デジタル空間プロファイリングのための形態学およびRNA保存された石灰化動脈の準備・処理

サマリー

このプロトコルには、Nanostring GeoMxデジタル空間プロファイラー(DSP)上での組織取り扱い、脱石化、RNA検証、石灰化レベルの検出、関心領域選択戦略など、石灰化した血管標本の段階的なワークフローが含まれています。目的は、信頼できる空間的トランスクリプトミクス解析のために、血管組織の形態とRNAを包括的に保存する方法を提示することです。

要約

空間トランスクリプトミクスは、全トランスクリプトームプロファイルを組織切片に直接マッピングし、細胞近傍と遺伝子発現、そしてこれらの活動が健康と疾患をどのように駆動するかを相関させます。このアプローチは腫瘍学、神経科学、免疫学、発生科学、多くの分野を変革しましたが、血管生物学ではあまり広く使われていません。血管疾患は世界的に主要な死因であり続けています。2つの障害があります。動脈や静脈は切断に適した平らな面がほとんどないこと、そして病変標本(しばしば動脈硬化、血栓、プラーク多、石灰化)は脱石化などの厳しい処理が必要で、形態やRNAの完全性を損なうものです。しかし、これらの血管は同心円状の内膜、培地、翼状層構造を持ち、それぞれの層が壁を越えて相互作用する異なる細胞タイプや遺伝子プログラムを宿しているため、空間解析に理想的です。

空間的トランスクリプトミクスのために血管組織をどのように準備するかを扱った詳細なプロトコルはほとんどありません。この不足は、研究者がこの技術の潜在能力を最大限に活用する能力を制限しています。ギャップを埋めるために、進行した病変を持つヒト脛骨動脈に最適化されたステップバイステップのワークフローを提示します。プロトコルでは、組織の取り扱い、固定、適切な脱石灰を含み、構造とRNAの質を維持し、その後組織学的染色を行って石灰化の重症度をグレードアップします。また、NanoString GeoMxデジタル空間プロファイラー(DSP)を用いたバッチ効果抑制のための組織マイクロアレイ(TMA)構築や関心領域(ROI)選択戦略についても説明しています。

技術的障壁を低減することで、このプロトコルは血管研究者が信頼性の高い空間的トランスクリプトミクスデータを生成し、健康な血管および病変した血管における層特異的な転写活動を研究することを可能にします。石灰化、炎症、内膜動脈硬化、その他の血管病理のメカニズムの発見を加速し、血管生物学における空間的トランスクリプトミクスのより広範な採用を促進すると期待しています。

概要

過去10年間で、次世代シーケンシングと高解像度イメージングが融合し、空間トランスクリプトミクスを進展させ^{ました。これは}、組織切片内の各トランスクリプトームの正確な位置を保持しつつ、全トランスクリプトーム定量化を行う方法です。急速に成熟する単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)分野と組み合わせることで、空間的アプローチは遺伝子シグネチャーを特定の細胞タイプ、状態、組織や臓器内のニッチと結びつける効率的なルートを提供し、疾患メカニズムの理解を大いに豊かにします ^3,4,5,6,7.10X Visium、NanoString GeoMxおよびCosMx、Slide-seq、DBiT-seqなど、腫瘍や脳組織などの軟組織で細胞性の高い組織に最適化されたプロトコルでサポートされた複数の商用プラットフォームが開発されています。この分野は爆発的な成長を遂げており、PubMedは2023年に約150本、2024年には約300本、2025年には500本を超えるペースでインデックス化されています。この急増にもかかわらず、血管生物学はがん、神経科学、免疫学に比べて依然として過小評価されています。

骨、軟骨、歯、プラークを多く含む石灰化した動脈や静脈などの硬質または石灰化組織は、はるかに受け入れにくいことが判明しています。技術的な障害は多面的です。まず、密ミネラルマトリックスを持つ組織はキレートや酸を使った除去が必要であり、RNAを断片化し組織形態を歪める可能性のある積極的な処理が必要です。第二に、損傷した組織や線維化組織は、豊富な細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれた生細胞が少なく、転写産物の収率を減少させ、データの正規化を複雑にします。さらに、血管組織は薄く同心円状の構造(内膜、内膜、翼状体)を持ち、中空の腔を包み込んでいます。特に単細胞層の内膜の壁厚が限られているため、捕捉部位に組織がほとんど残ることがなく、数時間にわたる染色やハイブリダイゼーションの過程で断片が裂けたり剥離したりすることがあります。その結果、血管組織の空間転写体研究は依然として乏しいものの、心血管疾患は世界的に死因および重篤な罹患の主要な原因の一つとして一貫して位置づけられています。存在するプロトコル論文は圧倒的にデータ処理、可視化、またはNanoString^GeoMx 8,9,10,11,12,13以外のプラットフォームを強調しています。これらの論文の中で、末梢動脈(PAD)における臨床的に重要な血管である病変脛骨動脈の処理のためのベンチレベルの方法を扱うものはほとんどなく、特に糖尿病患者に対しては影響を受ける人口の割合が増加しています。

