この記事では、ドライアイの診断と治療における in vivo 共焦点顕微鏡の操作と効果を実証し、将来の研究の基礎を提供するために in vivo 共焦点顕微鏡の応用と結果を調査します。
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この記事について
サマリー
要約
生体内 共焦点顕微鏡 (IVCM) は、その非侵襲性と高解像度で大きな注目を集めています。角膜、結膜、まぶたの縁、マイボーム腺、ニキビダニなどの寄生虫など、多数のドライアイ疾患(DED)関連の眼表面構造を細胞レベルでin vivo 観察し、客観的に定量化することができます。この機能は、眼科医が DED の特定の病因とサブタイプを特定するのに役立ち、それによって正確な診断、標的治療、予後評価が容易になります。ただし、IVCM の操作と報告のための標準化されたプロトコルは依然として不足しています。この装置を効果的に利用し、高品質のレポートを生成するには、眼科の知識と技術的な操作の両方に習熟することが不可欠です。この記事では、DED 患者の IVCM 検査の手順と微妙な違いについて詳しく説明します。これは、DED に対する最初の JoVE ステップバイステップ IVCM プロトコルです。臨床医の参考資料として機能し、業務の非効率性を回避し、臨床管理を導く高品質の角膜および眼表面画像を一貫して取得できるようにすることを目的としています。
概要
地域の医療資源の制約や患者の経済的負担により、DED の臨床診断は、多くの場合、基本的な側面 (細隙灯顕微鏡下での観察、目の乾燥やかゆみの訴えなど) または単一の指標 (侵襲的な涙液層の破壊時間、涙液分泌検査、またはマニデックスの侵入)。IVCM アプリケーションは広く利用可能ではなく、ましてやプロトコルの標準化もできません。ただし、IVCMを備えた眼科施設の場合、著者は、角膜、結膜、眼瞼縁などの欠落を避けるために、初めての患者に包括的な顕微鏡検査を受けることを推奨しています。あいまいなDEDの場合やニキビ包虫の検出の場合、IVCMは明示的な回答に特に適しています。
ドライアイ疾患 (DED) は、涙液の質または量の異常、および涙液層の安定性の低下によって引き起こされる慢性的な眼表面状態として定義されます。ドライアイワークショップII(DEWS II)では、DEDは、水欠乏性ドライアイ(ADE)、蒸発性ドライアイ(EDE)、混合ドライアイ(MDE)、ドライアイの素因、および前臨床ドライアイ状態の5つのタイプに分類されます1。Ralene et al. 2017 年から 2022 年にかけて発表された文献を含め、さまざまな種類のドライアイにおける IVCM の重要な臨床実践を要約しました2.最近の研究では、炎症が DED の病因に重要な役割を果たしていることが示されています 3,4。特に、樹状細胞(DC)密度は、全身性免疫介在プロセスに関連するDEDの優れた指標である可能性があります5。
IVCM は共焦点レーザー断層撮影技術を利用しています。水平および垂直の分解能は1μmです。デバイスの詳細な技術仕様は、Jeremy et al6 によるレポートに記載されています。眼表面検査では、IVCMが最初に角膜7に適用され、次に結膜とマイボーム腺8が適用されます。毛ダニデックス眼瞼炎は、近年、臨床的注目を集めています 9,10。IVCM は、角膜、結膜、眼瞼縁の鮮明な画像を提供します。これらの画像により、臨床医は疾患の状態を評価し、炎症細胞や免疫細胞のイメージングと定量化を容易にすることができます。
DED 評価では、角膜上皮細胞 (CEC) に焦点を当てます。上皮下神経線維(SNF);上皮間および上皮下炎症/免疫細胞;結膜杯細胞 (CGC);結膜炎症/免疫細胞;マイボーム腺腺房と開口部;毛包毛ダニダラダニダラダラ菌と短毛ダニダラダリダニダラダリ周囲の組織内の炎症細胞。マイボーム腺の機能不全は、涙液層の脂質層の分泌の減少または組成の変化につながり、涙液の蒸発が加速し、眼表面の損傷を引き起こすという病態生理学に由来します。ダニデックスの侵入は、眼のかゆみや不快感の一因となります。CGC は、重要な涙液層成分であるムチンを分泌します。それらの枯渇は、ムチン欠乏性DEDを引き起こす可能性があります。逆に、DED 自体は CEC や SNF などの眼表面構造に損傷を与え、その後、角膜および結膜組織の炎症/免疫細胞密度を上昇させます。理想的な画像を取得したら、ソフトウェアに組み込まれている定量ツールを効果的に利用して、言及された多数の細胞をカウントできます (図 1)。しかし、SNFの形態学的多様性については、定量化を支援する分析ソフトウェアに依存する必要があります11,12。
