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方法論記事

溶骨性疾患モデルにおけるノッチシグナル伝達調節によるLY90009による破骨細胞形成の阻害

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DOI:

10.3791/69178

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2025年10月7日

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

この記事について

サマリー

ここでは、骨髄由来マクロファージにおけるRANKL誘発性破骨細胞形成に対するγ-セクレターゼ阻害剤LY900009の阻害効果を評価するためのプロトコルを提示します。このプロトコルには、細胞毒性評価、機能アッセイ、分子分析、およびマウス溶骨モデルでの in vivo 検証が含まれており、溶骨性疾患の治療開発に応用されています。

要約

破骨細胞の活性の調節不全は溶骨性疾患の進行に大きく寄与しますが、治療介入法の範囲は副作用によって制限されています。この研究では、γ-セクレターゼ阻害剤であるLY900009と、Notchシグナル伝達の調節を通じてRANKL誘発性破骨細胞形成を抑制する能力を調査しました。骨髄由来マクロファージを用いて、細胞毒性、分化、機能アッセイの包括的な in vitro 評価を実施しました。qPCRとウェスタンブロッティングを用いた遺伝子およびタンパク質発現解析により、根底にある分子メカニズムを解明しました。 in vivo の有効性は、マウスリポ多糖類誘発骨吸収モデルを使用して裏付けられました。LY900009、治療濃度で細胞毒性を起こさずに、RANKL誘発性破骨細胞の形成と吸収機能を用量依存的に阻害しました。この治療により、TRAP 陽性破骨細胞の数が大幅に減少し、アクチン ベルト形成が損なわれ、骨基質の劣化が抑制されました。NFATc1、c-Fos、カテプシンK、TRAPなどの破骨細胞マーカーの発現は著しくダウンレギュレートされました。メカニズム的には、LY900009 Notch シグナル伝達と下流の MAPK/Akt 経路を破壊しました。 in vivo 投与により、LPS 誘発性骨破壊が大幅に減少し、骨パラメータが改善され、破骨細胞の存在が減少しました。これらの発見は、LY900009 が Notch/MAPK/Akt シグナル伝達軸を調節することにより破骨細胞形成と骨吸収を効果的に阻害し、溶骨性疾患の有望な治療候補となっていることを示しています。

概要

骨恒常性は、脊椎動物において絶妙に調整された生理学的パラダイムを構成し、骨芽細胞を介した骨形成と破骨細胞による骨吸収の間の微妙な平衡によって調和しています1。この複雑なバランスにより、生涯を通じて骨格の完全性、生体力学的回復力、代謝の忠実度が維持され、機械的要求、内分泌の摂動、病理学的課題に動的に反応します2。骨リモデリングサイクルには、活性化、吸収、移行、形成、終了の連続した段階が含まれ、それぞれが細胞活動の時空間同期を確実にする複雑な分子カスケードによって支配されます3。

特に過剰な破骨細胞活性または不十分な骨芽細胞機能によるこの恒常性メカニズムの破壊は、多くの溶骨性障害に特徴的な病理学的骨量減少を引き起こします 4,5。これらの症状には、閉経後および老化性骨粗鬆症、関節リウマチ、炎症性関節炎、腫瘍性骨病変、パジェット病、歯周病など、幅広い疾患が含まれます6。過度の骨吸収の臨床症状には、骨折リスクの増加、骨格変形、慢性疼痛、機能障害、およびかなりの医療負担が含まれます 6,7。現代の疫学的指標によると、骨粗鬆症だけでも世界中で 2 億人以上が罹患しており、関連する骨折により、重大な罹患率、死亡率、および年間数十億ドルを超える経済的コストが発生しています 7,8。

破骨細胞は、単核食細胞系統の造血前駆体、特に骨髄由来マクロファージに由来する高度に特殊化された多核巨細胞として現れます9。それらの形成は、細胞外シグナル、細胞内シグナル伝達カスケード、および転写プログラム10の正確な調整を必要とする複雑な多段階プロセスを表しています。破骨細胞形成を支配する必須サイトカインには、核因子κBリガンドの受容体活性化因子(RANKL)およびマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)が含まれ、これらはそれぞれの受容体RANKおよびc-Fmsに結合して分化プログラムを開始します11。RANKL-RANK相互作用は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、核因子κB(NF-κB)、ホスホイノシチド3-キナーゼ/プロテインキナーゼB(PI3K/Akt)、カルシウム/カルシニューリン経路など、複数の下流シグナル伝達経路の活性化を引き起こし、破骨細胞形成のマスター転写調節因子である活性化T細胞の核因子細胞質1(NFATc1)に収束します10,11,12。

