方法論記事

自閉症に関連するニューロンの興奮性障害を調査するための動的クランプ法

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DOI:

10.3791/69155

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2025年10月17日

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1Department of Biology, Miami University

この記事について

サマリー

動的クランプ電気生理学は、ニューロンの発火障害とイオンチャネル機能障害との間の因果関係を確立できます。マウス小脳プルキンエニューロンにおける動的クランプ法とプロトコルについて説明し、有用なリソースと技術的考慮事項に注目します。代表的な研究では、モデル化されたナトリウムコンダクタンスを Tsc1-/- プルキンエニューロンに追加して、反復発火を救います。

要約

自閉症スペクトラム障害 (ASD) は、さまざまな遺伝的および環境的要因から発生します。多数のASD関連変異がシナプスの発達または可塑性を破壊する一方で、電位依存性イオンチャネルの発現と機能を変化させ、ニューロンの固有の興奮性の欠陥をもたらすことが示されている数が増えています。全細胞電圧クランプ記録を使用して、ASD関連の変異がイオンチャネル機能にどのように影響するかを特徴付けることができます。しかし、これらの実験では、変化したイオンコンダクタンスがニューロンの活動電位の発火にどのように影響するかを直接評価することはできません。動的クランプ電気生理学は、ユーザー定義のイオンコンダクタンスを生きたニューロンにリアルタイムで注入できるようにすることで、このギャップを埋めます。これにより、イオンチャネル特性の変化が特定の細胞タイプの電気的活性にどのように影響するかの因果試験が可能になります。この方法の記事では、急性に調製された小脳スライスで生理学的条件下で記録された成体マウスプルキンエニューロンに動的クランプ電気生理学を実装する方法について説明します。プルキンエニューロンは、反復的な高周波(20〜100 Hz)の活動電位を発射する固有の能力を持ち、ASD関連の小脳回路機能障害に一貫して関与しているため、この研究に特に関連するモデルです。私たちは、機能喪失変異がASDの最も一般的な単一遺伝子原因の1つである遺伝子である Tsc1に焦点を当てます。マウスプルキンエニューロンでは、 Tsc1 欠失は電位依存性ナトリウム(Nav)チャネル発現の低下にも関連しています。マルコフ運動状態モデルを利用してプルキンエニューロンのナビゲーションコンダクタンス特性をシミュレートおよび再現し、動的クランプを使用して、ナビゲーションコンダクタンスの変化が無傷の小脳プルキンエニューロンの固有の発火にどのように影響するかを直接評価します。イオンコンダクタンスモデルを変更および調整するための手順とリソースを提供します。このアプローチは、イオンコンダクタンスモデリング、ダイナミッククランプ、および従来のパッチクランプ技術を統合することにより、遺伝的摂動をASD関連ニューロンの生理学的転帰に関連付けるための強力で柔軟なフレームワークを提供します。

概要

自閉症スペクトラム障害(ASD)の分子的および細胞的要因に関するこれまでの調査では、シナプス機能障害が障害の病態生理学の中心であることが強調されることがよく見られました1,2。ASDモデルでは、興奮性シナプス密度の増加2,3,4、シナプス剪定障害5、シナプス後密度タンパク質の変化6,7が多くの研究で実証されています。しかし、最近の研究では、内因性ニューロンの興奮性の変化も ASD の病理の要因であることが示されています。たとえば、ASD トランスジェニック マウス モデルと患者由来の細胞株は、小脳プルキンエ8、9、10 および皮質錐体ニューロン11 における活動電位生成の障害、および皮質錐体ニューロンのサブクラスにおける樹状突起興奮性とシナプス統合の減弱を明らかにしました12。電位依存性ナトリウム(Nav)チャネルNav1.2細孔形成サブユニットをコードするSCN2Aの機能喪失変異を伴うチャネル障害α、現在ではASD13のよく知られた単一遺伝子の原因であり、さまざまなクラスの中枢ニューロンの固有の興奮性の欠陥を引き起こすことが示されています14,15,16,17.この種の研究が進むにつれて、イオンコンダクタンスの病原性変化と、これらの変化がニューロンおよび回路機能に及ぼす影響との間の因果関係を確立することが重要です。動的クランプ電気生理学は、このタスクに効果的なアプローチを提供します。(1992および1993)18,19は、RobinsonおよびKawai(1993)20とともに、電圧依存性の有無にかかわらず、シミュレートされた非線形イオンコンダクタンスを生ニューロンに注入/添加する動的クランプ法を最初に説明し、研究者が電位依存性イオンコンダクタンスの特性または推定変化がニューロンの発火にどのように影響するかをリアルタイムで評価できるようにします21、22.

動的クランプ実験の実装は、RTXI23、QuB24、25、StdpC26 などのいくつかの無料で利用できるソフトウェア システムによって促進されています。しかし、最近の進歩により、モデルコンダクタンスを1台のコンピュータで1つのソフトウェアパッケージ内で開発、変更、適用できる商用プラグアンドプレイシステムにより、動的クランプの実装が簡素化されました。ここでは、Sutter dPatchシステム27を使用して動的クランプを実行するためのプロトコルを提供し、ASD28の変異の一般的な遺伝子座である結節性硬化症1(Tsc1)9の標的欠失が、電位依存性ナトリウムコンダクタンスの発現の変化の結果として小脳プルキンエニューロンの固有の発火にどのように影響するかをテストするサンプル調査を提供します8。

プロトコル

すべての動物実験は、マイアミ大学施設動物管理および使用委員会のガイドライン(プロトコル#1044)によって承認されたプロトコルに従って実施されました。実験では、雄と雌の野生型C57BL/6Jマウスと、C57BL/6J株バックグラウンドを持つトランスジェニック系統を利用しました。電気生理学的実験では、動物は6〜7週間齢でした。すべての記録は、小脳虫部の小葉5、6、または7のプルキンエニューロンから取得されました。

