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方法論記事

閉経後骨粗鬆症における RANKL/OPG 骨保護メカニズムを調査するための CLCF1 運動誘発ミオカイン プロトコル

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DOI:

10.3791/69172

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2025年11月7日

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

この記事について

サマリー

この記事では、閉経後骨粗鬆症における RANKL/OPG 軸調節による骨保護の運動誘発性メディエーターとしての強腎刺激ホルモン様サイトカイン第 1 因子 (CLCF1) を調査するための包括的なプロトコルを紹介します。

要約

最近の研究では、強腎刺激ホルモン様サイトカイン因子 1 (CLCF1) が、筋骨格系の利点を媒介する運動誘発性の「若年分子」であることが特定されていますが、年齢とともに減少します。このプロトコルは、免疫骨クロストークメカニズム を介して 運動を介した骨保護におけるCLCF1の調節的役割を調査するための体系的なアプローチを説明しています。この方法論には、核因子-κB リガンド (RANKL)/オステオプロテゲリン (OPG) シグナル伝達軸の受容体活性化因子に対する CLCF1 の影響を解明するための臨床サンプル分析、分子特性評価技術、および機能アッセイが含まれます。定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR)、ウェスタンブロッティング、CRISPR/Cas9 遺伝子編集、および共培養システムを通じて、このプロトコルは、STAT1 を介した破骨細胞阻害と STAT3 を介した骨芽細胞促進 を介した CLCF1 の二重の骨保護作用を実証します。記載されている方法により、CLCF1 発現パターンの包括的な評価、骨密度パラメーターとの相関分析、および潜在的な運動模倣治療介入の機構評価が可能になります。主に破骨細胞を標的とする従来の吸収防止療法とは異なり、CLCF1 ベースの介入は、吸収を阻害しながら骨形成を同時に促進するという独自の利点を提供する可能性があります。このプロトコルは、運動誘発性サイトカインを介した骨代謝の調節を調査するための標準化された手順を研究者に提供し、加齢に伴う骨障害に対する標的治療介入の開発を促進します。

概要

閉経後骨粗鬆症 (PMOP) は、免疫系の調節不全が病的な骨量減少を引き起こす加齢に伴う筋骨格系の低下のパラダイム的な例です 1,2,3。運動は加齢に伴う骨の劣化を防ぐための最も効果的な非薬理学的介入として広く認識されていますが、運動による骨保護の根底にある正確な分子メカニズムは、最近までとらえどころのないままでした4。骨代謝の現代の理解は、従来の内分泌学的枠組みを超えて進化し、骨格恒常性を支配する複雑な骨免疫相互作用と運動誘発性ミオカインを網羅しています5。

加齢に伴う筋骨格系の低下と戦う運動誘発因子としての心刺激ホルモン様サイトカイン因子 1 (CLCF1) の最近の同定は、骨と筋肉のクロストークを理解する上でのパラダイムシフトを表しています6。この画期的な発見は、これまで知られていなかった分子メカニズムを通じて運動の十分に確立された骨保護効果を説明し、CLCF1 を運動誘発性骨同化作用の重要なメディエーターとして位置づけています7。CLCF1を過剰発現するトランスジェニックマウスは、野生型対照と比較して骨形成の強化、耐糖能の改善、および優れた身体能力を示し6、CLCF1補給が座りがちな集団または運動障害のある集団における運動の利点を模倣する可能性があることを示唆しています。

運動模倣治療は、運動誘発性 CLCF1 動態を再現する薬理学的介入として定義され、分子経路を通じて身体活動と同様の治療効果をもたらします8。ニューロトロフィン-1(NNT-1)またはB細胞刺激因子-3(BSF-3)とも呼ばれる強誘栄養因子様サイトカイン第1因子(CLCF1)は、インターロイキン-6(IL-6)サイトカインスーパーファミリーに属し、多面的な生物学的機能を示します8。もともと脊髄運動ニューロンの生存と発達における神経栄養特性を特徴としていましたが、運動誘発性ミオカインとしての CLCF1 の役割は、重要な研究分野として浮上しています。最近の臨床研究では、CLCF1 が骨の健康状態のバイオマーカーとして検証されており、骨粗鬆症の閉経後の女性では、末梢血単核細胞の CLCF1 タンパク質レベルが健康な対照と比較して有意に低下していることが実証されています9。これらの研究は、複数の骨格部位における CLCF1 発現と骨密度との間に正の相関関係があることを示し、CLCF1 を標的とした治療介入の翻訳可能性を強化する臨床検証を提供しました。

サイトカインは、可溶性毛様体神経栄養因子受容体(sCNTFR)やサイトカイン受容体様因子-1(CRLF-1)などのヘテロマー受容体複合体を介して作用し、多様な細胞応答を調整します10,11。最近の機構研究により、CLCF1 が骨吸収を阻害し、骨形成を促進するという二重シグナル伝達パラダイムが解明されました 2,6,7,9。この二重作用は、示差シグナルトランスデューサーと転写活性化因子(STAT)経路の活性化によって起こります:STAT1リン酸化は、核因子-κBリガンド(RANKL)誘導核因子-κB(NF-κB)シグナル伝達の受容体活性化因子を妨害することにより破骨細胞抑制を媒介しますが、骨芽細胞におけるSTAT3活性化は、アルカリホスファターゼやオステオカルシンなどの骨形成マーカーの発現を促進します。