破骨細胞生物学を制御するさまざまな調節メカニズムの中で、ノッチシグナル伝達は、複雑で状況依存的な機能を持つ重要なモジュレーターとして浮上しています13。ノッチ経路は、進化的に保存された細胞間コミュニケーションシステムであり、多様な組織と発生段階にわたる細胞の運命の決定、分化、増殖、およびアポトーシスを支配します14。哺乳類では、4つのノッチ受容体(ノッチ1-4)が5つの標準リガンド(デルタ様1、3、4、およびギザギザ1および2)と相互作用して、細胞間シグナル伝達を媒介します。経路の活性化には、ADAMメタロプロテアーゼとγセクレターゼ複合体によるリガンド結合、コンフォメーション変化、および連続的なタンパク質分解切断が含まれ、最終的には、HesおよびHeyファミリーを含む標的遺伝子の核転座および転写調節のためのノッチ細胞内ドメイン(NICD)を放出します14,15.破骨細胞形成におけるノッチシグナル伝達の役割は依然として議論の余地があり、文脈に大きく依存しているようで、特定の受容体サブタイプ、リガンドの利用可能性、細胞微小環境、および実験条件に応じて刺激効果と抑制効果の両方が報告されている研究があります16,17,18。

溶骨性疾患に対する一般的な治療アプローチは、主にビスホスホネート、デノスマブ (RANKL 阻害剤)、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニンなどの抗吸収戦略に焦点を当てています 7,8,19。これらの治療法は骨吸収と骨折のリスクを効果的に軽減しますが、胃腸毒性、顎の骨壊死、非定型骨折、感染リスクの増加、長期的な安全性への懸念など、重大な制限が伴います。さらに、これらの薬剤は骨代謝回転を過度に抑制し、骨の質と修復メカニズムを損なう可能性があります。その結果、副作用を最小限に抑え、生理学的骨リモデリング能力を維持しながら、病理学的破骨細胞活性を選択的に阻害できる新しい治療薬が緊急に臨床的に必要とされています8,14。

γ-セクレターゼ阻害剤は、ノッチシグナル伝達の調節を通じて溶骨性疾患に応用できる可能性のある有望な化合物クラスです14,20。これらの薬剤は腫瘍学および神経変性疾患の研究で広く研究されており、いくつかの化合物はアルツハイマー病やさまざまな癌の臨床試験に進んでいます。強力で選択的なγセクレターゼ阻害剤であるLY900009は、予備研究で高い特異性、バイオアベイラビリティ、および管理可能な安全性プロファイルを含む好ましい薬理学的特性を実証しています21,22。しかし、RANKL 誘発性破骨細胞形成に対するその特定の効果と溶骨性疾患における潜在的な治療的有用性は、依然として不完全に特徴付けられています。この研究は、LY900009 が Notch シグナル伝達の破壊を通じて破骨細胞形成を阻害できるかどうかを評価するために設計され、溶骨性疾患に対する新しい治療アプローチを提供する可能性があります。私たちは、炎症性骨量減少モデルにおける破骨細胞形成、骨吸収活性、シグナル伝達経路、および in vivo 有効性に対するそれらの効果を評価するための包括的なプロトコルを開発しました。

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プロトコル

すべての動物処置は施設のガイドラインに従って実施され、山東第一医科大学付属中央病院の動物管理および使用委員会によって承認されました (承認番号 IACUC-2024-015)。この研究は、標準的なケージ(5匹のマウス/ケージ、12時間の明暗サイクル、 自由な 餌/水)での動物飼育とグループへの無作為化を含む、動物研究の確立された倫理原則とARRIVEガイドラインを遵守しました