1. プルキンエニューロンパッチクランプ実験のセットアップと組織準備

  1. 125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、25 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、および25 mMブドウ糖を含む人工脳脊髄液(ACSF)をpH 7.4(~300 mOsM/L)で調製します。また、240 mMスクロース、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、0.5 mM CaCl2、および7 mM MgCl2を含む250 mLの「切断溶液」を調製します。ACSFとカルボゲン(95%O2/ 5%CO2)ガスを含む切断溶液を、使用前に少なくとも20分間、すべての実験を通して継続的にスパージ(バブル)します。
  2. 後で使用するために、ACSFで満たされた脳スライス保持チャンバーを準備します。小脳スライス(スライスチャンバーに追加された後)が、小脳スライスの両側がACSFにさらされた状態で水没していることを確認します。これを実現するには、同じく水没しているしっかりと引き伸ばされたナイロンメッシュに水没したスライスを置きます。
  3. 手術ステーションを準備します。麻酔をかけた動物をピンで留めるために使用される4枚のテープを用意しました。氷を入れたバケツまたは製氷皿に、ペトリ皿の下半分を壁を下に向けて、ペトリ皿の底を上に向けて氷の中に入れます。ペトリ皿の底にろ紙(≥3 cm2)を置き、2〜3 mLの切断液で飽和させます。
    注:記載されている実験では、コンプレッショントームビブラトームを使用して、350μM傍矢状小脳スライスをスライスします。コンプレッショントームでは、スライス用の組織を、周囲の細い金属チューブにフィットするプラスチック製の標本チューブに接着します。スライス中、試料チューブは金属チューブに押し込まれ、金属チューブは固定されたままになります。組織を検体チューブに接着した後、組織を温めた2%アガロースに包埋します。コンプレッショントームのブレードは、ビブラトームのアームに取り付けられた固定ホルダーに接着されます。他のタイプのバイブラトームは、温めたアガロースに組織を埋め込む必要はありませんが、記載されている実験でも同様にうまく機能するはずです。
  4. また、氷の中に、片刃のカミソリの刃と、切断液で満たされた小さな(10 mL)ビーカーを置きます。温めたアガロースを検体チューブに加えた後、急速に冷却するために使用される冷却ブロックと、氷上で冷やした切断溶液で満たされた30 mLのシリンジを保管してください。30 mLシリンジが、ルアーロックメスベースを備えた針(≥26 G)に接続された静脈内(IV)チューブの30〜60 cmセクション(ルアーロックオステーパー経由)に接続されていることを確認します。
  5. 残りの切断液を-80°Cの冷凍庫に入れます。この切断液がスラッシュした氷の粘稠度になったら(20〜25分)、-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置きます。
  6. 5〜8週齢の成体マウスに、1 mL / kgのケタミン(10 mg / mL)/キシラジン(0.25 mg / mL)カクテルの腹腔内注射で麻酔します。
  7. 0.5 gのアガロースを25 mLの切断液に溶解して、2%のアガロース溶液を作ります。動物が麻酔された後(つま先のつまみに反応しない)、2%アガロース溶液を加熱し(電子レンジで~30秒)、温めたアガロース溶液を40°Cのウォーターバスに移します。
    注:1.8〜1.18の番号が付けられたステップは、加温したアガロースが固まる前に、緊急に完了する必要があります。
  8. 動物の手足をテープで手術台に固定します。はさみを使用して動物の胸腔を開き、肺や腹部臓器が切断されないようにします。ロック鉗子または止血剤を使用して胸郭を開き、心臓を露出させます。これを達成するには、鉗子を胸骨にロックし、動物の前方に向かって慎重に置きます(ツールの指の穴は動物の頭の横にあります)。
  9. 30 mL シリンジに接続された針を左心室に挿入し、鉗子を使用して針の周りの組織を圧迫し、針を左心室内腔内に保持します。外科用はさみを使用して、右心房に小さな切り込みを入れ、25 mLの冷やした切断液で動物を急速に灌流します。
    注: 灌流液が左心室に入り、右心房から出て、動物の循環器系から血液が除去されるようにしてください。
  10. 灌流が完了したら、すぐに動物の首を切り、頭の正中線に沿って頭皮をブレグマに向かって切断して頭蓋骨の表面を露出させます。
  11. はさみを使用して、頭蓋骨の後部から結合組織を取り除き、余分な脊髄組織を除去して、脊髄が大孔から突き出ていないことを確認します。
  12. 1つのハサミの刃を大孔に置き、頭蓋骨の円周に沿って両側頭面をブレグマに向かって切り、ブレグマに頭蓋骨組織を残します。
  13. はさみの刃または細い鉗子の半分を大孔に入れ、頭蓋骨を脳から分離して上に持ち上げます。頭蓋骨を持ち上げるときにはさみの刃や鉗子を脳に押し込まないように注意してください。
  14. へら手術器具を使用して脳の下(前部から)すくい取り、脳が移動するときに小脳を保護するように注意しながら、冷やした切断液が入った10mLのビーカーに脳を慎重に取り出します。この段階で清潔な手袋に着替えてください。
  15. ビーカーから脳を慎重に取り外し(へらツールを使用して)、ろ紙(ペトリ皿の上)の上に置きます。片刃の刃を使用して、正中線から数ミリメートルの矢状傍軸に沿って切断します。小さな矢状傍切片組織を廃棄します。前脳の途中(小脳の前方)に2回目の冠状カットを行います。小脳の前方にある冠状に切断された組織を廃棄します。
  16. 片刃を前脳の前部の下に滑り込ませ、持ち上げて残りの組織を回転させ、最初の矢状傍切断の側面が下を向くように(濾紙の上)、切断されていない小脳半球が上を向くようにします。
  17. 試料チューブを氷の中に直立させ、チューブ表面に瞬間接着剤(シアノアクリレート接着剤)の薄層を追加します。90°曲げたスパチュラツールを使用して、組織の向きを維持しながら、脳組織をろ紙から検体チューブの表面に慎重に移します。切断されていない小脳半球が上を向いたままであることを確認してください。組織を標本チューブに配置/接着したら、金属チューブを上にスライドさせて脳組織を取り囲みます。
  18. 電動10 mLピペットを使用して、検体チューブに温めたアガロースを充填します(脳組織を埋め込みます)。冷却ブロックを金属チューブの周りに~30秒間クランプすることにより、組織(温めたアガロースに埋め込まれている)を急速に冷却します。
  19. 試料チューブをビブラトーム浴槽に入れ、スラッシュ切断液を浴槽に充填します。脳組織のスライス中に切断液を連続的に散布しますが、小脳スライスを気泡に直接さらさないでください。
  20. 300〜350μmの傍矢状スライスを切断し、すぐに各スライスをスパージした室温ACSFで満たされたスライス保持チャンバーに移します。すべてのスライスがスライスチャンバーに入れられたら、スライスチャンバーを33°Cのウォーターバスで25分間インキュベートします。
  21. ウォーターバスで25分間後、スライスチャンバーを(再び)室温に置き、少なくともさらに35分待ってから、小脳スライスのいずれかからパッチ記録を試みます。

