方法論記事

マウスの卵巣血管機能のライブイメージングと定量化のためのドップラー超音波検査

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DOI：

10.3791/69169

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2025年11月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, Cornell University, 2Biotechnology Resource Center Imaging Facility, Cornell University

この記事について

サマリー

排卵前の卵巣血流の変化は排卵に不可欠です。ドップラー超音波検査は、卵巣の血行動態と灌流を評価するために、ヒトや大型動物で使用されています。マウスの排卵前および排卵周辺期の卵巣血行動態を評価するためにドップラー超音波検査を適用するためのプロトコルが提示されています。

要約

卵巣血管機能を効果的に評価し、卵巣の生理学と病理学におけるその役割を理解するには、正常な血流を妨害することなくリアルタイムの変化を捕捉するために、非侵襲的な in vivo アプローチが不可欠です。ドップラー超音波検査は、大型種の卵巣血流を評価するための確立された非侵襲的ツールですが、排卵などの卵巣生物学の研究に最も広く使用されている動物モデルの 1 つであるマウスでの応用は限られています。排卵は、卵胞刺激ホルモンによって刺激される協調的な卵胞成熟に依存し、その後に排卵前黄体形成ホルモン (LH) の急増に依存し、卵胞壁の破裂と受精のための卵母細胞の放出に依存する、厳密に調節されたプロセスです。LHサージはまた、排卵直前の卵胞破裂部位での血管新生や毛細血管の収縮など、卵巣血管系の一連の構造的および機能的変化(血管リモデリング)を引き起こします。さらに、LH急増後の卵巣血流の急激な増加は、複数の種で報告されていますが、マウスでは報告されていません。このプロトコルは、ドップラー超音波検査を利用してマウスの卵巣血管系を視覚化し、血行動態パラメータを定量化します。ここで提示されたプロトコルは、ホルモンプライミング、麻酔、マウスの位置決め、パワードップラーとカラードップラーを使用した卵巣とその血管系の同定、および血流速度と抵抗パラメータの測定のための詳細な方法を報告しています。この方法により、生きたマウスの卵巣血管機能をリアルタイムで縦断的に評価することができ、生理学的および病理学的状況の両方で卵巣血管機能を研究するための強力なツールを提供します。

概要

卵巣は高度に血管新生した器官であり、その脈管系の周期的、構造的、および機能的変化(血管リモデリング)は、卵胞の発達、排卵、黄体の形成などの正常な卵巣生理機能に不可欠です1,2,3,4。血管リモデリングには、血管透過性の変化、血管新生、血管拡張、血管収縮、血流の変化(血行動態)など、一連の調整されたプロセスが含まれます。これらのプロセスにより、卵巣は発情周期1、2、3、5、6、7、8、9全体のホルモンの手がかりに反応して血液供給を迅速に調整できます。血管リモデリングと卵巣血流の混乱は排卵を損ない、多嚢胞性卵巣症候群などの生殖能力障害に関係しています2、3、10、11。肥満も同様に、血管新生を妨害し、エンドセリン-212,13 などの血管メディエーターの発現を減少させることが示されています。さらに、卵巣過剰刺激症候群は、主に体外受精中のゴナドトロピン治療による卵巣刺激に関連する合併症であり、卵巣内の間質血流の増加を示すことが多く、血管機能の調節不全の有害な結果を強調しています14。まとめると、これらの状態は、女性の生殖能力の維持における卵巣血管リモデリングの中心的な役割を強調し、卵巣機能のサポートにおける血行動態の重要性を強調しています。

卵巣血管機能を正確に評価するには、生理学的環境を乱すことなく血行動態をリアルタイムで測定する必要があります。ヒトおよび牛、羊、馬などの大型動物モデルでは、ドップラー超音波検査は、卵巣の血流と血管構造を評価するために広く使用されている非侵襲的ツールです 15,16,17,18。この技術により、卵巣血管新生の動的分析が可能になり、ホルモンによる血流の変化を捉え、卵巣の機能と機能不全に関する貴重な洞察が得られます 15,16,17,18。