IVCM は、眼表面組織の角膜層、神経線維、炎症/免疫細胞のリアルタイム評価に不可欠です。CGC を評価するには、印象細胞診が代替方法として機能します。この技術は、杯細胞密度がピークに達する円蓋結膜を標的とし、通常IVCM測定値よりも高い値が得られます13,14。ただし、結果は染色のばらつきとオペレーターの専門知識の影響を受け、時間のかかるプロトコルは日常的な臨床実施を制限します。マイボーム腺オリフィスの閉塞は細隙灯顕微鏡で直接観察できますが、この方法では、IVCMが正確に識別する短モニダニ虫誘発性閉塞を検出することはできません。ニキラモニタビ症の侵入を診断するには、光学顕微鏡検査によるまつげ脱毛が低コストの方法を提供します。技術的には単純ですが、このアプローチには重大な制限があります:患者の不快感により複数回のサンプリングが制限され、まつげの毛包またはマイボーム腺の開口部の奥深くに生息するダニは検出されないままです15。対照的に、IVCM では、患者の不快感を最小限に抑えながら、まつげの毛包やマイボーム腺の開口部を含む複数のまぶたの縁部位を包括的に検査できます。このアプローチは、微小生息地内の寄生虫のリアルタイムのin vivo視覚化により、大幅に高い診断陽性率を達成します16,17。
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プロトコル
検査手順は漢口愛爾眼科病院の倫理委員会によって承認されており、すべての患者からインフォームドコンセントが得られています。
注: 患者選択の選択基準には、ドライアイとかゆみを訴える患者、および定期的な眼科検査を求める個人が含まれます。患者選択の除外基準には、角膜穿孔または角膜穿孔が差し迫っている患者、局所眼麻酔薬にアレルギーのある患者、若すぎる患者(例:3歳未満)または高齢すぎて協力できない患者、眼瞼裂の狭い患者まぶたの検鏡を収容できない患者、妊婦、およびその他の理由で協力できない人。簡単なワークフロー図を 図 2 に示します。そして詳細な操作手順は次のとおりです。
1. 事前審査
- 材料の準備:IVCMデバイス、角膜コンタクトキャップ、眼科局所麻酔薬、カップリング剤、医療用綿棒、まぶたの検鏡、アルコールボール、アルコールリザーバー、抗炎症点眼薬(図3)。
- IVCM装置の主要コンポーネント(ハイデルベルグ網膜断層撮影ロストック角膜モジュール(HRT-RCM))、フォーカシングノブ、モニタリングカメラ、視線誘導灯、あご当て、額当て、左右目を切り替えるボタン、HRT-RCMを三軸に動かすための回転ノブ、画像キャプチャボタンとフットペダル、専用IVCMソフトウェアを備えたコンピューター)を理解し、カップリングゲルを備えたIVCMデバイスを準備します。
- 検査官の準備:マスクを着用し、アルコールベースのジェルで手を消毒するか、使い捨て手袋を着用してください。
- デバイスの消毒:機器の額とあご当てをアルコール綿棒で拭きます。
- 手順の説明:不安を和らげるために、検査が痛みがないことを患者に簡単に説明します。
2.検査中
- コンピューター上の付属ソフトウェアを使用して、新しい患者記録を確認し、作成します。
- 局所麻酔薬の投与:処置前に3分間隔で下円蓋に2滴投与します。
- IVCMデバイスのロストック角膜モジュール(RCM)を準備します:RCMのレーザー発光領域をカップリングゲルでコーティングし(気泡がないことを確認します)(図4 および 図5)、十分な量のカップリング剤(通常は1〜2滴、多すぎない)のみで角膜接触キャップとの完全な接触を保証し、最終的に理想的なゼロングインターフェースを実現します。使い捨ての角膜接触キャップを取り付けます。
- デバイスの配置:RCMを完全に格納します。額当てを水平に固定します。監視カメラを被写体の時間側に合わせます。RCM の光軸に垂直なカメラの停止点の位置を見つけます。
- フォーカスを調整する: 画質値が正確に 100 で、最大化された白いファキュラがソフトウェアに表示されるまで、フォーカス ノブを回します。深度の値をゼロにリセットします(ゼロ化)。
- スキャンモードの選択:特に指定がない限り、デフォルトは セクションモード です。ダニの活動を観察するために、 シーケンスモード を使用して動的画像を連続記録できます。
- 患者の位置を決める:あごをあご当てにしっかりと置きます。額を額当てに押し付けます。診察台とあご当てを患者の身長に合わせて調整します。