このギャップを埋めるために、切断を受けたPAD患者から採取した石灰化したヒト脛骨動脈の包括的なワークフローを提示します。プロトコルの内容は以下の通りです:(1) 手術室採取直後の組織トリミングおよび解離;(2) 組織の形態とRNAの完全性を維持する適切な組織固定と脱石灰;(3) バッチ効果を最小限に抑えるためのコスト削減型組織マイクロアレイ(TMA)の構築;(4) RNAscope in situ ハイブリダイゼーションおよび品質管理のための組織学的カルシウム染色;および(5) GeoMxデジタル空間プロファイラー(DSP)プラットフォーム上で石灰化した脛骨動脈向けに特別に設計された関心領域(ROI)選択戦略。これらのステップには、DSP装置でのサンプル採取前のすべての手順、ライブラリの準備、シーケンス、データ解析が含まれます。

参照されたDSPプラットフォーム上で実証されていますが、これらの原理は10X Visiumやその他のプラットフォームの組織調製を導くことができ、方法論は追加の血管床や動物モデルにも容易に適応可能です。このプロトコルはバイオバンクや死後組織にも適応可能ですが、その成功は組織の保存、固定、貯蔵条件に大きく依存します。組織は収穫直後に固定し、虚血期間を最小限に抑える(理想的には1時間以内)してください。標準的な10%中性緩衝ホルマリン(NBF)は室温(RT)で少なくとも16時間の使用が推奨されます。組織は固定後すぐに埋め込み、エタノールに3日以上浸してはいけません。推奨条件下で処理・保管されたホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)ブロックは、約3年間は空間プロファイリングに適していますが、ブロック年数とともにRNAの質は低下します。したがって、低細胞濃度サンプル、6か月間保存されるブロック、バイオバンク標本、死後組織に対してRNA品質評価が推奨されます。最低許容RNA品質は、選択されたアッセイ、ROIの選択、望ましい分解能、コア施設の推奨によって異なります。実際には、強健な結果を得るために1セグメントあたり約50〜100個の核が一般的に推奨されています。DSPプラットフォームはFFPEと新鮮な凍結組織の両方に対応しています。このプロトコルでは、FFPE組織に焦点を当てます。

本研究は空間的トランスクリプトミクスに焦点を当てていますが、scRNA-seqと容易に統合できます。公開されているscRNA-seqデータセットと計算空間的反転を用いて、各空間スポットの細胞タイプ比率を推定し、scRNA-seqで定義された細胞状態を組織構造に投影できます。構造とRNAの完全性を維持することで、本プロトコルは下流の単一細胞または単一分子の検証を可能にし、貴重な血管標本からの生物学的洞察を最大化し、血管生物学研究における空間的トランスクリプトミクスのより広範な採用を実現します。

プロトコル

ヒト動脈標本採取のすべての手順は、ワシントン大学ヒト被験者部門の倫理審査委員会(IRB)およびVAピュージェットサウンド医療システム(シアトル、ワシントン州)のIRBによって承認されました。組織採取前に患者から書面によるインフォームド・コンセントを取得しました。本研究に使用される材料および機器は 「材料表」に記載されています。