急性運動反応が慢性的な骨適応にどのように変換されるかを理解することは、治療開発にとって依然として重要です13。1 回の運動発作後の急性 CLCF1 上昇はメカニズムの洞察を提供しますが、数週間から数か月にわたる急性反応が繰り返されると、累積的なシグナル伝達と細胞適応を通じて持続的な骨保護効果が得られる可能性があります14。

骨免疫病態生理学におけるCLCF1を調査する理論的根拠は、Bリンパ球調節におけるCLCF1の確立された役割と、B細胞がRANKLとオステオプロテゲリン(OPG)の両方の重要な生産者を構成するという認識に由来しています12,13。核因子-κBリガンド(RANKL)/オステオプロテゲリン(OPG)軸の受容体活性化因子は、破骨細胞の分化と骨吸収の中心的な調節メカニズムとして機能します14,15。骨リモデリング調節を通じて骨格恒常性に対する調節制御を実証した他のIL-6ファミリーメンバーとは異なり、CLCF1のユニークな二重骨保護メカニズムは、優れた治療可能性を提供します16,17,18。

既存の方法論に対するこのプロトコルの利点には、CLCF1 を介した骨代謝調節へのトランスレーショナルな洞察を提供する臨床相関分析と機構細胞研究の両方を組み込んだ、運動骨免疫調査への包括的なアプローチが含まれます。このプロトコルの臨床的関連性は、CLCF1 レベルがライフスタイル介入によって調節できるという新たな証拠によってさらに強化され、加齢に伴う骨疾患の実用的な治療標的として位置づけられています。

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プロトコル

このプロトコルは、機関研究倫理委員会 (プロトコル #2024-CHSD-0156) によって承認されており、ヘルシンキ宣言の原則に準拠しています。すべての動物処置は、施設の動物管理および使用委員会のガイドライン (プロトコル #2024-037) に準拠しました。すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1. 臨床サンプルの収集と運動介入の評価

  1. 参加者の募集と運動履歴の評価
    1. 閉経後最低1年の55〜75歳の閉経後の女性を募集します。
    2. 標準化された身体活動アンケートを使用して、過去 6 か月間の身体活動の頻度、強度、種類、期間などの詳細な運動履歴を評価します。
    3. WHO の運動ガイドラインに基づいて、参加者を座りがちなグループ (週 150 分<)、中程度の活動 (週 150-300 分)、および非常に活動的なグループ (週 300 分>) に分類します。
    4. 投薬レビューや併存疾患スクリーニングを含む、包括的な病歴評価と身体検査を実施します。
    5. APEXソフトウェアv4.5を搭載したHologic Discovery A濃度計を使用して、デュアルエネルギーX線吸収測定(DXA)測定値を取得します。スパインファントムで毎日のキャリブレーションを実行します。国際臨床密度測定学会 (ISCD) のガイドラインに従って、ポジショニング ブロック上で脚を上げて患者を仰臥位に配置します。
    6. 世界保健機関の骨粗鬆症基準 (T スコア ≤ -2.5 SD) に従って参加者を分類します。
    7. 除外基準を適用する:12か月以内の以前の抗骨粗鬆症療法、免疫抑制治療、代謝性骨疾患、二次性骨粗鬆症、または運動試験の禁忌。
  2. 運動誘発性 CLCF1 反応評価
    1. EDTA チューブで 12 時間の一晩絶食した後、午前 8:00-10:00 の間にベースラインの血液サンプルを収集します。
    2. 標準化された急性運動プロトコルを実装します: 最大心拍数 65-70 % で 45 分間の中強度のウォーキング。カルボネン式を使用して最大心拍数を計算します (220 歳)19.チェストストラップモニター を介して 継続的な心拍数モニタリングを備えた電動トレッドミルで運動を行います。目標心拍数を達成するためにグレード調整を行い、歩行速度を3.5〜4.5 km / hに維持します。
    3. 運動後の血液サンプルを 1 時間、4 時間、および 24 時間の時点で収集して、CLCF1 動態を評価し、一貫した収集条件を維持します。
    4. その後のCLCF1定量のために、血清アリコートを-80°Cで保存します。検出範囲が31.2-2000 pg/mLのヒトCLCF1 ELISAキットを使用してください。サンプルをアッセイ希釈液で1:2に希釈します。2倍の連続希釈液を使用して7ポイントの標準曲線を準備します。サンプルを重複して実行します。540 nmの波長補正で450 nmでプレートを読み取ります。重複間の変動係数 (CV) < 20 % を受け入れます。
  3. 縦断的運動介入プロトコル
    1. 週に 3 回のセッションを含む 12 週間の漸進的な運動プログラムを設計します。
    2. CLCF1 軌道分析のために、ベースライン、4、8、および 12 週間で血液サンプルを収集します。
    3. ベースラインとエンドポイントで VO2 max テストを使用してフィットネスの改善を評価します。
    4. CLCF1 の変化を、12 週間で DXA によって測定された BMD 改善と相関させます。
    5. 運動耐性や回復パターンなど、トレーニングの適応を文書化します。