1. 骨髄由来マクロファージの単離と培養

  1. 5週齢の雄C57BL / 6マウス(分離あたりn = 5)を、毎分30%チャンバー容積の流量でCO2 チャンバーに5分間置くことにより、安楽死させます。頸部脱臼による死亡を確認します。
  2. マウスに70%エタノールをスプレーします。滅菌ハサミを使用して、恥骨から胸骨までの正中線切開を行います。大腿骨と脛骨を無菌で除去します。骨を氷上の滅菌PBSに入れます。
  3. 滅菌ガーゼを使用して軟部組織の骨をきれいにします。滅菌ハサミで骨の両端を切ります。マウスあたり10 mLのコールドα-MEMを含む25G針を使用して骨髄を洗い流します。細胞懸濁液を70μmの細胞ストレーナーに通します。
  4. 300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 10% FBS および 33.3 ng/mL M-CSF を含む α-MEM にペレットを再懸濁します。トリパンブルーを除外した血球計算盤を使用して細胞をカウントします。T75フラスコに2 x 106 細胞/ mLでプレートします。
  5. 培養物を5%CO2 雰囲気中で37°Cに維持し、培地を48時間ごとに交換します。
  6. 1x 106 細胞を採取します。FBSを2%含むPBSで洗浄します。抗CD11b-FITC(1:100)および抗F4/80-PE(1:100)と暗闇で4°Cで30分間インキュベートします。次のゲーティング戦略を使用してフローサイトメトリーで分析します。まず、前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)に基づいて細胞をゲートし、破片を排除し、生細胞を選択します。第二に、生細胞集団からCD11b陽性細胞をゲートします。第三に、CD11b陽性細胞から、F4 / 80陽性細胞をゲートして、CD11b + / F4 / 80 + 二重陽性マクロファージを同定します。ステンドされていないコントロールと単色コントロールに基づいてゲートを設定します。>95%の細胞がCD11b + / F4 / 80+の場合にのみ続行します。

2. 細胞毒性評価

  1. 1ウェルあたり100 μLの培地を使用して、96ウェルプレートで1 x 104 細胞/ウェルで骨髄由来マクロファージ(BMM)を播種します。細胞を37°Cで4時間接着させます。
  2. 完全培地でLY900009希釈液を調製します:0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μM。古い培地を取り除きます。ウェルあたり100 μLの処理培地を追加します。濃度ごとに3回作成します。
  3. 24時間、48時間、または96時間インキュベートします。培地を完全に取り除きます。10% CCK-8試薬を含む100 μLの新鮮な培地(90 μLの培地に10 μLのCCK-8)を加えます。37°Cで正確に2時間インキュベートします。 マイクロプレートリーダーを使用して、650 nmの基準で450 nmの吸光度を測定します。
  4. GraphPad Prismを使用してIC50を計算します。オープンソフトウェア、入力濃度(X軸)と生存率(Y軸)。[非 線形回帰>分析 > 対数(阻害剤)>阻害>可変傾きの応答 を選択します。制約を設定します: Bottom=0、Top=100。IC50を95%信頼区間で記録します。

3. 破骨細胞の分化とTRAP染色

  1. 骨髄由来マクロファージ(BMM)を1 x 104細胞/ ウェルで96ウェルプレートに播種します。10%FBSおよび33.3 ng / mL M-CSFを含むα-MEMで一晩培養します。
  2. 培地を100 μLの分化培地(10%FBS、33.3 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL、およびLY900009(0、100、200、400 nM)を含むα-MEMに置き換えます。条件ごとに四重を用意します。
  3. 培地を48時間ごとに新鮮な分化培地と交換します。6日間続けます。破骨細胞の形成については、倒立顕微鏡を使用して 100 倍で毎日監視します。
  4. 吸引によってすべての培地を取り除きます。200 μLのPBSで1回洗浄します。PBSに100 μLの4%パラホルムアルデヒドを加えます。室温で正確に15分間インキュベートします。固定剤を取り除きます。200 μLのPBSで3回洗浄します。
  5. TRAP染色液の調製:50 mLの0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)、10 mLの50 mM酒石酸ナトリウム、1 mLの5 mg / mLナフトールAS-MXリン酸ナフトールをジメチルホルムアミドに混合し、0.5 mLの11 mg / mL高速赤紫LB塩を混合します。0.22 μmフィルターでろ過します。ウェルあたり200 μLを塗布します。暗闇の中で37°Cで30分間インキュベートします。蒸留水で3回洗浄して反応を止めます。
  6. 破骨細胞を、3つ以上の核を含むTRAP陽性細胞(紫/赤)として識別します。倒立顕微鏡を100倍倍にしてカウントします。ウェルごとに5つのランダムなフィールドを撮影します。
  7. ImageJを使用して定量化します。 画像をクリックして> 8ビットに変換(画像>タイプ>8ビット)>しきい値を設定します(画像>>しきい値の調整)>TRAPポジティブ領域の選択>粒子の分析(粒子の分析>分析:サイズ100-無限大μm2、円度0-1.0)>結果をExcel 23にエクスポートします。