1. 組織のトリミングと固定

1. 組織トリミング
   1. 輸送バッグは内管、二次容器、外部輸送用容器、バイオハザード検体袋を含む多層包装で準備します。内側50 mL遠心分離機チューブに、4-[2-ヒドロキシエチル]-1-ピペラジネエスルホン酸(HEPES)1%とペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)1%を含む30 mLの貯蔵用デュルベッコ改良イーグルズ培地(DMEM)媒体を充填します。
   2. 採取した前脛骨動脈(AT)、後脛骨動脈(PT)、腓骨脛骨動脈(PR)を別々に50 mL遠心分離機チューブに入れます(理想的には長さ> 5cm)。手術室から組織培養室へ氷に入ったカニスターを移してください。
      注:採取したサンプルの長さは、複製および他の評価や検証のために十分な組織を冷凍保存するために少なくとも5cmであることが推奨されます。
   3. 各動脈を培地とともに100mmのペトリ皿に移します。無菌ハサミと鉗子を使って余分な血管周囲結合組織を除去し、動脈壁(内側の動脈壁)だけを残します。
      注意:RNA汚染を防ぐために、RNase不活化液で拭いたバイオセーフティキャビネットで組織を扱いトリミングしてください。滅菌メスと鉗子を使い、サンプルの間は、無菌かつヌクレアーゼフリーの水ですすいで残留物を除去し、70%エタノールでしっかりと拭き取ってください。
   4. 切り離した動脈を新しいペトリ皿でDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で軽く洗い流します。新しい皿の中に滅菌まな板を置き、動脈をその皿の上に移します。
   5. 手術用刃で動脈を断面1cmの区画に切断します。
2. 組織固定と貯蔵
   1. 液体窒素(_LN2)で凍結保存するために2セグメントを凍結し、将来のタンパク質/RNA解析のために保存します。
   2. 残りのセグメントを10%のNBFを含む15mLチューブに入れ、1cmの動脈セグメントを4°Cで24〜48時間固定します。
      注意:10%のNBFの使用が推奨されます。4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用する場合は、RNA損傷を最小限に抑えるために、使用前に新鮮に調製するか中性pHを確認してください。

2. 脱石化、組織処理および切片

1. 脱炭素溶液を準備します:固体のエチレン-ジアミン-四酢酸(EDTA)をRNA安定化液(RSS)に10%(w/v)に溶かします。ろ過は不要です。水酸化ナトリウム(NaOH)ペレットでpHを9.2に調整してEDTAを完全に溶解させ、その後10 M HClで5.2に下げます。これはRSSの典型的な作動pHであり、RNAの完全性を保つのに役立ちます。
2. 補完したティッシュをPBSで手で軽くすすぎます。各サンプルを脱灰液を含む15mLチューブに移し、4°Cで72時間攪拌します。
3. 脱石が完了したら、サンプルをPBSで洗浄します(2分×5分)。ティッシュをカセットに入れ、4時間処理プログラムを使ってティッシュプロセッサーに読み込みます。
4. 組織ブロックごとに複数の動脈断片を埋め込むこと。スライドバックの制限組織領域にマークし、すべてのセクションがその範囲内にあるか確認してください。
5. 余分なパラフィンを切り取る。5μmの角度でマイクロトームと低プロファイルブレードでブロックを切片し、組織切片を標識されたスライド領域内に取り付けます。
   注意:最初の数個の切片はフェイス後に廃棄し、その後の組織切片を収集してください。RNaseフリーのブラシを使い、サンプルのバッチ間に水浴を清浄してください。
6. 各ブロックにつき少なくとも4つの連続セクションを用意し、異なる染色とデジタル空間プロファイリング(DSP)実験を行いましょう。スライドは使用まで4°Cで保存してください(理想的には6ヶ月<)。

3. RNAscope インシチュ ハイブリダイゼーション(ISH)および組織学的染色

1. RNAscope(約)です
   1. スライドを60°Cのドライオーブンで一晩焼き、組織の接着を強めます。
   2. 脱硫化:キシレンにスライドを潜し(3分×5分)、その後100%エタノール(2×3分)に浸します。60°Cで7分間ドライスライドを流します。
   3. 製造元のプロトコルに従ってRNAscope 2.5 HD Red ISHアッセイを実施してください。内因性ペルオキシダーゼを3% H₂O₂ でRTで10分間ブロック;蒸留水(DI)ですすぎます。
   4. 事前に加熱された100°Cの回収バッファー(DI水に1:10を希釈)で15分間インキュベートします(スチーマーで最大24枚のスライドを設置する場合は200mLの回収バッファーを使用)、100%エタノールに5回浸し、60°Cで7分間ドライスライドを行います。疎水性バリアPAPペンを使って組織の周囲に疎水性バリアを作成します。
   5. スライドをハイブリダイゼーションオーブンラックに置き、各スライドに200μLの消化酵素サプリメント(販売者がスポイトボトルで希釈したもの)を加え、40°Cで15分間培養します。スライドはDI水で2回洗い流してください。
   6. 陽性対照プローブのヒトPpibをスライドに適用し、40°Cで2時間培養します。 スライドはウォッシュバッファーで2回洗ってください。
   7. 逐次増幅を行う:AMP1を40°Cで30分間投与;AMP2は40°Cで15分間、AMP3は40°Cで30分間、AMP4を40°Cで15分間投与;AMP5をRTで30分間使用;そしてAMP6をRTで15分間投与しました。その間は2回2分ずつ洗い続けます。
   8. Fast Redのワーキング溶液を加え、RTで10分間培養します。水を抜き、スライドをDI水に浸し、その後新鮮なDI水に5回浸します。Ppib陽性対照群の斑点が離散的で点状の赤い点として現れることを確認しましょう。
   9. ギルのヘマトキシリン1回でカウンターステインし、DI水を2回交換して5回浸し、0.02%水酸化アンモニウムに青色を塗り、DI水を2回交換して5回浸します。核が青色に染まり、組織の形態が保持されていることを確認します。スライドは一晩乾かし、取り付け用メディアでカバースリップします。
2. アリザリン レッドS染色
   1. 追加の連続切片については、ステップ3.1.2で脱脂および再水和を繰り返します。
   2. アリザリン・レッドSの動作液pHが4.1〜4.3であることを確認してください。
   3. スライドをアリザリンレッドSに30〜60秒浸し、カルシウム沈着がオレンジ赤色になるまで浸します。
   4. 過剰な染料を落としましょう。100%アセトンに20回素早く浸し、その後アセトン:キシレンに20回浸して脱水します(1:1)。
   5. スライドをキシレンの新しい浴槽2回に分けて、それぞれ3分ずつ洗います。カバースリップに取り付け用ミディウムを付けます。