2. 末梢血単核球(PBMC)の単離と処理の強化

  1. CLCF1分析用に最適化されたPBMC分離
    1. 無菌条件下で EDTA 含有チューブ (チューブあたり 5 mL EDTA) に 20 mL の静脈血サンプルを収集します。
    2. 最適な細胞生存率とCLCF1発現保存のために、収集から2時間以内にサンプルを処理します。
      1. 血液サンプルを室温でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1に希釈します。20 mLの血液と20 mLのPBSを混合します。
      2. 50 mLコニカルチューブ内の密度勾配培地に希釈した血液を層状にします。希釈血液20mLあたり15mLの密度勾配培地を使用します(1:1.33比)。
    3. ブレーキをかけずに室温で400×gで30分間遠心分離します。
    4. 滅菌パスツールピペットを使用して、プラズマ-Ficoll界面のPBMC層を慎重に吸引します。
    5. 2%ウシ胎児血清(FBS)を含むPBSで300 × g で10分間遠心分離することにより、細胞を2回洗浄します。
  2. 細胞生存率評価とCLCF1ベースライン測定
    1. トリパンブルー排除法(目標>95%生存率)を使用して細胞生存率を決定します20。
    2. 単離直後のベースライン細胞内CLCF1発現を評価します。
    3. 適切な培地で細胞濃度を1×106細胞/mLに調整します。
    4. 下流のアプリケーションにセルを割り当てるか、液体窒素に保管します。PBMCを90%FBS + 10%DMSOを含む凍結培地で凍結します。-1°C/分から-80°Cの制御された速度の凍結容器を使用してください。 1 mLのアリコート(5 × 106 細胞/バイアル)をクライオバイアルに保存します。

3. 包括的な定量的遺伝子発現解析

  1. CLCF1特有の考慮事項によるRNA抽出と精製
    1. 単離後1時間以内に1 mLのRNA溶解試薬で106個のPBMC×溶解します。
    2. 200 μLのクロロホルムを加え、激しくボルテックスし、室温で3分間インキュベートします。
    3. 12,000 × g で 4 °C で 15 分間遠心分離し、相分離を実現します。
    4. 水相を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えます。
    5. 4°Cで12,000 × g で10分間遠心分離してRNAを沈殿させます。
    6. RNAペレットを75%エタノールで洗浄し、自然乾燥させ、ヌクレアーゼフリーの水に溶解します。
    7. アガロースゲル電気泳動またはバイオアナライザー(ターゲットRIN>7.0)を使用してRNAの完全性を評価します。
  2. 更新されたプライマーセットによる逆転写および定量PCR
    1. 分光光度分析を使用してRNA濃度を定量します(ターゲットA260 / A280比1.8-2.2)。
    2. 逆転写試薬キットで1μgのトータルRNAを使用して逆転写を行います。
    3. qPCR反応の調製:10 μLのマスターミックス、0.8 μLの各プライマー(10 μMストック、最終400 nM)、2 μLのcDNAテンプレート(50 ng)、6.4 μLのヌクレアーゼフリー水を含む20 μLの反応を調製します。3 回実行します。リアルタイムPCRシステムを使用します。
    4. 検証済みのプライマー配列を使用します。
      1. CLCF1フォワード:5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3'、
        リバース: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1フォワード:5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3'、
        リバース: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 フォワード: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3'、
        リバース: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3フォワード:5'-CAGCAGCTTGACACGGTA-3'、
        リバース: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. qPCRプロトコルを実行します:95°Cで10分間、続いて95°Cで15秒間、60°Cで1分間の40サイクルを実行します。
    6. β-アクチン正規化21で2(-ΔΔCt)法を使用して結果を分析します。
  3. 運動反応遺伝子パネル解析
    1. 運動反応性遺伝子を含む:IL-6、TNF-α、IL-1β、BDNF、IGF-1、およびミオスタチン。
    2. 検証済みのプライマー配列を使用します。
      1. IL-6フォワード:5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3'、
        逆:5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3';
      2. TNF-αフォワード:5'-CCCAGGGACCTCTCTCTCTAATC-3'、
        逆:5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1βフォワード:5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3'、
        リバース:5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF フォワード: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGT-3'、
        逆:5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. IGF-1フォワード:5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3'、
        逆:5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. ミオスタチンフォワード:5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3'、
        リバース:5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'。
    3. CLCF1の運動誘発性変化を他のミオカイン発現パターンと相関させる。
    4. 機能的サイトカイン複合体形成の指標としてCLCF1/CRLF1共発現比を評価します。