4. 機能的骨吸収アッセイ

  1. 6ウェルプレート(2 x 105細胞/ウェル)でBMMをM-CSFで24時間培養します。RANKL(100 ng / mL)を加えて、破骨細胞前形成を3日間誘導します。
  2. 0.25%トリプシン-EDTAを使用して細胞を37°Cで5分間回収します。 完全な培地で中和します。トリパンブルーを使用して生細胞をカウントします。
  3. ヒドロキシアパタイトでコーティングされた96ウェルプレートにウェルあたり1 x 104個の前破骨細胞を播種します。4時間取り付けます。
  4. M-CSF(33.3 ng/mL)、RANKL(100 ng/mL)、およびLY900009(0、100、200、400 nM)で4日間治療します。2日ごとに培地を交換してください。
  5. 10%漂白剤を使用して細胞を10分間除去します。蒸留水で5回洗います。完全に自然乾燥させます。
  6. 自動イメージングリーダーを使用して、4倍の倍率で吸収ピットを視覚化します。井戸エリア全体をキャプチャします。ImageJを使用して、総面積に対する割合として吸収面積を定量化します。

5. 免疫蛍光顕微鏡

  1. ステップ3で説明するように、24ウェルプレートのガラスカバーガラス上で破骨細胞を5〜7日間培養します。
  2. 4%パラホルムアルデヒドで15分間固定します。PBS中の0.1%Triton X-100で10分間透過処理します。室温で1時間PBS中の1%BSAでブロックします。
  3. ローダミン-ファロイジン(1:200)とブロッキングバッファー中で室温で暗所で45分間インキュベートします。DAPI(1 μg/mL)で核を10分間対比染色します。
  4. 色あせ防止粘付媒体を使用してスライドにカバーガラスを取り付けます。蛍光顕微鏡を200倍倍にして調べます。ImageJを使用してアクチン環面積を測定します。

6. 定量的リアルタイムPCR分析

  1. RNA抽出試薬を使用して、2 x 106 細胞からトータルRNAを抽出します。ピペッティングによる均質化。室温で5分間インキュベートします。
  2. 200 μLのクロロホルムを加えます。15秒間激しく振ってください。3分間インキュベートします。12,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。
  3. 水相を新しいチューブに移します。500 μLのイソプロパノールを加えます。やさしく混ぜます。室温で10分間インキュベートします。12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  4. ペレットを1mLの75%エタノールで洗浄します。10分間自然乾燥させます。30 μLのRNaseフリー水に溶解します。分光光度計を使用して濃度を測定します(A260/A280比>1.8)が必要です)。
  5. メーカーのプロトコルに従って、逆転写キットを使用して1 μgのRNAを使用してcDNAを合成します。
  6. qPCR反応を調製します:マスターミックス10 μL、cDNA 1 μL、各プライマー(10 μM)0.5 μL、水8 μL。リアルタイムPCRシステムで実行:95°Cで10分間、その後95°Cで15秒間、60°Cで60秒間40サイクル実行します。GAPDHを参照遺伝子とする2-ΔΔCt法を用いて相対発現を算出します。