生殖周期が短く、遺伝的に扱いやすいため、卵巣生物学の研究モデルとして実験用マウスが広く使用されているにもかかわらず、このモデルで卵巣血流を研究するための非侵襲的な in vivo 方法は依然として限られています19,20。既存のアプローチは、卵巣の外部化を必要とする非常に侵襲的な手順(生体内顕微鏡検査)、または時間分解能を欠き、生理学的コンテキストを混乱させるCLARITYアプローチやホールマウントイメージングなどの技術に依存しています1,2,3,4。遺伝子操作や生殖研究に最もよく使用される哺乳類モデルとして、マウスは卵巣血行動態の分子メカニズムを調査し、標的を絞った介入を評価する機会を提供します。これは、in vivo で動的な卵巣血管の変化を監視するための非侵襲的、縦断的、定量的なイメージング アプローチの必要性を浮き彫りにしています。

女性の生殖能力の中心的な出来事である排卵プロセスは、女性の生殖能力における卵巣血管リモデリングの重要性を例示しています。これは、卵胞刺激ホルモン (FSH) 誘発性卵胞の成熟から始まり、卵胞破裂と卵母細胞の放出を引き起こす LH サージで最高潮に達します1。FSH の効果を模倣するウマ絨毛性ゴナドトロピン (eCG) による刺激の後、卵巣血管網は拡張します2.この血管の成長は、卵巣髄質から皮質に向かって外側に進行し、発達中の卵胞をサポートします2。排卵の直前に、血管が顆粒膜細胞層に伸び、卵胞頂点(最終的な破裂と卵母細胞放出の部位)で局所的な血管収縮が観察されます3。これらの協調的な血管の変化は、排卵を成功させるために重要です 1,2,3。大型動物モデルとヒトでのドップラー研究により、卵巣灌流の急激な増加や排卵前卵胞内の血流の局所的な再分布など、排卵前期の血行動態の変化が明らかになり、基部での流れの増加(卵巣間質に最も近い-頂点の反対側)と頂点での流量の減少が特徴になります16.LH急増直後の卵巣血流速度の増加は、女性の排卵の成功と関連していました15。しかし、無傷のマウス卵巣におけるこれらの血行動態の変化を縦断的に追跡した研究はまだなく、この広く使用されているモデルにおける血管リモデリングの理解が制限されています。

このギャップに対処するために、マウスの卵巣とその血管系の非侵襲的な視覚化と、速度および抵抗指数を含む卵巣血行動態の定量化を可能にするドップラー超音波検査のプロトコルを提示します。この研究で使用したMS-700プローブは、解像度が限られているため(軸方向/横方向:30/58 μm)、毛細血管の詳細な分析ができませんが、それでも主要な卵巣血管の明確な視覚化と定量化が可能です。将来の用途で造影剤を使用すると、血管の視覚化がさらに強化される可能性があります。全体として、このアプローチにより、既存の侵襲的技術に対する重要な利点である生理学的完全性を維持しながら、排卵前期間など、定義された時点で同じ動物で繰り返し縦断的な測定が可能になります。

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プロトコル

使用されたすべてのマウスは、コーネル大学の施設動物管理および使用委員会からの倫理的承認を得て、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドに厳密に従って維持されました。このプロトコルで使用したすべての動物は、未成熟(生後21〜23日)のC57BL6マウスでした。

1.過排卵のためのホルモン刺激

  1. 体重10〜12 gの21〜23日齢マウスに5 IUの妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内注射し、続いて48時間後に5 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を注射します。50 μLのホルモン(5000 IUストックバイアルから再構成)を950 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈して各注射を調製し、マウスあたり0.1 mLを投与します。