2. 動的クランプにおけるマルコフベースのコンダクタンスモデルの構成

注:ダイナミッククランプは、モデル化されたコンダクタンスを生細胞にリアルタイムで適用することです。メンブレン電圧は鋭い電極またはパッチ電極を介して記録/サンプリングされ、デジタル化された信号はダイナミッククランプソフトウェアに送信され、適用されるイオンコンダクタンスモデルを使用して、サンプリングされた電圧に適したダイナミッククランプ電流注入が計算されます。計算されたダイナミッククランプ電流注入信号は、アンプとヘッドステージに送信され、(電極を介して)セルに注入されます。膜電圧の高速過渡変化を駆動する活動電位を発射するセルにモデル化されたコンダクタンスを適切に追加するには、電圧サンプリング周波数が十分に高くなければならず、電圧サンプルと動的クランプ電流注入の間の遅延(レイテンシーと呼ばれることもあります)は最小で不変である必要があります29。

  1. 動的クランプ実験の前に、動的クランプ実験で使用するイオンコンダクタンスの数学的モデルを開発または取得します。これらのモデルは、マルコフ運動状態モデル、ホジキン・ハクスリー (HH) モデル、または受動 (線形) コンダクタンスの形式にすることができます。選択したコンダクタンスモデルが、意図したイオンコンダクタンスの速度論的および電圧依存性を正確に再現することを確認します。
    注:実験者は、動的クランプ実験で使用する前に、モデル化されたコンダクタンスを電圧クランプシミュレーション研究でテストすることにより、モデル化されたイオンコンダクタンスの特性を(インシリコ)確認することができます。マルコフ運動状態モデルとHHコンダクタンスモデルの重要な特性と考慮事項については、ディスカッションセクションで説明されています。以下の手順では、ダイナミッククランプソフトウェアでマルコフコンダクタンスモデルを設定する方法について説明します。
  2. 動的クランプ実験で使用するコンダクタンスモデルのマルコフ状態遷移図を作成または取得します。この図を使用して、ダイナミッククランプソフトウェア(後述)内でマルコフコンダクタンスモデルを正確に組み立てます。
    注:SutterPatchは、dPatchアンプデータ収集ソフトウェアです。動的クランプ実験はソフトウェア内で実行でき、電流クランププロトコル中に電流注入を介してモデル化されたコンダクタンスを組み立てて適用できます。マウスプルキンエニューロンからのNav電流測定に基づく、モデル化された電位依存性ナトリウムコンダクタンスのマルコフ状態遷移図を 図1Aに示します。このモデルは、Ransdell et al., 202230 によって開発され、プルキンエ ニューロンの発火における持続的および復活するナトリウム電流成分の役割を調査するために使用されてきました31。ゲート状態(C、IC、IF、IS、およびO)は、変数(つまり、S0、S3、S1、S4)で示される遷移速度定数によって相互接続されています。このモデルは代表的な動的クランプ実験で使用されており、GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa からダウンロードできます。
  3. データ収集ソフトウェアで、ダイナミッククランプエディタのSutterPatchタブからダイナミッククランプエディタウィンドウを開くか、ダッシュボードウィンドウ>対応するアイコンをクリックします。ダイナミック・クランプ・エディタ・ウィンドウの一部を図1Bに示します。
    注:ダイナミッククランプエディタウィンドウには、電流クランプ記録プロトコル中にモデル化されたコンダクタンスを適用するために必要なすべての設定が含まれています。コンダクタンスプールインターフェース(図1B、左上)を使用すると、ユーザーはモデルコンダクタンスのグループを整理し、同時にロードできます。
  4. コンダクタンスプールインターフェイス(図1B、左上)で、[新規]をクリックし、必要に応じて名前を付けてプールを作成します。コンダクタンスプールを選択したら、ヘッドステージセレクターインターフェイスのウィンドウの右側(図1B、左下)で、それぞれのコンダクタンスプールのモデルタイプ(モデル-マルコフ、ホジキン-ハクスリー、可変コンダクタンスなど)と、ルーチン/プロトコル中(アクティブモード)など、モデルコンダクタンスを適用するタイミングを選択します。ヘッドステージセレクタインタフェースでは、ダイナミッククランプの更新レート(kHz単位)と電圧信号源(図1B、右を参照)を選択することもできます。[電圧信号源] で、電圧信号を録音しているヘッドステージを選択します。
  5. ヘッドステージセレクタパネルで、ナビゲーションコンダクタンスマルコフモデルの例(図1A)で、モデルにマルコフモデル、アクティブモードにスイープ中、更新レートに200kHz、電圧信号源にヘッドステージ1を選択します。AuxOUT1への適用信号とコマンド信号をチェックして、電圧信号に応答してモデル計算を開始し、それぞれ電流クランププロトコルに動的クランプ電流注入を追加します(図1B、左下)。
  6. メインのダイナミッククランプエディタパネルの下には、状態マトリックスがあります(図1C、下)。最初にヘッドステージセレクターインターフェイスで[モデルパラメータの編集]をクリックして、状態行列を編集します(図1B、左下)。エディタの横に、動的クランプマルコフモデルパラメータという新しいウィンドウが表示されます。このパネルに、マルコフモデルのコンダクタンスを表す状態行列方程式を入力します。
  7. [ チャネル設定 ]パネル(図1B、右上)で、保存したコンダクタンスモデルを適用する(ダイナミッククランプ)を選択します。または、空のチャネルを選択して、新しいモデルコンダクタンスの作成を開始します。このパネルの右側に、 V反転 (モデル化されたコンダクタンスイオン反転電位)を入力します。ナトリウムコンダクタンスを利用した研究では、ACSFとパッチ電極内部溶液に基づいてナトリウムの反転電位を反映するために55.0mVを入力します。