4. GeoMx DSPスライド準備とROI選択

1. 開始前に、すべての機器や容器をRNA酶不活化液で洗浄し、RNA汚染を防ぐためにDEPC処理水で乾燥またはすすいでください。空間RNAプロファイリングアッセイの指示に従ってください。
2. スライドを60°Cのドライオーブンで一晩焼き、組織の接着を強めます。
3. 脱パラフィン化および再水和:キシレンに3×5分浸し、その後100%エタノール(2×5分)、DEPC処理水で希釈した95%エタノールを5分間浸します。スライドを1×PBSに1分間移してください。
4. 予熱した100°C Tris/EDTA pH 9.0抗原回出バッファーで20分間インキュベートし、その後1×PBSに5分間RTで移します。
5. 予熱した1.0 μg/mlのプロテイナーゼKを15分間インキュベートし、1×PBSでRTで5分間洗浄します。
6. スライドを10% NBF(1枚あたり200μL)でRTで5分間後置し、PBSで5分間洗浄します。
7. PBSからスライドを取り出し、ペーパータオルを軽く叩き、Kimwipeで組織の周囲の余分な液体を拭き取り、ハイブリダイゼーションステインラックにセットします。
8. 各スライドに200μLのハイブリダイゼーション溶液(バッファWで1:10希釈)を加え、ハイブリダイゼーションスリップを適用します。ハイブリッド化チャンバーを閉じてオーブンに入れ、37°Cで一晩培養します。
9. 塩水-ナトリウムクエン酸バッファー(SSC, 2×)にスライドを浸し、ハイブリダイゼーションスリップが5分以内に自然に滑り落ちるようにします。
10. スライドを4×SSCと脱イオンホルムミドを等量の37°Cで37°Cで洗い、1回25分洗浄します。スライドは2×SSCバッファーで洗い、1回2分洗います。
11. RTでバッファWを使ってスライドを30分間ブロックします。
12. RTの湿度チャンバースライドボックスで一次抗体溶液(Rabbit anti-CD45)を1時間覆い、2×SSCバッファーで3回洗浄します。
13. 二次抗体溶液(ヤギ抗ウサギ用IgG-AF647)を1時間塗布し、2×SSCバッファーで洗浄します。
14. 湿度チャンバーのスライドボックスで1時間、標識抗体(マウス抗SMA-AF488)を覆い、2×SSCバッファーで洗浄します。
15. 2μMのSyto83核マーカーをバッファWで希釈したもので10分間スライドを染色します。
16. RNAプロファイリング機器でスライドをスキャンし、形態学的マーカーの染色を可視化します。各動脈組織の石灰化病変の近位および遠位を選択し、各ROIの層特異的な位置を注釈します。
    注意:組織切片にハイブリダイゼーションスリップを塗布する際は気泡形成を防ぐよう注意してください。

結果

ここで述べたプロトコルは、脛骨動脈の受領から、形態学とRNAの完全性の両方を保持し空間的トランスクリプトミクス解析のためにTMAスライドの作成まで、研究者を導きます。また、動脈内のカルシウム沈着を可視化するための組織学的手法、形態マーカーの染色、ROI選択戦略についても詳述しています。