- まぶたの検鏡を挿入する:綿棒を使用して上まぶたを持ち上げて配置しながら患者に下を向いてもらい、配置用の綿棒で下まぶたをそっと引き下げながら患者に上を向いてもらいます。
- 最終指示:頭の正しい位置を再確認します。患者にリラックスした状態を保ち、動きを避けるように思い出させます。不快感があればすぐに報告してください。
- 角膜検査プロトコル
- 巨視的なアライメントから始める:角膜頂点に近づけるようにRCMを視覚的に調整します(図6)。RCM が角膜に近づくと、デバイスの監視カメラに切り替えて微調整します。患者が病変角膜の視線を回転させ、病変をRCMの下の中央に配置するように誘導します。角膜の損傷を避けるために、優しい接触を保ちます。
- 主な技術: 角膜コンタクト キャップは物理的なサイズが大きいですが、光学ゾーンは非常に小さいです (レーザーを放射する中央領域に限定されます)。重要な要件:接着不良はイメージングアーティファクト(気泡、油干渉、完全な信号損失など)を引き起こすため、キャップとターゲット組織の間に高精度の接触を実現します。
注:連続イメージングの場合は、フットペダルを踏んで長時間スキャンし、連続した深度画像をキャプチャし、重要なデータの見逃しを回避します。
- 層状角膜評価:CEC、SNF、上皮下炎症細胞の順に表層から深層までスキャンします。
- 推奨されるランドマークである下渦巻きと、隣接する上/下領域に焦点を当てます18.
- 鼻結膜検査
- 焦点面を深度値のゼロにリセットします。カップリングジェルをキャップに塗布します。患者に時間的または下側頭的に視線するように指示します。RCMを結膜表面にゆっくりと進めます。同時操作: 右手で最適な視野が得られるように RCM の位置を調整します。フォーカスノブを回して、左手で結膜の最外層のゴブレット細胞を識別します。
- まぶたの鏡の除去:患者に下を向くように指示し、綿棒を使用して上まぶたを持ち上げて除去します。そして、患者に上を向くように指示し、綿棒で下まぶたをそっと押し下げて取り除きます。
- デバイスのリセット:額当てを放して持ち上げます。フォーカスノブをゼロにします。カップリングゲルをRCM表面に再塗布します。
- マイボーム腺とまつげの毛包の評価
- 患者のポジショニング: 下向きの視線を指示します。検査官の操作: 上まぶたの皮膚をゆっくりと持ち上げて内側に押して、まぶたの縁を角膜キャップ面と平行に合わせます。RCM を水平方向に移動すると、同じタイプの構造のイメージがさらに表示されます。RCMを垂直に(下から上に)動かして、マイボーム腺の開口部の検査から腺房、そしてまつげの根元に切り替えます。
注:初心者は、マイボーム腺の開口部を調べるときに、より良い露出のためにまぶたを外反させることができます。この部分については、上まぶたの中央1/3の検査位置を提案します。 - 定量的基準 (施設プロトコル): 隣接する腺房15 を持つ 8 つの連続した卵胞を評価し、4-8 の連続した腺開口部を調べます。深度キャリブレーション:毛包の鮮明な画像を取得するには、ニキラモニが鋭い境界を示すまで焦点を合わせます(存在する場合)。腺房の鮮明な画像を取得するには、深さ約30〜50μmの推奨値が推奨されます。また、オリフィスの場合、約30μmです(感染した場合は、Demodex の短視認性を調整します)19。
- 患者のポジショニング: 下向きの視線を指示します。検査官の操作: 上まぶたの皮膚をゆっくりと持ち上げて内側に押して、まぶたの縁を角膜キャップ面と平行に合わせます。RCM を水平方向に移動すると、同じタイプの構造のイメージがさらに表示されます。RCMを垂直に(下から上に)動かして、マイボーム腺の開口部の検査から腺房、そしてまつげの根元に切り替えます。
3. 事後検査
- 施術後のケア:手指衛生を行い、手指を徹底的に消毒します。綿棒を使用して、眼表面に残ったカップリングジェル、裂け目、または破片を優しく拭き取ります。感染を防ぐために抗生物質点眼薬を投与します。
- 患者の指示:検査当日に目をこすらないように患者にアドバイスします。
- レポート作成:取得したすべての画像を包括的に分析し、診断レポートを生成します。報告要件: 組織構造ごとに少なくとも 1 つの画像を含め、必要に応じて異常な所見に対してさらに画像を追加します。選択されたすべての画像は、検査順序と深度値によって配置され、その後に正確な説明と測定が行われます。
- 廃棄物処理手順: 使い捨て材料 (コンタクト キャップ、綿棒、麻酔容器) については、医療廃棄物箱に捨てて、さらに専門的な処分を行ってください。