4. STAT経路に焦点を当てたタンパク質発現解析の強化

  1. STAT分析のためのタンパク質抽出と定量
    1. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを添加した溶解バッファー(150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、50 mM Tris-HCl pH 8.0)でPBMCを溶解します。
    2. 使用直前に、いくつかの特定のホスファターゼ阻害剤を追加します:オルトバナジン酸ナトリウム(1 mM)とフッ化ナトリウム(50 mM)。
    3. ライセートを氷上で30分間インキュベートし、10分ごとに中速で周期的にボルテックスします。
    4. 12,000 × g で 4 °C で 15 分間遠心分離し、細胞破片を除去します。
    5. BradfordアッセイまたはBCAメソッド22を使用してタンパク質濃度を定量します。
    6. サンプルバッファーでタンパク質濃度を2 μg/μLに調整し、ウェスタンブロッティングアプリケーション用のさらなる分析まで-80°Cで保存します。
  2. STATシグナル伝達焦点による包括的なウェスタンブロット分析
    1. 標準的なアクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液を使用して、10 mLの10%SDS-PAGEゲルを調製します。
    2. 事前に染色された分子量マーカーと一緒にレーンあたり20 μgのタンパク質をロードし、120 Vで90分間分離します。
    3. 転写バッファー(25 mM Tris、192 mMグリシン、20%メタノール)を使用して、タンパク質を100 Vで4°Cで2時間PVDFメンブレンに転写します。
    4. 0.1%Tween-20(TBST)を含むTris緩衝生理食塩水中の50%脱脂粉乳50mLでメンブレンをブロックします。
    5. 一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします:抗CLCF1(1:1,000);抗CRLF1(1:1,000);アンチOPG(1:1,000);反RANKL(1:1,000);アンチJAK2(1:1,000);抗リン酸化JAK2(Tyr1007/1008、1:1,000);アンチSTAT1(1:1,000);抗リン酸化 STAT1 (Tyr701、1:1,000);アンチSTAT3(1:1,000);抗リン酸化 STAT3 (Tyr705、1:1,000);抗βアクチン(1:1,000)
    6. メンブレンを15 mLのTBSTでそれぞれ10分間3回洗浄します。適切な二次抗体と室温で1時間インキュベートします。
    7. 強化された化学発光基質を使用してタンパク質バンドを検出します。自動露出最適化付き化学ルミネセンスイメージングシステムを用いた画像ImageJ v1.53ゲル分析ツールを使用したデンシトメトリック分析を使用して定量します。
  3. STAT1/STAT3デュアルパスウェイ解析
    1. ImageJ/Fiji ソフトウェアバージョン 1.54f を使用して、リン酸化 STAT1/総 STAT1 およびリン酸化 STAT3/総 STAT3 比を計算します。
    2. CLCF1 機能活性の指標として STAT1/STAT3 活性化バランスを評価します。
    3. STAT活性化パターンをRANKL/OPG発現比と相関させる
    4. CLCF1 処理後 0、15、30、60、120、および 240 分でウェスタンブロット を介して STAT1/STAT3 リン酸化を評価します。デンシトメトリーを使用して、リン酸化タンパク質を総タンパク質レベルに正規化します。

5. 検証による高度なCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウト

  1. レンチウイルスベクターの構築強化
    1. CLCF1遺伝子配列を標的とするシングルガイドRNA(sgRNA)を設計します。
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'。
    2. ノックアウト効率を向上させるために追加のsgRNA配列を含めます。
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'。
    3. 標準的な分子クローニング技術を用いてsgRNAをレンチウイルスベクターにクローニングする
    4. DNAシーケンシング解析によるコンストラクトの完全性を検証します。
    5. T7エンドヌクレアーゼIアッセイ23を使用してsgRNA切断効率を評価します。
    6. 阻害剤を使用した経路特異性検証を含めます:AG490(JAK2、50 μM)、フルダラビン(STAT1、10 μM)、およびStattic(STAT3、5 μM)。
    7. 構成的に活性なSTATコンストラクトを使用してレスキュー実験を実行し、経路の必要性を検証します。
  2. 最適化されたレンチウイルス形質導入プロトコル
    1. 10%FBSを添加したRPMI-1640培地(500 mL)でRaji細胞を培養します。すべての細胞培養を5%CO2の加湿インキュベーターで37°Cに維持します。使用前に培地を少なくとも30分間予備平衡化します。
    2. 細胞をポリブレン(8 μg/mL)で前処理して、形質導入効率を高めます。
    3. リン酸カルシウムトランスフェクション を介して 、パッケージングおよびエンベローププラスミドを備えたHEK293T細胞を使用してレンチウイルスを産生します。p24 ELISAで力価を測定します(>108 TU / mLが必要)。BSL-2収容プロトコルに従ってください23.
    4. 100の感染多重度(MOI)でレンチウイルスで細胞を形質導入します。形質導入後24時間で培地を交換します。ピューロマイシン(4 μg/mL)を7日間用いて形質導入細胞を選択し、次のPCR条件を使用して標的部位にまたがる500 bp領域を増幅します:95°Cで3分間の初期変性、続いて95°Cで30秒間変性を35サイクル、60°Cで30秒間アニーリング、72°Cで30秒間伸長、 72°Cで5分間最終延長します。T7エンドヌクレアーゼアッセイでは、PCR産物を変性および再アニールし、T7E1エンドヌクレアーゼで37°Cで30分間消化し、2%アガロースゲルで生成物を分析します。
    5. ウェスタンブロッティングとサンガーシーケンシング24,25による遺伝子ノックアウト効率の検証。
    6. GUIDE-seqまたは同様の方法論を使用してオフターゲット分析を実行します26。
      注:最近の証拠は、CLCF1の分泌効率がCRLF1シャペロンタンパク質との共発現を必要とすることを示しています。完全な機能的アブレーションのためのデュアルノックアウトアプローチを検討してください27。

6. 運動模倣物による包括的な共培養システム

注:翻訳検証のために、rhCLCF1を10μg/kgのi.p.で投与することにより、卵巣摘出マウスモデルに適応します毎日4週間、マイクロ CTを介して BMDを評価します。