  8. また、 チャネル設定 パネルで、選択したコンダクタンスの運動状態の数を指定します( 図1B、右上の赤いボックスを参照)。ここでは、モデル化されたコンダクタンスの9つの運動状態を反映するために9を入力します( 図1Aを参照)。
  9. [チャネル設定]パネルの下には、[状態方程式]パネルがあります。状態遷移速度定数方程式をゲート状態行列に適切に配置して、マルコフモデルのトポロジー配置を反映します。「状態方程式」パネルに方程式を入力し、「S0」から始まるIDを指定します(図1B、中央)。
    注:これらの方程式が入力される順序は、マルコフモデルのトポロジーを反映するためにこれらの変数が ゲート状態行列 に適切に入力されている限り、重要ではありません。
  10. 現在定義されている速度定数変数をゲート状態行列に入力するには、[状態方程式]パネルの右側にある[状態行列の編集]をクリックします(図1B、中央)。各運動状態には、0から始まる番号が与えられます。たとえば、状態 X と Y を含む 2 つの運動状態モデルの場合、これらの状態は "0" と "1" と呼ばれ、2 つの遷移速度定数 a1 と b1 が含まれ、a1 は 0 から 1 に遷移し、b1 は 1 から 0 に遷移します。
  11. 状態行列エディタ(図1B、下)を使用してこれらの方程式を適切に接続するには、0から始まる番号付きの行と列を含むテーブルに速度定数を入力します(図1Cの例を参照)。
    注: ある状態から別の状態への移動は、このテーブル内での「行から列へ」の形式での位置によって決まります。たとえば、ステップ 2.1 の 2 状態モデルの例では、状態 0 から状態 1 への遷移は、行 0 の列 1 に配置される速度定数 "a1" に依存しています。遷移速度定数 "b1" は状態 1 から状態 0 への遷移を駆動するため、速度定数は行 1、列 0 に配置する必要があります。 図1Cでは、ゲーティング状態行列の例に、 図1Aに示すNavコンダクタンスモデルのトポロジーを反映する速度定数があります。たとえば、「S0」は、IC1 から IC2 の運動状態への遷移を定義する速度定数です。したがって、「S0」は ゲーティング状態行列 の行0、列1に配置されます(図1C)。次に、各速度定数の変数を定義する遷移速度定数方程式が塗 りつぶされた状態行列 に入力されます(図1C、下)。
  12. 速度定数方程式が状態行列エディタパネルを介して接続されると、接続(対応する行と列)が方程式の横の接続パネルに入力されます(図1B、右中央)。図1Cの行と7列目(上の赤いボックス)に追加された代表的なナトリウムコンダクタンスモデル(図1A)のオープン/導電状態に注意してください。
  13. 図1B(右下)では、コンダクタンス方程式(nS)パネルを使用して、ダイナミッククランプ中に加えられるモデルコンダクタンスの振幅を定義します。マルコフモデルで開放/導電状態を選択し、コンダクタンス値を指定します(図1B、下部、赤いボックス)。
  14. この実験では、「G7」ボックスに「400 nS」と入力すると、マウスプルキンエニューロンの電圧クランプ研究で測定されたピークNav電流に類似したピークNav電流値が加算されます。
  15. 上記の手順が完了したら、[ ロード] をクリックして、電流クランプルーチンが開始されたら、動的クランプ適用用にモデルを準備します。
  16. 同様のプロセスを使用して、HH モデルを配置します。ただし、方程式を追加して、独立したゲート状態( ゲート方程式)とG 最大値のコンダクタンスを定義します。
  17. 動的クランプコンダクタンスを適用するには、まずルーチンエディタを使用して電流クランプルーチンを作成します(ルーチンエディタ>SutterPatchタブをクリックします)(図1D)。電流クランプ ルーチンを作成するには、親出力チャネル (この例では StimOut1) を選択します。これにより、ユーザーがルーチン中に現在のコマンド出力を定義できるパネルが開きます。ルーチン・エディターで記録モードがCC_Modeに設定されていることを確認します。
    注:代表的な実験では、このプロトコルは自発的に発火するセルで動作するため、電流注入がゼロのギャップフリー電流クランプルーチン/プロトコルが使用されます。
  18. ルーチンエディタの入力チャンネル(図1D、右上)で、実験中に記録されたスコープウィンドウに入力される入力信号を定義します。これらの入力には電圧信号が含まれ、ルーチンのコマンド電流注入と、それぞれCurrent1とAuxIN1と呼ばれる動的クランプ電流注入も含まれている必要があります(図1D、左下)。
  19. 正または負の電流注入コマンドを含む電流クランプルーチンの場合、コマンド電流注入信号は動的クランプ電流信号と自動的に組み合わされます。仮想スコープウィンドウを作成してコマンド電流信号を減算し、分離された動的クランプ電流注入の記録があります。新しい仮想スコープ ウィンドウを作成するには、まず [Virtual1] チェック ボックスをオンにして、追加の入力チャネルを選択します。
  20. ルーチンエディタの「数学タイプ」で「数式」を選択し、電流クランプルーチンのコマンド入力信号(この例ではCurrent1)を選択します(ソースチャネル)。開いたフィールドに方程式を入力して、動的クランプ電流注入信号から電流クランプコマンド信号を減算します。
    注:この実験例では、これは方程式 t[3]-t[2]を使用して行われます。 Virtual1 スコープ ウィンドウに、ダイナミック クランプ電流注入 (電流コマンド信号から分離) が表示されるようになりました。ユーザーは、[ ラベル] をダブルクリックして、入力または出力チャネルのラベルをカスタマイズできます。