図1では、動脈が10%のNBFに固定されています(ステップ2)。NBFは組織に素早く浸透し、RNAの分解を最小限に抑え、そのリン酸バッファー(pH 7.0)は固定時に生成された蟻酸を中和し、pHが6を下回るのを防ぎます。プロファイラー機器でROIを選択した後、以下の手順はこのプロトコルで示しません。簡単に言えば、紫外線(UV)レーザーが各ROIを正確に照射し、バーコードタグ付きのオリゴヌクレオチドを放出します。これらのオリゴはnCounterまたは次世代シーケンシングによって定量され、空間的に解析された遺伝子発現カウント(ステップ6)が得られます。複数の動脈断片を同一ブロッ...

ディスカッション

このプロトコルは、NanoString GeoMx DSP上で空間的トランスクリプトミックプロファイリングのために石灰化したヒト脛骨動脈を準備するために必要な手順を詳述しています。脛骨動脈はすべての血管と同様に、同心円状の内膜、中膜、翼膜層を持ち、それぞれが損傷と修復を指揮する異なる細胞集団を抱えています。これらの層の構造を維持することは、層分解によるトランスクリプトミクス解析に不可欠ですが、しばしば見落とされがちな準備段階がその目標を損なう可能性があります。

動脈組織を入手した後、肺周脂肪組織を除去し、肺動脈はそのままにしなければなりません。これにより、ROI配置のための空間的枠組みとなる連続した容器壁が保持されます。重要なステップはRNAの品質を維持することです。10%NBFで組織を固定するのは、リン酸バッファー(pH 7.0)が固定中に生成された蟻酸を中和し、酸触媒によるRNA加水分解を制限するためです。4% PFAなど他のホルマリン固定剤も同等のホルムアルデヒドを供給します。懸念としては、4%のPFAは保管...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコ改良イーグルズミディウム(DMEM)、高グルコース、ピルビン酸およびnbsp;	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11995065
4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネエスルホン酸(HEPES)緩衝液、1 M	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15630080
ペニシリン・ストレプトマイシン(P/S)、10,000 U/mL	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15140122
10%中性緩衝ホルマリン(NBF)	ミリポール・シグマ	65346-M
エチレンジアミン-四酢酸(EDTA)	ミリポール・シグマ	3620
RNAlater安定化溶液	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	AM7024	RNA安定化溶液(RSS)
過酸化水素(H2O< sub>2)	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	322335
ターゲット回収解	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	322001
プロテアーゼプラス	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	322331	消化酵素サプリメント
DapB(ネガティブコントロール)	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	310043
RNAscopeウォッシュバッファー(RNAscope 2.5 HD Red ISHアッセイキット)	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	320058
AMP1	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	324511
AMP2	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	324512
AMP3	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	324513
AMP4	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	324514
AMP5 レッド	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	324515
AMP6レッド	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	324516
ファストレッドA	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	324517
ヒトPpib	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	313901
ギルSヘマトキシリン	ミリポール・シグマ	GHS132
抗原回収、Tris/EDTA pH 9	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	00-4956-58
プロテイナーゼK	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	AM2546
ハイブリダイゼーション解-Hs WTA	ナノストリング	121401102
ハイブリスリップ			ハイブリダイゼーションスリップ
ハイブリダイゼーション溶液-バッファR	ナノストリング	121300313
ラビット抗CD45	細胞シグナル伝達	1317
バッファW	ナノストリング	121300313
ヤギ抗ウサギ IgG-AF647	ジャクソン免疫研究	111-605-144
マウスアンチSMA-AF488	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	53-9760
Syto83	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	S11364
サージカルブレード	BDバイオサイエンス	371110
スーパーフロスト プラス顕微鏡スライド	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	1255015
ImmEdge ペン
ミクロトームブレード	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	22-500-125
RNaseを逃す			RNase不活化溶液
<ストロング>装備
HybEZハイブリダイゼーションオーブン	アドバンスト・セル・ダイアグノスティクス社	321710
GeoMxデジタル空間プロファイラー	ナノストリング	モデル:GeoMx DSP データアクセスプラットフォーム:GeoMx DSP Control Center(バージョン 3.1.2.12)	チャネルスキャン設定:FITCの場合、爆発時間は300ミリ秒、蛍光層はAlexaFluro 488です。チャネルCy3では露光時間は50ミリ秒、蛍光素はSyto83です。チャネルCy5の露光時間は300ミリ秒で、蛍光色素はAlexaFluor 647です。