  1. 高度なRaji-MG-63共培養セットアップ
    1. MG-63骨芽細胞様細胞を、5%CO2、湿度95%の37°Cの加湿インキュベーターで、2×104細胞/ウェルの密度で24ウェルプレート下部チャンバーに播種します。使用前にインキュベーター内で培地を30分間プレ平衡化します。翻訳を強化するには、市販の供給源からの初代ヒト骨芽細胞(密度1×104 /ウェル)で置き換えます。
    2. 0.4 μmの孔径のメンブレンインサートをMG-63細胞を含むウェルに入れます。
    3. ラジ細胞(野生型、CLCF1ノックアウト、またはCLCF1過剰発現)を1×10〜10細胞/ウェルの密度で上部チャンバーにシードします。
    4. 完全なRPMI-1640培地(下部チャンバーに2 mL、上部チャンバーで1.5 mL)で、5%CO2で指定された実験期間(7、14、21日)の間、共培養を維持します。
    5. 組換え CLCF1 (5-10 ng/mL) 治療群を含めて、用量反応関係を評価します。
  2. 運動模倣 CLCF1 治療プロトコル
    1. 運動誘発レベルに基づいて、組換えCLCF1の生理学的濃度(5-10 ng / mL)で共培養システムを処理します。
    2. 拍動性 CLCF1 治療レジメンの適用: 1 日目の 0、8、および 16 時間に CLCF1 を 2 時間パルスに適用し、続いて 24 時間連続曝露し、その後サイクルを繰り返します。総治療期間: 合計 9 パルスで 7 日間。
    3. 治療後 1 時間、4 時間、24 時間、および 7 日で時間依存効果を評価します。
    4. ウェスタンブロット を介して 両方の細胞集団におけるSTAT1 / STAT3リン酸化動態を0、15、30、60分で監視します。阻害剤を含むバッファー(500 μL)で細胞を溶解し、総STAT1/3およびβ-アクチンに正規化します。
  3. 骨形成分化評価の強化
    1. アスコルビン酸(50 μg/mL)、β-グリセロリン酸(10 mM)、およびデキサメタゾン(10 nM)を含む標準的な骨形成培地を使用して、骨形成分化を誘導します。骨形成培地を3日ごとに交換します(下部チャンバー2 mL、上部チャンバー1.5 mL)。変更ごとに新鮮なアスコルビン酸溶液を調製します。β-グリセロリン酸とデキサメタゾンは安定したままです。
    2. 7、14、および21日目に比色酵素アッセイを使用してアルカリホスファターゼ(ALP)活性を評価します28。500 μLの抽出量を使用します。405 nmで読み取ります。総タンパク質含有量に正規化します。予想される色の範囲: 淡黄色 (低) から濃い黄色 (高)。
    3. 21日目のアリザリンレッドS染色と定量によるカルシウム沈着を評価します。500 μLの塩化セチルピリジニウムで抽出し、540 nmで読み取り、予想される色の範囲:淡いピンク(低無機化)から濃い赤(高無機化)。
    4. 塩化セチルピリジニウム抽出後の540 nmでの吸光度を測定することにより、無機化を定量化します。
    5. 骨形成遺伝子発現を解析します:RUNX2、ALP、COL1A1、OCN、およびOPGステップ3.2で説明したqPCRプロトコルを使用して。
    6. 破骨細胞関連マーカーを評価する:MG-63細胞におけるTRAP、カテプシンK、およびRANKL。

7. 高度な統計分析とデータ解釈

  1. 包括的な統計手法
    1. すべての連続変数に対してShapiro-Wilk検定を使用して正規性検定を実行します29。正規性の仮定に違反した場合は、ノンパラメトリック検定を使用します(p < 0.05)。
    2. グループ間のノンパラメトリック比較にマンホイットニーのU検定を適用します30。
    3. CLCF1 レベルと臨床パラメーターの間の関連研究のためのスピアマン相関分析を実施します31。
    4. 重回帰分析を実行して、BMD の独立した予測因子を評価します。
    5. 運動介入の経時分析に反復測定 ANOVA を使用する32.
    6. 多重比較にボンフェローニ補正を適用する33.
    7. すべての分析で統計的有意性しきい値を p < 0.05 に設定します。
  2. 強化されたデータ表示と分析
    1. 連続データを平均値±標準偏差または四分位範囲の中央値として表示します。
    2. 統計にはGraphPad Prism v9、密度測定にはImageJ v1.53を使用して、CLCF1発現とBMD、リンパ球数、および運動パラメータの相関プロットを作成します。カスタムスクリプトは必要ありません。Prismの組み込みツール を介して ROCを生成します。プリズムのスピアマン による 相関。
    3. 運動誘発性CLCF1応答動態の経時プロットを生成します。
    4. 骨粗鬆症バイオマーカーとしてのCLCF1の受信者動作特性(ROC)曲線を開発します。
      注:代表的なウェスタンブロット画像は、定量的密度分析を使用して作成されました。

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結果

このプロトコルの実装は、複数の実験的アプローチを使用して、免疫介在性骨代謝における CLCF1 の調節的役割を首尾よく実証します。臨床検証研究では、健康な対照と比較してPMOP患者におけるCLCF1発現の有意なダウンレギュレーションが示されており、 図1Aに示されているように、末梢血単核細胞の定量的PCR分析では、相対的なCLCF1 mRNAレベルがPMOP群(n = 109)で著しく低下し、健康な閉経後対照(n = 94)と比較して、発現が約40%減少しました(p < 0.001)。この発見はタンパク質レベルで確認され、ウェスタンブロット分析により、PMOP患者におけるCLCF1タンパク質(35 kDa)発現の減少が明らかになり、濃度定量では対照と比較して約25%の減少が示されました(p < 0.001; 図1B)。