7. ウェスタンブロット分析

  1. プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を含むRIPAバッファーで細胞を氷上で30分間溶解します。14,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  2. 製造元の指示に従って、BCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。ローディングバッファーで30 μgのタンパク質サンプルを調製します。5分間沸騰させます。
  3. サンプルを10%SDS-PAGEゲルにロードします。80 Vで30分間運転し、次に120 Vで90分間運転します。コールドトランスファーバッファー中で100 Vで90分間PVDFメンブレンに転写します。
  4. 0.1%トゥイーン-20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水中の5%スキムミルクで、室温で1時間穏やかに揺らしながらブロックメンブレン。
  5. 材料表(1:1000)に詳述されている一次抗体と、4°Cで穏やかに揺らしながら一晩インキュベートします。TBSTで3回、それぞれ10分間洗浄します。
  6. HRP結合二次抗体(1:5000)と室温で1時間インキュベートします。TBSTで3回洗います。
  7. 製造元の指示に従ってECL試薬を使用して検出します。赤外線イメージングシステムを使用して画像をキャプチャします。ImageJを使用してバンド強度を定量化します。

8. In Vivo LPS誘発骨吸収モデル

  1. G*検出力 3.1 を使用してサンプル サイズを計算します (効果サイズ = 0.8、α=0.05、検出力 = 0.80、n=5/グループ)。乱数発生器を使用して、7〜8週間齢の雄のC57BL / 6マウスをグループにランダムに割り当てます。ケージごとに5匹のマウスを12時間の明暗サイクル、温度22±2°C、湿度55%±10%、標準的な食べ物と水への 自由 なアクセスで飼育します。
  2. ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)の腹腔内注射を使用してマウスを麻酔します。つま先つまみ反射で麻酔を確認します。
  3. ビヒクルコントロールを調製する:1%DMSOを含むPBS。準備LY900009:ビヒクル中の低用量(2.5 mg / kg)および高用量(5 mg / kg)。100 μLを毎日27Gの針を使用して頭蓋骨に皮下注射し、14日間注入します。1日目と8日目にLPS(10 mg / kg)を注射します。
  4. マウスを毎日2回監視して、苦痛の兆候がないか確認します。人道的なエンドポイントを定義します: 体重減少 >20%、歩行不能、猫背姿勢、身だしなみの減少。エンドポイントに達した場合は、直ちに安楽死させてください。
  5. ペントバルビタールの過剰摂取(腹腔内100 mg / kg)を使用して15日目に安楽死させます。カルバリアを収穫します。4%パラホルムアルデヒドで4°Cで48時間固定します。

9. マイクロCTおよび組織学的分析

  1. マイクロCTスキャナーを使用して、次のパラメータで固定頭蓋骨をスキャンします:70 kV、114 μA、0.5 mmアルミニウムフィルター、9 μmの分解能、0.4°ステップで180°回転。
  2. NReconソフトウェアを使用して画像を再構築します。CTAnソフトウェアを使用して分析します。関心領域を矢状縫合糸を中心とする3 x 3 mmの領域として定義します。BMD、BV / TV、Tb.N、Tb.Th を計算します。
  3. サンプルを10%EDTA(pH 7.4)で14日間脱灰し、毎日変化させます。シュウ酸カルシウム試験を使用した脱灰完了試験24.
  4. パラフィン包埋のプロセス:段階的なアルコールで脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンを浸透させます。ミクロトームを用いた厚さ4μmの切片
  5. 盲検化の確保: ランダムな 3 桁の数字を使用してすべてのサンプルをコーディングします。同僚にコードキーを管理してもらいます。治療グループの知識なしにすべての分析を実行します。データ収集が完了した後にのみデコードします。
  6. H&E染色の実行:脱パラフィン、再水和、ヘマトキシリンで5分間染色、酸性アルコールで分化、エオシンで2分間染色、脱水、およびマウント。
  7. 手順3.5のようにTRAP染色を実行します。骨表面に沿ってTRAP陽性の多核細胞をカウントします。骨の周囲 mm あたりの数で表します。