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結果
すべてのIVCM顕微鏡画像は、384ピクセル×384ピクセルの解像度、400μm×400μmの観察野で取得されました。適切に「ゼロ」にした場合、この検査では画像フレームに3つの可能な結果のみが表示されます:i)画像がまったくない(実験の失敗):中央の光学ゾーンは標的組織と接触しませんでした。ii) 部分的な画像のみ (図 7) またはその他の異常な状況 (図 8) (実験の失敗): 中央の光学ゾーンが標的組織との接触が不完全または緩い。iii)鮮明で完全な画像(実験の成功):中央の光学ゾーンは、標的組織との完全な接触を達成しました(図9 〜 図17)。したがって、課題は、成功した画像と失敗した画像を区別することではなく、操作要件に従って、デバイスの中央光学ゾーンとターゲット組織の間の適切な位置合わせと接触を確保することにあります(
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ディスカッション
「in vivo 共焦点顕微鏡」と「ドライアイ疾患」(2025 年 6 月取得)というキーワードを使用した PubMed 文献検索では、300 件>出版物が得られました。特に、2021年以降、年間論文の出版率は年間約40件で安定しています。眼表面疾患における IVCM の広範な応用により、過去 2,000 年間 (2004 年から 2024 年) にわたって 2,000 件>研究が生み出されました。臨床的には、IVCM は眼表面の病状の細胞レベルの評価に革命をもたらしました。この技術により、無症候性疾患の症状の検出が可能になり、早期診断と精密な介入が容易になり、上記の後者の 2 種類の DED と正確に一致します。さらに、IVCM に基づく治療プロトコルにより、客観的な改善に応じて証拠に基づいた投薬の漸減または中止が可能になり、それによって治療負担とそれに伴う社会経済的影響が軽減されます。たとえば、マイボーム腺の開口部と腺房の閉塞に対するマイボーム腺の詰まり解消治療(図14 および
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
著者らは、いくつかの写真を手伝ってくれた漢口アイア眼科病院の Lina Jin 氏と武漢アジア心臓病院眼科の Min Chen 氏、および手術手順に取り組んでいるすべての参加者とスタッフに感謝します。この研究は、武漢市衛生健康委員会(WX23A20)の科学研究プロジェクトからの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 吸収性コットンボール | 建奇、中国 | http://www.hnjianqi.com | アルコールボールを作るために、小さい |
| アルコール系ジェル | 中国、上海、李康 | 31107904 | ハンド消毒液のすすぎフリージェル、500ml |
| カーボマー点眼薬 | ヴィディジック、ドイツ | 8187195 | 結合剤用の滅菌眼用ゲル、10g |
| 角膜接触キャップ(トモキャップ) | ドイツ、ハイデルベルク | 18829 | 光学媒体と角膜の無菌接触 |
| まぶたスペキュラム | アシコン、中国 | 6102A | 目を開かせてくれて |
| ハイデルベルク・アイ・エクスプローラーソフトウェア | ドイツ、ハイデルベルク | バージョン 1.5.2.0 | IVCMデバイスに付属するソフトウェア |
| IVCM装置 | ドイツ、ハイデルベルク | HRT-?,08398 | 試験の主な装備 |
| 医療用綿棒 | エサウンド・メッド、中国 | www.e-soundmed.com | 患者の目の洗浄と開け方の補助には10cm |
| 75%の医療用アルコール | 中国、恵昌 | www.huichang888.cn | アルコールボールを作るには75%以上;5% 500ml |
| 0.4% オキシブプロカイン塩酸塩点眼薬 | 三天、日本 | http://www.santen.co.jp | 眼科外麻酔薬 0.4%(0.5ml:2mg) |
| トブラマイシン点眼薬 | トブレックス、ベルギー | 8453824 | 抗炎症点眼薬 0.3%(5ml:15mg) |
参考文献
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