2.超音波装置のターンオンシーケンスとトランスデューサーのセットアップ

  1. イメージングシステムの背面にある主電源をオンにします。システムが起動したら、カートの左側にあるコンピュータスタンバイスイッチを切り替えて、モニタとコンピュータをスリープ解除します。
  2. 目的のトランスデューサ(ここではMS-700 - 30-70 MHz)をイメージングユニットのアクティブトランスデューサポート(右端のポート)に接続します。トランスデューサコネクタのロックピンをポートのノッチに合わせ、コネクタを完全に押し込み、ロックレバーを垂直位置に回して固定します。
  3. ソフトウェアアイコンをクリックして、解析ソフトウェアを起動します。プログラムが開き、トランスデューサーが(自動的に)検出されたら、卵巣アプリケーションパッケージを選択します。[新規]をクリックして新しいスタディを作成し、ドロップダウン メニューから適切な名前を選択します。「試験情報」ウィンドウで、必須フィールドを入力します。試験名;シリーズ名;アプリケーションパッケージ:卵巣;測定パッケージ:血管。

3. 麻酔、マウスの準備、超音波ステージのセットアップ

  1. 生理学的モニタリングユニット(体温と心拍数)をオンにします。プラットフォームが加熱されていることを確認してください(37°C)。
  2. イソフルランレベルが気化器リザーバーの最小充填ラインを上回っていることを確認してください。必要に応じて、適切な個人用保護具を使用してイソフルランを追加します。酸素タンクのバルブをゆっくりと完全に開きます。酸素流量を毎分1リットルに設定します。
  3. Yピースチューブの活栓を調整して、酸素とイソフルランが誘導チャンバーに流れ込むようにします。このステップでは、マウスプラットフォームのノーズコーンにつながる活栓が閉じていることを確認します。気化器ダイヤルを3〜4%のイソフルラン(vol / vol)を誘導用に供給するように設定します。
  4. マウスを誘導チャンバーに入れ、蓋をしっかりと閉めます。
    注:誘導チャンバーは機能的に気密です。活発なガスの流れのない密閉されたチャンバーに動物を放置しないでください。
  5. 心拍数モニタリングのための適切な接触を確保するために、各電極に少量の電極クリームを塗布してイメージングプラットフォームを準備します。
  6. 動物が完全に鎮静されたら、活栓をイメージングプラットフォームのノーズコーンに開き、活栓を誘導チャンバーに閉じることにより、ガスの流れの方向を変えます。
  7. マウスを加熱したイメージングプラットフォームにそっと移します。マウスを腹臥位(背側を上に向けて)に置きます(図1A)。ノーズコーンを動物の鼻の上にしっかりと置き、麻酔を維持するために鼻と口の両方が覆われていることを確認します。生理学的モニタリングのために、電極クリームの各足を対応する電極パッドにテープで貼り付けます。麻酔中の角膜乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。
  8. イソフルラン濃度を1.5〜2.0%に下げ、ノブを左に回して麻酔を維持します。つま先ピンチ反射法を使用して適切な麻酔深度を確認します(離脱は観察しないでください)。イメージングセッション中は、5分ごとに動物のバイタルサインを注意深く監視します。 (i) 呼吸数。 (ii) 心拍数。 (iii) 不快感を示す可能性のある動き。 (iv) イメージングプラットフォームが全体的に正しい温度に加熱されていることを確認します。
  9. 電気シェーバーでその部分を剃って、背中の右下象限を準備します。右後肢から背中の正中線まで剃り、背骨のすぐ外側に留まります。以前に剃った部分に体毛除去クリームを薄く30秒から1分間塗布して、残っている毛を取り除きます。湿らせたガーゼでよく拭き取ってください。剃った部分に超音波ゲルをたっぷりと均一に塗布し、最適な音響結合を確保します。
  10. トランスデューサープローブを機械式スタンド内のマウスに対して横方向に配置し、方向ノッチをオペレーターの左側に向けます。クランプを使用してプローブを所定の位置に固定します。