3. 傍矢状小脳スライスにおけるマウスプルキンエニューロンからの電流クランプ記録の取得

  1. 電気生理学リグに、生理学的温度(34〜36°C)近くに温められたACSFで(重力)灌流された組織スライスチャンバーを装備します。傍矢状小脳スライスをスライスチャンバーに慎重に置き、スライスハープを使用して小脳スライスを水没して固定した位置に維持します。塩化接地電極と温度プローブも小脳スライスチャンバー内に沈められ、安定していることを確認してください。
  2. 40倍浸漬対物レンズを使用してプルキンエニューロン層を見つけます。プルキンエニューロンは大きく、涙滴型です。健康なプルキンエ細胞の原形質膜は通常滑らかに見え、核は見えません。
  3. 健康なプルキンエニューロンが特定され、パッチクランプ記録の標的となったら、顕微鏡の対物レンズを上方に調整します。電極ホルダーとヘッドステージに取り付けられたガラス微小電極の先端に位置を合わせ、焦点を合わせます。ヘッドステージ/マイクロ電極は、3軸ロボットマイクロマニピュレーターで制御します。
    注:これらの実験では、微小電極の抵抗値が2〜4MΩであり、適切な電流クランプ内部溶液で満たされていることを確認してください。代表的な実験で使用される内部溶液には、144 mM K-グルコン酸塩、0.2 mM EGTA、3 mM MgCl2、10 mM HEPES、8 mM NaCl、4 mM Mg-ATP、および0.5 mM Na-GTPが含まれています。
  4. 標的プルキンエニューロンに近づく前に、電極ホルダー圧力ポートに2〜3 mLの陽圧を追加します。
  5. アンプのコントロールパネルでVCモードに切り替え、電極補償と電極電圧オフセット機能を適用します。この例では、電極補償オプションと電圧オフセットオプションの横にある 自動 をクリックしてこれを行います。
  6. 連続メンブレンシールテストプロトコルを開始します( [メンブレンテスト]をクリックします)。メンブレンテストパラメータを5mVまたは10mVステップで5msスイープ(またはそれに近い)で設定します。保持電位(V保持)を0mVに設定します。
  7. 微小電極をターゲットセルに向かって動かし、焦点面を調整して、電極の先端またはその少し下に焦点を合わせます。電極を標的細胞の原形質膜の少し上に配置します。マイクロマニピュレーターと電極先端からの陽圧を使用して、標的細胞体から細胞外の破片を押しのけ、表面膜を「洗浄」します。
  8. 標的細胞に細胞外の破片がなくなったら、軸索が細胞体から伸びるプルキンエニューロン体細胞の広い端の膜の表面近くに電極をゆっくりと配置します。電極の先端を膜に下げると、膜表面にディンプルが見えるようになります(電極の正圧により)。この時点で、陽圧を解放し、口吸引を使用して少量の陰圧を加えます。
  9. アンプのコントロールパネルで、V保持電位を(0mVから)-80mVに変更します。メンブレンシールテストを監視し、ピペット抵抗が1GΩ≥に達したら、負圧を上げ、メンブレンシールテストパネルのZap機能をクリックしてメンブレンを破裂させ、全セルパッチクランプ構成を実現します。
  10. 簡単な電圧クランププロトコルを使用して、アンプのコントロールパネルを介して電流 クランプモードに切り替える前に、メンブレンの受動特性(静電容量と入力抵抗値)を測定します。
  11. 電流クランプモードに切り替えた後、ブリッジバランス補償を70%≥に適用します。
  12. パッチ電極でダイナミッククランプコンダクタンスを印加する前に、接合電位誤差(電極内部溶液とACSF溶液の組成に基づいて計算される)を補正します。代表的な実験の解については、17.5 mV の接合電位補正を適用します。動的クランプ研究では、正確な電圧信号をコンダクタンスモデルで使用して動的クランプ電流注入を計算するために、正確な接合電位補正が重要です。

4. ダイナミッククランプコンダクタンスの適用

  1. プルキンエニューロンは反復活動電位を自発的に発火するため、モデル化されたイオンコンダクタンスを加算(または減算)する前に発火特性を記録して、細胞の健康状態をテストし、膜興奮性のベースライン特性を測定します。ダイナミック クランプ設定ウィンドウの荷重をクリックして、モデル化されたコンダクタンスを適用します。これで、小さなDynCラベルがdPatchコントローラにCCをオーバーレイして表示されます(図1D、赤いボックスを参照)。
  2. ダイナミッククランプがオン/ロードされると、電流クランプルーチン/プロトコルがアクティブな間、ダイナミッククランプコンダクタンスが自動的に適用されます。 AuxIN1 で選択した入力信号に対応するスコープウィンドウでダイナミッククランプ電流注入を表示します。
    注:動的クランプ媒介コンダクタンスの適用と適用なしの自然発火の交互記録は、適用されたモデルコンダクタンスが興奮性にどのように影響するかを判断し、興奮性のベースラインレベルが実験全体を通して安定している/一貫しているかどうかを判断するために重要です。

結果

提示された実験では、動的クランプを使用して、モデル化された電位依存性ナトリウム(Nav)コンダクタンスを、傍矢状小脳スライス調製で急性に単離された成体(6〜7週齢)マウス小脳プルキンエニューロンに適用します。この研究は、野生型(対照)マウスおよびトランスジェニックマウスで実施され、Cre-loxP組換えを使用して、小脳プルキンエニューロンから結節性硬化症1(Tsc1)を選択的に削除します。結節性硬化症複合体 (TSC) は、TSC1 または TSC2 の機能喪失変異によって引き起こされる多系統障害です 32,28,33。TSC 患者は一般的にてんかん障害、認知障害、自閉症スペクトラム障害と診断されます34,35。プルキンエニューロン特異的Tsc1欠失(ここではTsc1mut / mutと呼ばれる)を持つマウスは、運動機能、社会的相互作用行動、発声の障害、ならびに誇張された反復行動を含む、いくつかのASD関連の行動表現型を示します9,36。Tsc1ミュート/ミュートプルキンエニューロンは、活動電位の発火を減衰させることも示されており(図2A、B)、これは、Tsc1mut / mutプルキンエニューロンの軸索初期セグメントでのNav電流振幅(図2C)の有意な減少に関連しています8。Tsc1mut/mutプルキンエニューロンのNav電流は、野生型プルキンエニューロンと同様の速度論的および電位依存性を持っています8。このトランスジェニックTsc1mut/mutマウスモデルでは、動的クランプを使用して、Tsc1mut/mutプルキンエニューロンにNavコンダクタンスを追加することで反復発火を救うことができるかどうかをテストしました。次に、野生型プルキンエニューロンでNavコンダクタンスを差し引くと、Tsc1mut / mutプルキンエニューロンで測定されたプルキンエニューロンの発火に同様の減衰が生じるかどうかをテストします(図2B)。ネイティブに表現されたナビゲーションコンダクタンスを差し引くために、ダイナミッククランプを使用してナビゲーションコンダクタンスを適用しました。ただし、コンダクタンスの極性は逆になります。

