置は各定義領域にレーザーを50μm間隔で自動的にラスター化し、各ピクセルで正イオンMS1スペクトル(m/z 500-4000)を取得します。この解像度での肝臓切片のデータ収集時間は135分です。
      注意:実行後、機器は取得した各ピクセルのスペクトルを自動的に保存し、生データを含む.dフォルダを作成します。

5. MALDI-MSIデータ分析

    結果

    野生型マウスの肝臓を慎重に処理し、横断面を切断した(図1A)により、MALDI-MSIによるグリコームの定義が可能となり、さまざまなm/zにわたるグリコーゲン由来オリゴ糖およびN結合グリカンが検出されました(図1B)。グリコーゲンは肝細胞全体に広く局在し、門脈路の血管や結合組織には欠如していました(図1C,D)。重要なのは、MALDI-MSIのデータにより、グリコーゲンの空間的分布および鎖長分布の両方を測定できたことです。これは正常代謝および疾患状態におけるグリコーゲンの重要な特徴です(図1D)。さらに、多様なN結合グリカンは多様な組織を示します。観察される空間分布は、肝細胞に広く分布している(図1E)から、肝臓の正弦波的組織(図1F)に一致する地域焦点、さらには門脈路要素の特異的な標識(図1G-I)まで多岐にわたります。

    figure-results-1
    図1:マウス肝臓のMALDI-MSIグリコム解析。 (A) 試料準備、データ収集、分析における重要手法の回路図。(B)アプローチから導出された質量スペクトルのサンプル。赤い矢印は、グリコーゲン由来の規則的な間隔のオリゴ糖を示しており、1つのグルコース単糖の差があります。青色の矢印はN-グリカンを示し、スペクトル全体に分布しています。肝臓では、特にm/z値が高いほどグリコーゲンピークがより顕著になります。(C) 肝臓におけるグリコーゲン由来のマルトヘキソース(DP6)の空間的分布。(D) 肝臓におけるグリコーゲン鎖長の分布。(E-G)肝臓における異なるN連結糖団種の空間的分布。(H) 中心部に焦点を絞ったヘマトキシリンおよび嗜酸(H&E)染色、解剖学的注釈。(I) 門脈路要素における追加のN連結グリカン(Hex5dHex1HexNAc5)の空間的局在を示す対応する焦点固定図。スケールバー:500μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

    ディスカッション

    MALDI-MSIはグリカム空間生物学の新興ツールです。重要なのは、このプロトコルは特定のハードウェアを用いたデータ収集に焦点を当てている一方で、複数のベンダーのMALDI-MSIプラットフォームに容易に適応できる点です。サンプル処理は方法4までは同一ですが、一部のベンダーは専用スライドの使用を要求する場合もあります。MALDI-MSIプラットフォーム固有のパラメータを用いたデータ収集の変更により、このプロトコルの迅速な適応が可能になります。データ処理にはベンダー固有のソフトウェアを利用でき、ステップ5で詳述されているほか、厳密かつ再現性の高いMALDI-MSIデータ処理のためのプラットフォームを用いることも可能です。

    MALDI-MSIは、異なる臓器、組織、細胞が異なるグリコームのパターンを持つため、生物学を理解する上で特に有用なツールです。肝臓はグリコーゲンのレベルが高く、多様なN結合糖団を有しているため、グリコーム分析に適しています13。他の臓器はN連結グリカンのレベルと多様性が高く、グリコーゲン13のレベルが低いです。重要なのは、グリコムは生物の代謝や疾患状態によって臓器ごとに異なるため、グリコムは生物学的情報の豊富な供給源である5,14,15,20です。MALDI-MSI解析用の独自の炭水化物有効酵素の開発が継続され、グリコーム解析をグリコーム内の直交生体分子に拡大することが期待されています。

    多くの利点があるものの、MALDI-MSIは空間生物学で用いられる他のツールと比べて解像度が限られています。このプロトコルは50μm解像度のデータ収集を利用していました。生理学的解析には優れていますが、単一細胞分解能のデータではフィールドの進歩が大きく進むでしょう。特に、脱局在化は酵素噴霧とその後の湿度条件下での培養方法において、分解能向上の大きな障壁となり得ます。最近のサンプル処理ハードウェア、サンプル処理方法、データ取得ハードウェア、選択的ラベリングの使用、データ処理の進歩により、MALDI-MSIのデータ収集はセルラー解像度22,23に近づくことが可能となっています。しかし、分解能と信号対雑音比(Signal-to-noise)との間にトレードオフがあり、MALDIの現在の試料準備方法に基づく固有の制約を考慮する必要があります。非常に具体的な応用では、サンプル処理24と新規アルゴリズムの革新を用いて単一細胞分解MALDI-MSIの目標がすでに達成されており、これらの問題に対する一般的な解決策が達成可能であることを示唆しています 25,26,27。

    データ収集後、組織学的注釈のためにH&E で スライドを染色することができます。しかし、MALDI-MSIのデータ収集には細胞および組織の損傷が伴うため、この戦略は細胞注釈の範囲を限定します。あるいは、H&Eには連続組織スライスを用いることも可能です。この戦略は高品質なデータを提供しますが、離散サンプルカットのアライメントと統合が必要です。