4. ドップラー超音波検査による卵巣および卵巣血管の同定

  1. コントロールパネルで、 Bモード キーを押して、解剖学的構造を視覚化できる標準のグレースケールイメージングウィンドウをアクティブにします。
  2. 超音波ゲルでコーティングされた剃毛領域にトランスデューサーをそっと下げます。
    1. イメージングプラットフォームとマウスが平らに配置され(ベンチ表面と平行)、トランスデューサーがマウスとプラットフォームに対して垂直(90°角度 - 垂直)に下げられていることを確認します(図1A)。
    2. 卵巣を見つけるには、皮膚を左に引っ張り、トランスデューサーを剃った象限の上部領域の近く、背中の正中線に近づけます。プローブの左端を背骨に隣接して位置合わせし、右端を右外側の側面にわずかに伸ばします。
  3. 卵巣を特定するには、まず、皮質と髄質が見える大きな明るい灰色の卵形構造(5 mm×6 mm)である腎臓を検出します。次に、イメージングプラットフォームをわずかに前方(マウスの頭に向かって)押して、卵巣と周囲脂肪組織(POAT)を表示します。
    注:卵巣は、脊髄の外側に位置する、約1 x 2 mm(排卵前段階)の小さな円形の低エコー(濃い灰色)構造です。POATは高エコー(明るい白)のように見えます。
  4. 卵巣の動画をBモードで撮影して保存するには、フレーム数が増えるまで待って(最大100フレーム)、キーパッドの シネストア ボタンを押します。
  5. 卵巣の識別を確認し、低速の流れに対して高感度で血管を視覚化するには、コントロールパネルの指定されたキーを押して、 Bモード から パワードップラーモード に切り替えます。
  6. キーパッドのノブを回して、卵巣血管系を最適に視覚化するために、次のパワードップラー設定を調整します。ドップラーゲイン:32-55dB;感度:5;ダイナミックレンジ:15 DR;速度1kHz。
    注意: 値は view 左側のパネルで、ノブを回すと変化します
  7. パワード ップラーモード または カラード ップラーモード (キーパッドの指定されたキーを押す)では、プラットフォームをゆっくりと前後に動かして、血管系のさまざまな側面を視覚化して、次の血管を識別します: (i) 卵巣動脈(OA)、腹部大動脈から分岐し、POATの方向から卵巣門に入ります。 (ii) 中央髄質内の髄質血管 (MV);(iii) 外皮質の発達中の卵胞を取り囲む皮質血管(CV)(図1B)。
    注:皮質血管は、直径が小さく、流速が低いため、一貫して見えない場合があります。卵胞の基部にある血管はより簡単に検出できますが、頂点にある血管は、特に排卵の直前に見えないことがよくあります。
  8. Cine storeを押して、卵巣とその血管系のビデオをパワーまたはカラードップラーモードでいつでもキャプチャし、現在画面に表示されているビデオを保存します。
  9. 動脈と静脈の流れを区別するには、キーパッドのカラード ップラーモード キーを押します。このモードでは、流れの方向は色分けされており、赤はトランスデューサへの流れを示し、青はトランスデューサから離れる流れを示します。平均速度が高い血管は卵巣動脈です。
  10. 血液灌流の変化は、血管のサイズと色の強度(パワードップラーでは黄色、カラードップラーでは赤または青)を視覚化することにより、カラーまたはパワードップラーモードで評価できます。