プルキンエニューロンのNavコンダクタンスをシミュレートするために使用されるマルコフ運動状態モデル(図1A)には、9つの運動状態が含まれており、そのうち8つは非伝導性であり、閉じた状態(C1、C2、およびC3)、不活化-閉じた状態(IC1およびIC2)、高速不活化(IF1およびIF2)、および低速不活化(IS)としてラベル付けされています。1つの開放/伝導(O)運動状態30,31がある。標識された運動状態(図1A)の間に示される遷移速度定数は、各運動状態を占めるシミュレートされたチャネル/コンダクタンスの割合を決定します。膜電圧は、モデルの各速度定数に影響します。シミュレートされた電圧クランプ実験でこのモデルによって生成されたシミュレートされたナビゲーション電流(インシリコ)は、急性に孤立したプルキンエニューロンから測定されたナビゲーション電流の右側に(赤で示されています)黒で示されています(図1A、下)。これらのシミュレートされた(赤)およびプルキンエニューロン(黒)Nav電流を呼び起こす電圧コマンドは、電流トレースの上に黒で示されています。電圧コマンドでは、最初の脱分極ステップ(0mVまで)により、高速過渡の内向きナトリウム電流が発生し、シミュレートされたトレースでは、非導通性の閉状態から開動運動状態に移行するチャネルを反射し、開状態のチャネルが高速不活性化(IF1およびIF2)運動状態に蓄積する前に、短い内向き電流が発生します。この脱分極電圧ステップは短時間(5ms)であり、膜電位はその後-45mVの中間再分極電圧にステップアップされ、電位は80ms保持されます(図1A、下)。この再分極電圧ステップ中に、復活ナトリウム電流 (INaR) と呼ばれる電流成分である内向きのナトリウム電流が復活していることは注目に値します。この -45 mV までの 80 ms ステップ中に、INaR は振幅の (INaT と比較して) ゆっくりとした減衰を示し、最終的には持続 Nav 電流成分 (INaP) である内向き電流の定常状態に達します。膜再分極中のモデル化されたINaR(図1A、下、赤)の活性化は、高速不活化(IF1 + IF2)速度論的状態から開放/伝導状態に回復するシミュレートされたチャネルを反映しています。時間の経過とともに(-45mVで保持)、開放状態を占めるシミュレートされたチャネルの一部は、INaRの減衰として反射される吸収の遅い不活性化(IS)運動状態に蓄積し、これらのチャネルの一部は、定常状態のINaP電流成分30,31として反映される、開放/伝導状態のままである。

代表的な実験/結果では、Navマルコフコンダクタンスモデル(図1A)を、急性に単離された小脳スライスの成人プルキンエニューロンに追加しました。この実験セットアップの漫画の描写を 図3Aに示します。ダイナミッククランプ電流注入を介してモデル化されたNavコンダクタンスを適用するために、アナログからデジタル(A/D)およびデジタルからアナログ(D/A)への変換を完全に統合したdPatchアンプシステム( 図3Bを参照)を使用しました。このシステムは、統合されたARMコアプロセッサ(PCの外部)を介して信号変換も処理し、入力信号とフィードバック(出力信号の送信)を電流注入電極27にほぼ瞬時に処理することを可能にする統合FPGA(フィールドプログラマブルアレイ)回路を備えています。ここでの実験では、複雑なマルコフコンダクタンスモデルを(ダイナミッククランプで)適用し、最大500kHzの電流注入更新レートで適用することができました。

ギャップフリー電流クランプ記録中にシミュレートされたNavコンダクタンス(400 nS)を Tsc1ミュート/ミュート プルキンエニューロンに追加すると、細胞の反復発火周波数が明らかに増加し(図3C1、 D1)、これらの細胞にNavコンダクタンスを追加すると、 Tsc1ミュート/ミュート プルキンエニューロンの興奮性の欠損を救うのに十分である可能性があることを示していますが、 Tsc1ミュート/ミュー トで報告された欠損の全レパートリーは調製しませんでしたプルキンエニューロンの興奮性8. 図3C2 (上)に示されている代表的な痕跡から明らかなように、野生型プルキンエニューロンは、高周波で反復活動電位を発火する固有の能力を持っています。ダイナミッククランプを使用して、モデル化されたNavコンダクタンスを逆(負の)極性(-400 nS)で適用することにより、野生型プルキンエニューロンからモデル化されたNavコンダクタンスを差し引きました。モデル化されたNavコンダクタンスを差し引くと、反復発火が即座に明らかに減少し(図3C2、下)、これは、 Tsc1mut / mut プルキンエニューロンで測定されたNav電流の減少が、これらの細胞で測定された減衰した発火特性に寄与するという仮説とも一致しています8。いくつかの Tsc1ミュート/ミュート または野生型プルキンエニューロンにわたって、Navコンダクタンスをそれぞれ加算または減算したこれらの動的クランプ実験は、発火周波数に一貫した効果をもたらしました。Navコンダクタンスを有意に追加すると(P = 0.029)、 Tsc1mut / mut プルキンエニューロンの発火頻度が増加し(図3D1)、野生型プルキンエニューロンでは、Navコンダクタンスを有意に減算すると(P = 0.031)、発火頻度が減少しました(図3D2)(スチューデントの対応のあるt検定)。