    特筆すべきは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織は、サンプル調製13のプロトコルをわずかに変更するだけでMALDI-MSIによるグリクム分析に非常に適しています。しかし、FFPE組織は代謝学やその他の類似解析に効果的に利用できないため、ここで詳述した通り、マルチオミクス手法には新鮮に凍結されたサンプルが推奨されます。サンプル準備は、不安定な生体分子のMSIパイプラインにおいて重要な要素であり、サンプル17、29、30の採取や取り扱いに特別なアプローチが必要です。

    MALDI-MSIベースの手法の一般性と広範な利用を拡大するための手法論は、ハードウェアとソフトウェアの劇的な改良により急速に進展しています19。さらに、最近の最先端のマルチオミクス28およびマルチモーダル21アプローチは、機械学習や人工知能と組み合わせることで、これらの非常に複雑なデータセットの処理において特に有望です。

    開示事項

    R.C.S.、M.S.G.、C.W.V.K.はフロリダ大学の先進空間バイオ分子研究センター(CASBR)の共同ディレクターであり、Sugar3 LLCの共同設立者でもあります。R.C.S.はMaze Therapeuticsから研究支援および/またはコンサルティング料を受けています。M.S.G.はMaze Therapeutics、Valerion Therapeutics、Ionis Pharmaceuticals、PTC Therapeutics、Aro Biotherapeuticsから研究支援、研究化合物、またはコンサルティング料を受けています。M.S.G.はチェルシーズ・ホープ、グルト1欠乏症候群財団、成人ポリグルコーサン身体疾患財団の科学諮問委員会のメンバーです。

    謝辞

    Vander Kooi、Sun、Gentryの各ラボのメンバーに感謝し、実りある議論をありがとうございます。本研究は、国立衛生研究所(NIH)からケンタッキー大学マーキーがんP30CA177558センターの生物標本調達・トランスレーショナル病理学共有資源施設への助成金を受け、D.B.A.、R01AG066653、R01CA266004、R01AG078702、R01CA288696、RM1NS133593からR.C.S.、R35NS116824からM.S.G.、R01DC019054からC.W.V.K.、およびフロリダ大学医学部へと支援されました。

    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    吸収性アンダーパッドデンビル・サイエンティフィックB1623
    アセトニトリル(ACN)シグマ・オルドリッチ34851-4X4L
    アルミホイルフィッシャー・サイエンティフィック 15078292
    シトラコニック無水物シグマ・オルドリッチ125318
    円錐形チューブ(15mL)アルカリ・サイエンティフィックCW5600
    コプリンジャーズDWKライフサイエンス900570
    クライオスタット ライカCM1860
    クライオスタットチャックライカ14041926491
    乾燥器ベルアートF424004131
    透析カップサーモ・フィッシャー88400
    エタノールフィッシャー・サイエンティフィック 22032601
    食品蒸気機関車Rival CKRVSTLM21  
    ガラスインサート(70mm)ゲル社LGI50
    グリコーゲンシグマ・オルドリッチG8876標準
    ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)シグマ・オルドリッチP8125標準
    HPLC水シグマ・オルドリッチ270733-4X4L
    HTXスプレーヤーHTXテクノロジーズM5
    塩酸フィッシャー・サイエンティフィック A144-500
    イソアミラーゼメガザイムイー・アイサミー
    クナウアーポンプクナウアーP 4.1 S
    ロープロファイルブレード電子顕微鏡科学63059-01
    M1マウントメディアエプレディア1310
    質量分析計ブルーカー・ダルトニックスtimsTOF fleX
    マイクロフュージチューブ(1.5mL)アルカリ・サイエンティフィックCN3016
    針BD305109
    中性バッファーリングホルマリンNBFミリポーアシグマHT501128-4L
    窒素ガスエアガスNIUHP300
    PBSフィッシャー・サイエンティフィック SH30256。FS
    PCRチューブMedSupplyパートナー62-1091-1
    PNGase F PRIME-LY ULTRA ブルドッグの略歴NZPULT10LY
    SCiLSラボブルーカー・ダルトニックス1889000
    シェイカーサーモ・サイエンティフィック88882007
    スライド  電子顕微鏡科学71873-02
    スライドメールRPI製品212620A
    ソニケーター(バイオラプター・ピコ)ディアゲノードB01080010
    滅菌鉗子DRインスツルメンツS08098
    滅菌メスWPIWPI-500240
    ステリレス・ハサミファインサイエンスツール14084-08
    シリンジ  グレンジャー19G342
    シリンジポンプ新時代NE-300
    テープフィッシャー・サイエンティフィック 15-901-R
    細い筆アネズス#00
    トリフルオロ酢酸シグマ・オルドリッチT6508-1L
    チューンミックス、ESI低濃度アジレントG1969-85000
    ウェイトボートシグマ・オルドリッチHS120882
    キシレンシグマ・オルドリッチ534056
    &α;-シアノ-4-ヒドロキシシンナミ酸(CHCA)ケイマン・ケミカル・カンパニー15254

    参考文献

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