5. カラーおよびパワードップラー超音波検査による血行動態の評価

  1. カラードップラーモードまたはパワードップラーモードのいずれかで、超音波システムのキーボードの パルス波(PW)ドップラー ボタンを押します。これにより、サンプルボリュームゲート(つまり、2本の水平線)が表示されます。 PWボタン をもう一度押すと、下部パネルのドップラースペクトル波形がアクティブになります。
  2. サンプルゲート(調整可能な測定ツール - ユーザーが速度を測定する領域を定義できるようにする)を血管内腔の中心内に配置し、血流の方向と位置合わせするようにします。正確な速度計算を確実にするために、超音波角度を血管とできるだけ平行になるように調整し、≤60° に維持します。対応する 角度 ノブを回して、音響角度を調整します。
  3. 容器の種類ごとに、サンプルゲートを次の位置に配置します。卵巣動脈:卵巣への入り口のすぐ近位の血管内。髄質血管:MVが皮質血管に分岐する中央分岐点。この分岐点は、卵巣に入った直後に血たまりとして現れます。皮質血管:識別可能な場合、成長している卵胞の基部にある血管内。
  4. サンプルゲートが目的の位置に配置され、明確なパルス波形が表示されたら、 Cine Store を押して超音波画像と対応するスペクトルドップラー波形の両方を記録して保存します。
  5. イメージングが完了したら、マウスをイメージングプラットフォームからそっと取り外します。背面から超音波ジェルを拭き取り、マウスが完全に目覚めるまで加熱パッドの上に置きます。

6. データのエクスポートと保存

  1. すべてのイメージングを完了し、 シネストア 機能を使用して目的の静止フレームとシネループを保存した後、超音波システムのキーボードの左上にある 治験管理 ボタンを押します。これにより、 スタディブラウザ ウィンドウが開き、現在のセッションから保存されているすべての画像とシネループのリストが表示されます。
  2. スタディ ブラウザ ウィンドウで、保存するファイルを選択します。
    1. シリーズ全体を保存するには、対応するシリーズ名を選択すると、関連するすべての画像とシネループが自動的に強調表示されます。[ コピー先] ボタンをクリックして続行します。
    2. プロンプトが表示されたら、エクスポートしたファイルを保存する宛先フォルダーまたは外付けドライブをクリックします。エクスポートを完了する前に、ファイル形式と送信先パスが正しいことを確認してください。

7. シーケンスをオフにしてクリーンアップする

注:これらの手順は、イメージングが終了し、すべてのデータが保存およびエクスポートされた直後に完了する必要があります。

  1. 必要なデータをすべてエクスポートしたら、解析ソフトウェアアプリケーションのスタディブラウザウィンドウでシャットダウンアイコンをクリックします。これにより、集録コンピュータとコントロールパネルの両方の電源が安全にオフになります。
  2. システム冷却ファンを 5 分から 10 分間作動させます。冷却が完了したら、イメージングカートの背面にあるトグルを使用して主電源をオフにします。
  3. 酸素供給、イソフルラン気化器、生理学的モニタリングユニットなど、すべての補助機器の電源を切ります。
  4. 超音波トランスデューサーの清掃: まず、糸くずの出ないワイプを使用して残っている超音波ジェルを拭き取り、次に湿った糸くずの出ないワイプまたは敏感な電子機器に推奨される消毒用ワイプで表面を消毒します。
  5. マウスプラットフォームとキーボードを消毒用ワイプで掃除します。マウスプラットフォームの電極にエチルアルコールを使用すると、敏感なコンポーネントが損傷する可能性があるため、使用しないでください。
  6. 湿らせたペーパータオルで誘導チャンバーを拭きます。ペーパータオルはバイオハザード廃棄物容器に捨ててください。
  7. 使い捨ての材料(手袋、サージカルテープ、ガーゼ、綿の先端のアプリケーターなど)はすべて、指定されたバイオハザード容器に廃棄してください。