figure-results-1
図1:ダイナミッククランプソフトウェアでのマルコフモデルの設定。 (A)マウス小脳プルキンエニューロン30で測定されたNavコンダクタンス特性を再現するモデルについて、マルコフ状態遷移図を示します。このモデルには 9 つの運動状態が含まれています。これらのうち、8つは非導電性状態です:3つの閉鎖(C)、2つの不活化-閉鎖(IC)、2つの高速不活化(IF)、および1つの低速不活化(IS)。このモデルには、伝導している1つの開(O)運動状態が含まれています。隣接する運動状態間では、時間の経過に伴う遷移する接続/状態占有は、S0-S15 として示される遷移速度定数によって定義されます。各運動状態には数値(赤)も割り当てられており、これによりユーザーはマルコフモデルとその運動状態トポロジーを ゲーティング状態行列 で定義できます(後述のパネル Cに示されています)。 (B)ユーザーがSutterPatchダイナミッククランプエディタで操作するパネル/グラフィカルインターフェイスが表示されます。これらのダイナミッククランプエディタパネルの配置は、ダイナミッククランプソフトウェア内に表示される配置と一致していないことに注意してください。また、ダイナミック クランプ エディタに関連付けられているすべてのパネルが表示されるわけではありません。(C)(上のパネル)ゲーティング状態行列の例は、パネルAに示した状態遷移図のトポロジーに対応する変数を入力したゲーティング状態行列の例を示しています 。 ゲート状態行列の赤いボックスは、モデルの開いた(O)運動状態に対応する行と列7を強調表示します。7列目には、開放(O)運動状態への遷移を定義するすべての速度定数がリストされ、7行目には、開放(O)運動状態を終了する遷移を定義するすべての速度定数がリストされます。この構成では、ゲート状態行列は、モデルの運動状態の数、速度定数変数、およびトポロジー (運動状態間の相互接続) を記述します。(D)に示されているのは、動的クランプコンダクタンスモデルのロードに関連するSutterPatchパネル/ユーザーインターフェイスと、現在のクランプルーチンの作成に関連するインターフェイスです。これらのモデルとのユーザー対話については、プロトコルのステップ 2.17-2.20 で説明されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:Tsc1ミュート/ミュートプルキンエニューロンは、野生型コントロールと比較して膜興奮性が減衰しています。(A)野生型(上、黒)およびTsc1ミュート/ミュート(下、青)プルキンエニューロンからの全細胞電流クランプ記録は、Tsc1変異細胞における発火の減衰を明らかにします。(B)野生型対照と比較して、Tsc1ミュート/ミュートプルキンエニューロンの発火頻度の低下は、細胞間で一貫しています。Tsc1mut/mutプルキンエニューロンの平均(±± SEM)自然発火頻度は、野生型細胞と比較して有意に低い(P < 0.0001)低い(ウェルチの対応のないt検定;対照N = 13、n = 32;Tsc1mut/mut N = 6、n = 21)。(C)成人プルキンエニューロンにおけるNav電流の電圧クランプ測定は、野生型対照と比較して、Tsc1ミュート/ミュート細胞では平均(±±SEM)高速過渡Nav電流(INaT)ピークが有意に減少していることを明らかにしました。(P = 0.007、RM二元配置分散分析;野生型コントロール:N = 6、n = 22、黒;Tsc1mut/mut: N = 6、n = 16、青い四角形)。例 INaT レコードは、-35 mV の脱分極ステップによって誘発され、パネル C の右側にはめ込みパネルとして示されています。 以前にBrown et al.8に掲載されたデータ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:ダイナミッククランプを使用して、プルキンエニューロンの興奮性に対するイオンコンダクタンスの影響を決定します。 ダイナミッククランプでは、膜電圧を(記録電極を介して)サンプリングし、サンプリングされた電圧に基づいてモデルコンダクタンスの電流出力を計算します。計算された電流は、電流注入電極を使用して生体細胞に印加されます。パネル(A)は、この実験的な配置を示しています。電圧サンプリングが十分な周波数で実行され、電圧サンプリングと計算された電流の印加の間の遅延(遅延)が最小限である場合、この手法を使用して、モデル化されたコンダクタンスの加算または減算がニューロンの発火と膜興奮性にどのように影響するかを評価できます。(B)代表的な実験では、SutterPatchソフトウェアとdPatchアンプシステムを使用してダイナミッククランプ記録が取得されました。 dPatchは、外部信号プロセッサと完全に統合されたデジタイザーを備えたパッチクランプアンプであり、ダイナミッククランプ記録に適しています(説明を参照)。(C)ダイナミッククランプを使用してモデル化されたNavコンダクタンスの400nSを加算または減算する前後の、自発的なプルキンエニューロン発火の代表的な現在のクランプ記録( 図1Aに示す)。C1(左)では、発火が減衰した Tsc1mut/mut プルキンエニューロンからの記録です。400 nS Nav コンダクタンスを追加すると、このセルの発火周波数が明らかに増加します。あるいは、C2では、記録は野生型プルキンエニューロンからのものです。この実験では、モデル化されたNavコンダクタンスを逆極性(-400nS)で印加することで、Navコンダクタンスが減算され、繰り返し発射周波数が明らかに減少します。灰色で示されている動的クランプ電流注入記録は、黒で示されている活動電位発火(電圧)記録の下に示されています。(D)これらの動的クランプ実験の結果は、 Tsc1mut/mut プルキンエニューロン(D1、n = 3)にNavコンダクタンスを追加した後、または野生型プルキンエニューロン(D2、n = 3)からNavコンダクタンスを差し引いた後の自発発火周波数の変化として提示され、Tsc1mut/mut (P = 0.029)および野生型(P = 0.031)セルをそれぞれ(対応のあるスチューデントのt検定)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

小脳回路は固有受容感覚と運動制御で機能しますが37,38ですが、社会的相互作用や感情処理などの複雑な行動にも重要です39,40,41。小脳の構造と機能の病理は、多くの場合、ASD 42,43,44,45,46 に関連しています。小脳回路47の単純な構造とASDの病理における小脳の明確な役割により、小脳はASD行動障害の分子的および細胞的要因、および潜在的な治療法を調査するための魅力的な脳領域となっています。動的クランプ電気生理学は、これらの調査に重要なツールを提供し、研究者がイオンチャネル特性/イオンコンダクタンスのASD関連の変化と小脳ニューロンの発火との間の因果関係を直接テストできるようにします。動的クランプ法は、ニューロンの興奮性におけるASD関連の変化の調査に特に適していますが、この手法は、興奮性膜を持つ細胞に影響を与えるさまざまな病理学的メカニズムの調査に関連しています。さらに、動的クランプは、ニューロンと筋肉細胞が適切な活動電位の発火を調節および維持する複雑なプロセスを分析するための優れたツールであり続けています。

動的クランプ実験を正確に実行するには、技術的パラメータを慎重に制御する必要があります。具体的には、実験者は、電圧サンプリングと電流注入の間の遅延の潜在的な変動(ジッター29と呼ばれることが多い)の結果、および電極の受動特性、スペースクランプの制限、および調査中の実験準備の生理学的忠実度を知り、理解する必要があります。Bettencourt et al. (2008)48 および Butera et al. (2001)29 は、フィードバック レイテンシーがサンプリング間隔の 25% (≤ 5 μs) 未満に理想的に維持され、高速イオン コンダクタンスを正確にキャプチャするには、少なくとも 50 kHz の高いサンプリング レートを達成することが重要であることを以前に示しました。商用システム、特に Windows ベースのプラットフォームによって報告される公称サンプリング レートは、誤解を招く可能性があります。したがって、独立した性能検証が必要になることが多く、これについてはMilescu et al. (2008)25およびClausen et al. (2012)49によってより詳細に議論されています。特に複雑な形態と非等電位膜特性を持つ無傷のニューロンを扱う場合は、スペースクランプの制約も考慮する必要があります。たとえば、AIS などの統合部位の遠位にある電極でコンダクタンスを印加 (または差し引く) とすると、印加されたコンダクタンスの効果が不正確に描写されます。電極抵抗が不十分(高い)、静電容量補償が不十分、および/または接合電位誤差の補正の失敗も、電圧測定値(入力信号)の誤表示を引き起こし、その結果、モデル化されたイオンコンダクタンス50,51の誤った適用を引き起こす可能性があります。

何千ものマルコフモデルとHHモデルは、それぞれHuman Brain ProjectとThe Laboratory of Neural Microcircuitryによって支援されているModelDB52やChannelpedia53などのオンラインデータベースで研究者に無料で利用できます。これらのデータベースには、主にNEURON、MATLAB、またはPythonで記述されたシナプスコンダクタンス、イオンチャネルコンダクタンス、およびコンダクタンスベースのニューロンモデルのモデルが含まれています。データベースファイルには通常、必要なモデル方程式と、モデルに情報を提供した細胞の種類や実験に関するその他の情報が記載されています。