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ディスカッション

本明細書に記載されているプロトコルは、RANKL/OPG軸の体系的な分析を通じて、骨保護の運動誘発メディエーターとしてのCLCF1の役割を調査するための包括的な方法論的枠組みを提供する。最近の画期的な研究により、CLCF1 は加齢に伴う筋骨格系の低下と戦う運動誘発因子として特定され、運動誘発性骨保護の中心的なメディエーターとして位置づけられています 34,35,36。この強化されたプロトコルは、二重の骨保護作用を持つ新たに同定された運動模倣因子を調査するための標準化された方法論を提供することにより、骨免疫学における重要な知識のギャップに対処します。

最近の技術的進歩によって特定された重要なステップは、CLCF1 応答動態を最適化するための細心の注意を払った運動介入設計、サンプル処理中の STAT リン酸化の慎重な保存、および骨と免...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

著者らは、この研究に志願して参加した参加者と、山東第一医科大学付属中央病院の臨床スタッフが患者の募集とサンプル収集を支援してくれたことに感謝します。細胞培養と分子生物学実験をサポートしてくださった検査技術者に感謝します。H.Z.は研究を考案して設計し、実験を行い、データを分析し、原稿を書きました。H.L.は、実験計画、データ収集、原稿の改訂に貢献しました。Y.S.はプロジェクトを監督し、批判的なフィードバックを提供し、原稿を編集しました。すべての著者が最終原稿をレビューし、提出を承認しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>細胞培養培地&試薬<強さ>
ジメチルスルオキシド(DMSO)シグマ・オルドリッチD2650Purpose_Application: 低温保存培地成分
Specifications_Comments:分子生物学グレード、滅菌ろ過済み
DMEM媒体サーモフィッシャー・サイエンティフィック11965092Purpose_Application: MG-63骨芽細胞培養培地
Specifications_Comments:L-グルタミンを含む高グルコース製剤
胎児用牛血清(FBS)サーモフィッシャー・サイエンティフィック16000044Purpose_Application: 細胞培養サプリメント(熱不活化)
Specifications_Comments:56Âで熱不活化;°Cは30分間
ペニシリン・ストレプトマイシンサーモフィッシャー・サイエンティフィック15140122Purpose_Application: 無菌培養用抗生物質サプリメント
Specifications_Comments:100倍ストック、最終濃度1%
ポリブレン(ヘキサジメトリン臭化物)サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-134220Purpose_Application: レンチバイラルトランスダクションエンハンサー
Specifications_Comments:8 μg/mL作動濃度
プロマイシンジヒドロ塩化物インビボジェンアント-PR-1Purpose_Application: 遺伝子転換細胞
Specifications_Comments選択抗生物質:4 μ7日間のg/mL選択濃度
RPMI-1640 ミディアムサーモフィッシャー・サイエンティフィック11875093Purpose_Application: ラジBリンパ球培養培地
Specifications_Comments:L-グルタミンを含み、フェノールレッドなしが推奨されます
トリパン・ブルー・ソリューションサーモフィッシャー・サイエンティフィック15250061Purpose_Application: 細胞生存評価
Specifications_Comments:除外アッセイの0.4%溶液
制御速度冷凍容器サーモフィッシャー・サイエンティフィック5100-0001Purpose_Application: 制御レートセル凍結(-1°C/min)
Specifications_Comments:ミスター・フロスティまたは-1Â相当;°C/min冷却
EDTA血液採取チューブBDバイオサイエンス366643Purpose_Application: 抗凝固剤
Specifications_Commentsを用いた静脈採血:10〜20 mL容量、紫色の上部管
フィコル・パケ プラス密度勾配Cytiva(GEヘルスケア)17144003Purpose_Application: 密度遠心分離によるPBMC分離
Specifications_Comments:無菌で細胞分離のためのエンドトキシン試験済み
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャー・サイエンティフィック14190144Purpose_Application: 細胞洗浄および希釈バッファー
Specifications_Comments:滅菌、細胞培養グレード
<ストロング>RNA抽出&qPCR
クロロホルム(ACSグレード)シグマ・オルドリッチC2432Purpose_Application: RNA抽出における相分離
Specifications_Comments:ACS試薬グレードおよび循環;‰¥純度99%です
エタノール(75%、分子グレード)シグマ・オルドリッチE7023Purpose_Application: RNAペレット洗浄
Specifications_Comments:分子生物学グレード、新鮮に準備します
イソプロパノール(分子グレード)シグマ・オルドリッチI9516Purpose_Application: RNA沈殿
Specifications_Comments:分子生物学グレードおよび循環;‰¥純度99.5%
ヌクレアーゼフリー水サーモフィッシャー・サイエンティフィックAM9930Purpose_Application: PCR反応製剤
Specifications_Comments:DNase/RNaseフリー、PCR応用用に試験されています
光学接着フィルムサーモフィッシャー・サイエンティフィック4311971Purpose_Application: qPCRプレート
Specifications_Commentsの光学シール:qPCR用途の光学品質
PCRプレート(96井戸)サーモフィッシャー・サイエンティフィックN8010560Purpose_Application: 96ウェルフォーマット(高スループットqPCR
Specifications_Comments:白い透明底面で光学検出用
PCRチューブストリップサーモフィッシャー・サイエンティフィックAB0451Purpose_Application: 小容量PCR反応
Specifications_Comments:個別キャップ付きの8管ストリップ