8. ドップラー脈拍波形を用いた血行動態パラメータの測定

  1. 解析アプリケーションで、[ コピー元]をクリックし、ドロップダウン メニューから適切な名前を選択し、スタディが保存されている場所に移動して選択し、[ OK ]をクリックしてインポートします。
  2. 目的のPWドップラー画像を開き、左下隅にある 測定 アイコンをクリックして測定パネルを開きます。
  3. 測定パネルの左上隅にある 速度測定 ツールをクリックし、PSV波とEDV波の上部をクリックして、スペクトルドップラー波形から3つの最高ピーク収縮期速度(PSV)と拡張末期速度(EDV)を定量化します(ツールは、クリックポイントからx軸までの波のサイズを自動的に測定します。明確で一貫したPSVおよびEDVピークを持つ少なくとも3つの異なる心周期を表示する波形のみを含めます。
  4. 平均速度を計算するには、まず、選択した 3 つの PSV 値の平均と 3 つの EDV 値の平均を計算します。次に、平均速度 = (平均 PSV + 平均 EDV)/2 の式を使用して平均速度を計算します。
  5. 検出閾値10mm/sを下回る速度については、5mm/s(閾値を下回る平均速度)の値を割り当てるか、研究目的に基づいて測定を破棄します。
  6. 抵抗指数 (RI) を計算するには、標準式 RI = (PSV - EDV)/PSV を使用します。この指数は血管抵抗の尺度を提供し、精度を高めるために平均 PSV 値と EDV 値を使用して計算する必要があります。
  7. 拍動指数 (PI) を計算するには、PI = (PSV - EDV)/平均速度の標準式を使用します。

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結果

このプロトコルの目的は、ドップラー超音波検査を適用してマウスの卵巣とその血管系を視覚化し、卵巣灌流の変化を評価し、卵巣の血行動態を定量化することです。

図2は、hCG注射後の排卵周辺期(排卵前12時間および排卵後12時間)の複数の時点での同じ卵巣の代表的な画像を示しています。 図2A は、POATおよび卵管に対する卵巣の位置を特定するために使用されるBモード画像を示しています(プロトコルのステップ4.3)。 図2B は、血流に対する高い感度を提供し、内部血管構造の視覚化を通じて卵巣の識別を確認するのに役立つ対応するパワードップラー画像を示しています(ステップ4.7)。パワードップラーは、経時的な灌流ダイナミクスの定性的評価と、OA、MV、CVなどの異なる血管タイプの同定を可能にします。灌流の増加は、信号強度の向上と血管の拡張によって反映さ...

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ディスカッション

この研究では、ドップラー超音波検査を使用して in vivo で 卵巣の血行動態を視覚化および定量化するための非侵襲的方法を紹介します。既存の方法とは異なり、このアプローチでは血管機能を損なうことなく血流をリアルタイムで評価できます。ドップラー超音波検査は、ヒトおよび大型動物モデルの卵巣形態と血管機能を評価するために広く使用されている効果的なツールです15、16、17、18。マウスの卵巣生理学への応用は、卵巣血管動態の研究に貴重な進歩をもたらします。

ドップラー超音波は、マウスモデルの血流を評価するための非侵襲的で再現性のあるアプローチを提供し、従来の技術に比べていくつかの利点を提供します。放射性標識マイクロスフェア注射などの従来の方法は、侵襲...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、NICHD 1R01HD109392 によってサポートされました。画像データは、VisualSonics Vevo-2100超音波のNIH S10OD016191とともに、コーネルバイオテクノロジーリソースセンター(BRC)のイメージング施設を通じて取得されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3M手術用テープVWRインターナショナルLLCMMM1534-3
アクアソニッククリア超音波伝導ジェル パーカーPKR-03-08
ヘアクリッパースカルシェイバーLLCBBT 2020
ヒト絨毛膜性ゴナドトロピンシグマ・オルドリッチ9002-61-3
ナイアボディクリーム 脱毛剤ナイル脱毛
Optixcareアイルーブプラス アヴェンティクスOPX-4252
パーカー・シグナクレーム電極クリームパーカーPKR-17-05-CS
妊娠中のメア血清 ゴナドトロピン創造酵素NATE-0969
VisualSonics Vevo 2100イメージングシステムビジュアルソニックス社

参考文献

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