マルコフ コンダクタンス モデルと HH コンダクタンス モデルの両方に、導通 (チャネルの開/アクティブ化のシミュレーション) と非導電性 (チャネルの閉のシミュレーション) のゲーティング状態/変数が含まれています。ただし、これらのモデルタイプは、サンプリングされた各電圧でのコンダクタンス値の計算方法が異なり、マルコフモデルはより多くの計算能力を必要としますが、シミュレートされたチャネルのゲート特性をより詳細に提供します。例えば、HHモデルでは、導通状態と非導通状態は独立変数であり、それぞれがそれぞれの状態54,55の電圧入力およびゲーティング速度論によって決定される。マルコフモデルとは対照的に、HHモデルは、電圧依存性ナトリウムコンダクタンスモデル25において、活性化/開放運動状態から高速不活性化運動状態へのシミュレートされたチャネルの直接移行など、ゲート状態間の遷移をシミュレートまたは制約しません。これにより、HHモデルの計算複雑さが少なくなり54,55、研究者は、高いサンプリングレートと更新レートを維持しながら、複数の高速コンダクタンスHHモデルを同時に追加できます。

マルコフ運動状態モデルは、導電性または非導性の離散運動状態で構成され、これらの状態は固定トポロジーで相互接続されています。マルコフモデルシミュレーションでは、コンダクタンスは、伝導運動状態を占めるシミュレートされたチャネルの割合によって、サンプリングされた各電圧で計算されます。各運動状態を (時間の経過に伴う) 占有するシミュレートされたチャネルの割合は、状態占有がある運動状態から別の運動状態に移行する速度を制御するパラメーターである速度定数によって決定されます。速度定数の単位は逆秒 (s-1) で、単位時間あたりの遷移確率を表します。モデルによっては、速度定数値は電圧や温度などの動的要因に依存する場合があります。

マルコフモデルでは、常微分方程式を使用して、各運動状態の時間依存占有率を記述します。これらの方程式は、遷移率定数に基づいて、各状態にある確率が時間の経過とともにどのように変化するかを制御します。これは、レート行列 Q: figure-discussion-156 で表されます。上で説明したように、状態間の動きを決定する遷移速度定数(r)は、入力電圧(V)と、電圧間のコンダクタンスの速度論を反映するパラメータαとβの影響を受ける可能性があります。これらの方程式は、次のように記述することができ、figure-discussion-2、モデル56,57,58の各運動状態に出入りする接続(遷移速度定数)を含むグラフの形式で視覚的に表すことができる。マルコフモデルの開発とそのトポロジーに関する有益な議論は、Schoening and Silva (2024)56 にあります。

非線形イオンコンダクタンスがリアルタイムでモデル化され、(電流注入電極を介して)生細胞に適用される現在の形態の動的クランプの開始以来19,59、この技術の方法とリソースは進化し、マイクロコントローラベースの低コストシステム60および無料のオープンソースソフトウェア23などの革新により、ますますアクセスしやすく、費用対効果が高くなっています。25,26。Sutter InstrumentのdPatchやCytocyberneticsのCybercyteなどの商用システムは、統合されたハードウェアおよびソフトウェアソリューションを通じて動的クランプ実験の迅速な実装をさらに促進します27,61。

動的クランプの汎用性により、仮想化学的および電気的シナプスの作成、人工ネットワーク内の実際のニューロンの埋め込み(またはその逆)、仮想イオンチャネルの追加など、多様なアプリケーションが可能になります62。重要なことに、印加されたコンダクタンスの電圧依存性、速度論的特性、および振幅を迅速に調整できるため、研究者は、1つまたは複数のパラメータのスケーリングが活動電位の発火と膜興奮性にどのように影響するかを直接テストできます31。今日のシステムは、高いサンプリングレートを提供し、高速過渡コンダクタンスの正確な適用を可能にし、従来の電気生理学的機器60,63と容易に統合することができ、神経細胞の機能と機能不全の理解を進めるための理想的な方法として動的クランプを確固たるものにしている。

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

技術的な問い合わせにご協力いただいたSutter InstrumentのTelly Galiatsatos氏とJosh Stanford氏に感謝いたします。また、dPatch動的クランプ研究の開始に協力してくれたJan Dolzerにも感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CaCl2フィッシャー・ケミカルC79-500 試薬
毛細管ガラス管 ホウロシリケート 標準壁 外径1.5 mm 内径 0.86 mm 長さ 10 cmワーナー・インストゥルメンツ64-0793備品
クリーンベンチTMC63-9090E備品
コンプレストームVF-500-Zビブラトーム プレシショナリー・インストゥルメンツhttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/備品
Dell OptiPlex 7080谷間https://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffus備品
葡萄糖フィッシャー・ケミカルD16-500 試薬
dPatchアンプシステムサター楽器FG-DPATCH備品
EGTAEMDミリポア324626-25GM試薬
ヘペスフィッシャー・ケミカル7365-45-9試薬
直列ヒーターワーナー・インストゥルメンツ64-0102備品
KClフィッシャー・ケミカルP330-500 試薬
ケタミンデクラ獣医製品193.40620.3 試薬
K-グルコン酸TCIケミカルズG0040試薬
LinLabソフトウェアサイエンティフィカhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2備品
LSE 6Lウォーターバスコーニング6783備品
Mg-ATPシグマ・オルドリッチ74804-12-9試薬
MgCl2フィッシャー・ケミカル012288.A9試薬
モデルP-1000ピペットプーラーサター楽器FG-P1000備品
NaClフィッシャー・ケミカルS271-500 試薬
Na-GTPMPバイオメディカル56001-37-7試薬
NaH2PO4J.T.ベイカー02-004-220 試薬
NaHCO3フィッシャー・ケミカルS233-500 試薬
眼科ソフトウェアデジタル・オプティクス・リミテッドhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-software備品
カミソリの刃人物60-0139-CTN備品
スライスハープワーナー・インストゥルメンツ64-0255備品
SliceScope Pro 3000サイエンティフィカhttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000備品
瞬間接着剤ロックタイト8040-00-142-9193備品
SutterPatchソフトウェアサター楽器https://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatch備品
温度コントローラーワーナー・インストゥルメンツ64-2400備品
キシラジンMPバイオメディカル158307試薬

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