10. 統計分析

  1. G*Power 3.1 を使用して必要なサンプル サイズを計算します: 入力効果サイズ f=0.8、α=0.05、検出力=0.80、グループ数。グループごとの最小nを記録します。
  2. SPSS 28.0 の Shapiro-Wilk 検定を使用した正規性の検定。p > 0.05 を正規分布と見なします。Levene検定を用いた分散の均一性検定p > 0.05 を等分散と見なします。
  3. 分布に基づいて適切な検定を適用する: 分散が等しい正規データの場合は、パラメトリック検定を使用します。2つのグループには、対応のないスチューデントのt検定を適用します。複数のグループの場合は、一元配置分散分析を使用します。
  4. 事後分析を実行する:有意なANOVA(p<0.05)の場合、すべてのペアワイズ比較にTukeyの正直有意差検定を適用します。
  5. 非正規データにノンパラメトリック代替を使用: 2 つのグループには Mann-Whitney U 検定を適用し、複数のグループには Dunn の事後検定を使用した Kruskal-Wallis を適用します。
  6. 効果サイズの計算:t検定の場合はCohenのd、ANOVAの場合は部分etaの2乗。
  7. 小数点以下 3 桁までの正確な p 値を報告し、信頼区間を 95% で報告します。正規データを平均値±標準偏差として表示し、非正規データを中央値(四分位範囲)として表示します。
  8. p < 0.05 を統計的に有意と見なします。多重比較を実行するときにボンフェローニ補正を適用します。

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結果

このプロトコルの実装が成功したことで、LY900009 が複数の相互接続されたメカニズムを通じて破骨細胞の形成と機能に対して強力な抑制効果を発揮することが明らかになりました。骨髄由来マクロファージにおける最初の細胞毒性評価では、24時間、48時間、96時間でそれぞれ4.44 μM、3.66 μM、および2.93 μMの計算されたIC50値で、毒性の時間依存的な増加が実証されました(図1A、B)。重要なことに、これらの細胞毒性濃度は治療的に有効な用量よりも大幅に高く、好ましい治療期間が確立されました。LY900009の分子構造を図1Cに示します。TRAP染色分析により、RANKL誘発性破骨細胞形成の用量依存的抑制が明らかになり、100〜400 nMの範囲の濃度で破骨細胞の数とサイズの両方が大幅に減少しました(図1D-F)。ヒドロキシアパタイトでコーティングされた表面を使用し...

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ディスカッション

現在の調査は、骨関連疾患に対するγセクレターゼ阻害剤への関心の高まりと一致して、破骨細胞形成の強力かつ選択的な阻害を通じて、LY900009溶骨性疾患の有望な治療薬であるという説得力のある証拠を提供します 14,20,21。この知見は、このγセクレターゼ阻害剤が、Notch、MAPK、PI3K/Akt、NF-κBカスケードなどの複数の重要なシグナル伝達経路の協調的な破壊を通じて、RANKL誘発性破骨細胞形成と骨吸収機能を効果的に抑制することを示しています。これらの結果の治療的意義は、生体内でのLPS誘発性骨量減少の予防における化合物の有効性によって証明されているように、メカニズムの洞察を超えて広がり、炎症性および代謝性骨障害を管理するための実質的な臨床的可能性を示唆しています7,8,19,25

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益や利益相反がないことを宣言しています。著者は、この作品で言及されている営利団体と金銭的な関係を持っていません。すべての著者は、ICMJE開示フォームに記入しています。