PrimeScript RT Reagent KitタカラバイオRR037APurpose_Application: RNAからcDNAへの逆転写
Specifications_Comments:ゲノムDNA除去のためのgDNA消しゴム
SYBRグリーンマスターミックス応用バイオシステム4309155Purpose_Application: リアルタイムPCR増幅および検出
Specifications_Comments:正規化のためのROX参照染料を用いた
トリゾル試薬(RNA溶解)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15596026Purpose_Application: 細胞溶解およびRNA抽出
Specifications_Comments:4Âに保存;°C、6ヶ月以内に使用してください
<ストロング>タンパク質分析 - ウェスタンブロット
アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)バイオ・ラッド1610146Purpose_Application: SDS-PAGEゲル重合
Specifications_Comments:30%アクリルアミドストック溶液
BCAタンパク質アッセイキットサーモフィッシャー・サイエンティフィック23225Purpose_Application: タンパク質濃度定量
Specifications_Comments:正確な定量のための還元互換
増強化学発光(ECL)基質サーモフィッシャー・サイエンティフィック32106Purpose_Application: 化学発光タンパク質検出
Specifications_Comments:フェムトグラム感度検出
無脂肪ドライミルクラボ・サイエンティフィック170-6404Purpose_Application: ウェスタンブロッカーブロッカー剤
Specifications_Comments:ブロッキンググレード、低バックグラウンド
ホスファターゼ阻害カクテルロッシュ応用科学4906845001Purpose_Application: タンパク質脱リン酸化を防ぐ
Specifications_Comments:岡田酸とカリキュリンAを含む
プレステンドタンパク質ラダーバイオ・ラッド1610394Purpose_Application: 分子量基準
Specifications_Comments:10-250 kDaの範囲、11バンド
プロテアーゼ阻害カクテルロッシュ応用科学11697498001Purpose_Application: 溶解中のタンパク質分解防止
Specifications_Comments:金属依存性ホスファターゼに対してEDTAフリー
PVDF膜(0.45 μm)ミリポール・シグマIPVH00010Purpose_Application: タンパク質移動膜(0.45 μm pore)
Specifications_Comments:低蛍光背景
RIPA溶解バッファー細胞シグナル伝達技術9806SPurpose_Application: 全細胞タンパク質抽出
Specifications_Comments:洗剤を使った即使用溶解緩衝液
サンプルローディングバッファ(4倍)バイオ・ラッド1610747Purpose_Application: SDS-PAGE
Specifications_Commentsのタンパク質サンプル調製:Îで染料をロード;²-メルカプトエタノール
SDS-PAGEランニングバッファバイオ・ラッド1610732Purpose_Application: タンパク質電気泳動
Specifications_Comments:トリスグリシンSDSバッファ系
フッ化ナトリウムシグマ・オルドリッチ201154Purpose_Application: 追加のホスファターゼ阻害
Specifications_Comments:50 mMの作動濃度
オルトバナデートナトリウムシグマ・オルドリッチS6508Purpose_Application: JAK2/STATリン酸化保存
Specifications_Comments:1 mMの作業濃度、新鮮に準備
トランスファーバッファー濃縮液バイオ・ラッド1704156Purpose_Application: 半乾燥タンパク質トランスファー
Specifications_Comments:10倍濃縮し、使用前に希釈します
トリスバッファード生理食塩水とTween-20(TBST)細胞シグナル伝達技術9997SPurpose_Application: 膜洗浄および抗体希釈
Specifications_Comments:0.1% Tween-20、pH 7.6
CRISPR/Gene Editing
リン酸カルシウムトランスフェクションキットプロメガE1200Purpose_Application: 包装細胞へのDNAトランスフェクション
Specifications_Comments:レンチウイルス産生における高いトランスフェクション効率
DNAゲル抽出キットキアゲン28706Purpose_Application: シーケンス
Specifications_CommentsのためのPCR産物精製:カラムベース精製システム
GV371レンチウイルスベクタージーンケム株式会社GV371Purpose_Application: 遺伝子ノックアウト
Specifications_Commentsに対するCRISPR/Cas9発現:すぐに使えるCRISPR/Cas9レンチウイルス系
HEK293T細胞株ATCCCRL-3216Purpose_Application: レンチバイラル包装セルライン
Specifications_Comments:高度に形移しやすい包装セルライン
サンガーシーケンシングサービスマクロジェン社習慣Purpose_Application: ノックアウト検証およびオフターゲット解析
Specifications_Comments:カスタムプライマーを用いた標準シーケンス
T7 エンドヌクレアーゼIニューイングランド・バイオラボM0302SPurpose_Application: CRISPR切断効率の検証
Specifications_Comments:CRISPR検証のためのミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ
<ストロング>エリサ&免疫測定法<強力>
ELISAプレート(96井戸、平底)コーニング3590Purpose_Application: ELISA基質反応
Specifications_Comments:ELISAにおける高結合・平底
ヒトCLCF1デュオセットELISAR&DシステムズDY1234Purpose_Application: CLCF1タンパク質定量(31.2-2000 pg/mL)
Specifications_Comments:検出範囲:31.2-2000 pg/mL、CVおよび10%
p24 ELISAキット(レンチウイルス抗体価)ゼプトメトリックス・コーポレーション801111Purpose_Application: レンチウイルス滴価測定
Specifications_Comments:レンチウイルス抗体価測定(>10â¸TU/mL)
<強力>機能性アッセイ
アリザリン レッド S 染色キットシグマ・オルドリッチA5533Purpose_Application: カルシウム沈着の可視化
Specifications_Comments:蒸留水中の2%溶液、pH 4.1-4.3
アルカリホスファターゼ活性キットアブカムAB83369Purpose_Application: ALP酵素活性測定
Specifications_Comments:比色アッセイで405nmで測定
アスコルビン酸(L-アスコルビン酸)シグマ・オルドリッチA4544Purpose_Application: 骨生成培地成分
Specifications_Comments:50 μg/mL 最終濃度
セチルピリジニウム塩化物シグマ・オルドリッチC9002Purpose_Application: 定量のためのアリザリンレッドS抽出
Specifications_Comments:染料抽出のための10%溶液
デキサメタゾンシグマ・オルドリッチD4902Purpose_Application: 骨生成培地成分
Specifications_Comments:最終濃度10 nM
β-グリセロリン酸シグマ・オルドリッチG9422Purpose_Application: 骨生成培地成分
Specifications_Comments:最終濃度10 mM
骨生成分化培地プロモセルC-28010Purpose_Application: 骨芽細胞分化誘導
Specifications_Comments:即使用可能な完全骨生成培地
トランスウェル細胞培養挿入(0.4 μm)コーニング3470Purpose_Application: 0.4 Îとの共培養システム;¼m分離
Specifications_Comments:ポリエチレンテレフタレート膜、無菌
<ストロング>装備 - 主要楽器
遠心分離機(高速冷蔵)エッペンドルフ5430RPurpose_Application: サンプル処理およびセル分離
Specifications_Comments:冷蔵、最大30,000 x g
化学発光イメージングシステムバイオ・ラッド研究所12003154Purpose_Application: ウェスタンブロットイメージングおよび定量化
Specifications_Comments:ゲル記録およびウェスタンブロットイメージング
CO2インキュベーター(加湿)サーモフィッシャー・サイエンティフィック51030287Purpose_Application: 細胞培養維持(37°C、5% CO2
Specifications_Comments:トリプルガス(CO2/O2/N2)、湿度管理
心拍数モニター(胸ストラップ)ポーラー・エレクトロH10Purpose_Application: 連続心拍モニタリング
Specifications_Comments:Bluetooth接続性および循環;±1 bpmの精度
ホロジックディスカバリー A DXAスキャナーホロジック社発見APurpose_Application: 骨密度測定
Specifications_Comments:APEXソフトウェアv4.5では、毎日のQCが必要
マイクロプレートリーダー(マルチモード)バイオテック・インスツルメンツシナジーH1Purpose_Application: ELISAプレート読み取りおよび吸収測定
Specifications_Comments:UV-Vis、蛍光、発光検出
モーター付きトレッドミルライフフィットネス95TiPurpose_Application: 標準化運動介入
Specifications_Comments:可変速度0-16 km/h、0-15%勾配
リアルタイムPCRシステム(CFX96または同等)バイオ・ラッド研究所1855195Purpose_Application: リアルタイムPCR増幅および検出
Specifications_Comments:96ウェルブロック、勾配対応
ソフトウェア&分析ツール
APEXソフトウェアv4.5(DXA解析)ホロジック社v4.5Purpose_Application: DXAスキャン解析および骨密度計算
Specifications_Comments:参照データベースを用いた骨密度分析
バイオラッドCFXマエストロバイオ・ラッド研究所CFXマエストロPurpose_Application: qPCRデータ解析およびCT決定
Specifications_Comments:リアルタイムPCR解析およびデータエクスポート
GraphPad プリズム v9.0GraphPadソフトウェアv9.0Purpose_Application: 統計解析とグラフ生成
Specifications_Comments:グラフ生成を備えた統計ソフトウェア
ImageJ/フィジー v1.53国立衛生研究所v1.53Purpose_Application: ウェスタンブロット密度測定と画像解析
Specifications_Comments:測定ツールを用いた画像解析
Microsoft Excel 365マイクロソフト・コーポレーション365Purpose_Application: データ整理と基本計算
Specifications_Comments:データ整理と基本統計関数
<ストロング>消耗品&プラスチック製品<強力>
1.5 mL マイクロ遠心分離機チューブエッペンドルフ22363204Purpose_Application: 小容量サンプルの保存と処理
Specifications_Comments:DNase/RNaseフリー、低結合
15 mL円錐形チューブコーニング430766Purpose_Application: 中容量試料処理
Specifications_Comments:ポリプロピレン、目盛り、キャップ付き
24ウェル細胞培養プレートコーニング3524Purpose_Application: 共培養および機能的アッセイセットアップ
Specifications_Comments:組織培養処理、フラットボトム
50 mL円錐形管コーニング430829Purpose_Application: 大量サンプル採取および処理
Specifications_Comments:ポリプロピレン、重度、キャップ付き
クライオバイアル(1 mL)サーモフィッシャー・サイエンティフィック375418Purpose_Application: -80Acircでの長期細胞およびサンプル貯蔵;°C
Specifications_Comments:外ねじ、Oリングシール、-196°C指定
パスツール・ピペット(無菌)フィッシャー・サイエンティフィック13-678-20APurpose_Application: 無菌サンプル採取および移送
Specifications_Comments:個別に包装され、無菌です

参考文献

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