謝辞

著者らは、この研究の過程で技術的サポートと支援を提供してくれた山東第一医科大学付属中央病院と肥城人民病院のスタッフに感謝したいと思います。また、動物実験における貴重な議論と支援に対する研究室の同僚の貢献にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル細胞培養プレートコーニング3524免疫蛍光顕微鏡
6ウェル細胞培養プレートコーニング3516細胞培養とウェスタンブロット
70%エタノールシグマ・アルドリッチE7023滅菌・消毒
75%エタノールシグマ・アルドリッチE7148RNA洗浄バッファー
96ウェル細胞培養プレートコーニング3596細胞培養とアッセイ
アルミフィルター(0.5mm)ブルカー該当なしマイクロCT走査フィルター
抗CD11b-FITC抗体バイオレジェンド101206フローサイトメトリー - マクロファージマーカー
抗切断Notch1抗体(ウサギモノクローナル)細胞シグナル伝達技術4147秒ウェスタンブロット - ノッチシグナル伝達
抗F4/80-PE抗体バイオレジェンド123108フローサイトメトリー - マクロファージマーカー
退色防止封入材ベクター研究所H-1000型蛍光顕微鏡取付
抗Hes1抗体(ウサギモノクローナル)細胞シグナル伝達技術11988年代ウェスタンブロット - ノッチ下流ターゲット
抗NFATc1抗体(マウスモノクローナル)サンタクルーズバイオテクノロジーSC-7294ウェスタンブロット - 破骨細胞マスターレギュレーター
抗リン酸化Akt(Ser473)抗体細胞シグナル伝達技術4060秒ウェスタンブロット - PI3K/Aktシグナリング
抗リン酸化ERK1/2(Thr202/Tyr204)抗体細胞シグナル伝達技術4370秒ウェスタンブロット - MAPKシグナリング
抗リン-NF-&κ;B p65 (Ser536) 抗体細胞シグナル伝達技術3033秒ウェスタンブロット - NF-&カッパ;B シグナリング
抗リン酸化p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗体細胞シグナル伝達技術4511S型ウェスタンブロット - p38 MAPKシグナリング
抗&β;-アクチン抗体(マウスモノクローナル)細胞シグナル伝達技術4970年代ウェスタンブロットローディング制御
自動イメージングリーダー分子デバイスImageXpressマイクロ吸収ピットの定量化
BCAプロテインアッセイキットピアース/サーモフィッシャー23225タンパク質濃度測定
漂白剤(10%次亜塩素酸ナトリウム)シグマ・アルドリッチ425044吸収プレートからの細胞除去
BSA(ウシ血清アルブミン)シグマ・アルドリッチA7906免疫蛍光用ブロッキングバッファー
C57BL/6マウス(雄、5-8週齢)チャールズ・リバー研究所27in vitro BMM単離およびin vivo研究
シュウ酸カルシウム試験試薬シグマ・アルドリッチC0350型脱灰完了試験
CCK-8試薬(Cell Counting Kit-8)同陣島分子技術CK04細胞生存率評価
セルストレーナー(70&μ;m)BDファルコン352350骨髄細胞濾過
遠心分離機(冷蔵)エッペンドルフ5424R型細胞およびサンプルの前処理
クロロホルムシグマ・アルドリッチC2432RNA抽出相分離
CO2チャンバーユーサネックス株式会社EX-075動物の安楽死
CTAnソフトウェアブルカーバージョン1.20マイクロCT画像解析
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)シグマ・アルドリッチD9542核対比染色
ジメチルホルムアミド(DMF)シグマ・アルドリッチD4551TRAP染色溶媒
DMSO(ジメチルスルホキシド)シグマ・アルドリッチD2650型車両制御の準備
ECLウェスタンブロッティング基質ピアース/サーモフィッシャー32106ウェスタンブロットでのタンパク質検出
EDTA(10%、pH 7.4)シグマ・アルドリッチE6758脱灰液
エオシンYシグマ・アルドリッチE4009H&E組織学的染色
ファストレッドバイオレットLBソルトシグマ・アルドリッチF3381TRAP染色クロモゲン
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco/サーモフィッシャー16140-071細胞培養サプリメント
フローサイトメーターBDバイオサイエンスFACSカリバーBMMの特性評価
蛍光顕微鏡オリンポスIX73免疫蛍光イメージング
G*Powerソフトウェアハインリッヒ・ハイネ大学バージョン3.1統計的検出力分析
ガラスカバーガラス(22 &22 mm)フィッシャーサイエンティフィック12-541-B免疫蛍光顕微鏡
GraphPadプリズムGraphPadソフトウェアバージョン 9.0IC50の計算とグラフ作成
ヘマトキシリンシグマ・アルドリッチH3136H&E組織学的染色
血球計算器ハウスサイエンティフィック3200細胞計数
大容量cDNA逆転写キットアプライドバイオシステムズ4368814RNAからのcDNA合成
HRP結合抗マウスIgG細胞シグナル伝達技術7076S型ウェスタンブロット二次抗体
HRP結合抗ウサギIgG細胞シグナル伝達技術7074S型ウェスタンブロット二次抗体
ヒドロキシアパタイトコーティング96ウェルプレートコーニングバイオコート354651骨吸収機能アッセイ
イメージJNIHのバージョン 1.53e画像解析と定量化
インキュベーター(CO2)サーモフィッシャー51033058細胞培養の維持
赤外線イメージングシステムバイオラッドケミドック議員ウェスタンブロット検出
倒立顕微鏡オリンポスCKX41細胞培養モニタリング、TRAP計数
イソプロパノールシグマ・アルドリッチI9516RNA沈殿
LPS(大腸菌由来のリポ多糖類)シグマ・アルドリッチL4391in vivo炎症性骨吸収
LY900009(&γ;-セクレターゼ阻害剤)セレックケミカルズS7999試験化合物 - 破骨細胞阻害剤
M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)R&Dシステム416-ML-010マクロファージの生存と破骨細胞の分化
マイクロCTスキャナーブルカースカイスキャン 1272骨の微細構造解析
マイクロプレートリーダーバイオテックシナジーH1吸光度測定(CCK-8)
ミクロトームライカ2255リンギット組織学的切片化
リン酸ナフトールAS-MXシグマ・アルドリッチN5000TRAP染色基質
針(25G、27G)BDの305122, 305109骨髄洗浄、注射
NReconソフトウェアブルカーバージョン1.7マイクロCT画像再構成
パラフィンワックスシグマ・アルドリッチP3683組織包埋
パラホルムアルデヒド(4%)シグマ・アルドリッチP6148細胞および組織の固定
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)Gibco/サーモフィッシャー14190-144細胞洗浄およびバッファー調製
ペントバルビタールナトリウムシグマ・アルドリッチP3761動物麻酔と安楽死
ホスファターゼ阻害剤カクテルロシュ4906837001リン酸化保存
PowerUp SYBR グリーンマスターミックスアプライドバイオシステムズA25742定量的リアルタイムPCR
プロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ11697498001タンパク質分解防止
PVDF膜(0.45&μ;m)バイオラッド1620177ウェスタンブロットタンパク質転写
RANKL(NF-&κの受容体活性化因子;Bリガンド)R&Dシステム462-テック-010破骨細胞分化誘導
リアルタイムPCRシステムアプライドバイオシステムズ7500 高速定量的遺伝子発現解析
ローダミン-ファロイジンInvitrogen/サーモフィッシャーR415F-アクチンの可視化
RIPAバッファ細胞シグナル伝達技術9806Sタンパク質抽出
RNaseフリーの水アンビオン/サーモフィッシャーAM9937RNA溶解とPCR
SDS-PAGEゲル(10%)バイオラッド4561036ウェスタンブロットタンパク質分離
脱脂粉乳バイオラッド1706404ウェスタンブロットブロッキング
酢酸ナトリウム緩衝液(0.1 M、pH 5.0)シグマ・アルドリッチS2889TRAP染色バッファー
酒石酸ナトリウム(50 mM)シグマ・アルドリッチS4297TRAP染色特異性
分光 光度 計サーモフィッシャーナノドロップ2000RNA/タンパク質濃度測定
SPSSのIBM株式会社バージョン 28.0統計分析
シリンジ(1 mL、10 mL)BDの309659, 309604骨髄洗浄、注射
T75細胞培養フラスココーニング430641一次BMM培養
TBST(0.1%トゥイーン-20を含むトリス緩衝生理食塩水)バイオラッド1706531ウェスタンブロット洗浄バッファー
転写バッファーバイオラッド1704270ウェスタンブロットタンパク質転写
トリトンX-100シグマ・アルドリッチT8787細胞透過処理
TRIzol試薬Invitrogen/サーモフィッシャー15596026トータルRNA抽出
トリパンブルー(0.4%)シグマ・アルドリッチT8154細胞生存率評価
トリプシン-EDTA(0.25%)Gibco/サーモフィッシャー25200-056細胞の採取と剥離
ウェスタンブロット転写システムバイオラッドトランスブロットターボメンブレンへのタンパク質の移動
キシレンシグマ・アルドリッチX3750組織処理と透明化
α-MEM(アルファミニマムエッセンシャルメディア)Gibco/サーモフィッシャー12561-056細胞培養培地

参考文献

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