研究記事

ラットにおける急性の徹底的な運動によって引き起こされる腱‐骨接合部の微小損傷:超微細構造の変化とメカニズム

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DOI：

10.3791/69184

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2025年11月14日

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1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

この記事について

サマリー

この研究は、急性の徹底的な運動による腱と骨の接合部の超微細構造の変化とメカニズムを調査することを目的としました。急性の徹底的な運動は、腱と骨の接合部に微小損傷を誘発し、小胞体ストレスとその媒介アポトーシスシグナル伝達経路を一時的に活性化します。それにもかかわらず、これらの微小損傷と小胞体ストレスは、運動後に徐々に回復することができます。

要約

腱と骨の接合部(付着部)での運動誘発性微小損傷は、腱障害を引き起こす可能性があります。急性の徹底的な運動後の付着部内の超微細構造の変化とメカニズムを調査することで、腱障害の理解を深め、臨床治療の指針となります。この研究では、36匹の雄のSprague-Dawleyラットを、対照群と徹底的な運動群の2つのグループにランダムに割り付けました。徹底的な運動グループは、運動後の時間に基づいて、0 時間、6 時間、12 時間、24 時間、および 48 時間の 5 つのサブグループにさらに細分化されました。ヘマトキシリン-エオシン染色と電子顕微鏡を使用して、踵骨腱と骨の接合部の変化を調べました。腱と骨の接合部における小胞体ストレス (ERS) 関連タンパク質 GRP78、CHOP、およびカスパーゼ-12 の発現は、免疫組織化学 (IHC) を使用して定量化されました。急性の徹底的な運動の後、徹底的な運動を受けたラットの腱と骨の接合部は有意な構造変化を示しました。軟骨細胞とコラーゲン線維は、ERSを示す顕著な超微細構造変化を示しました。ERSタンパク質レベルは運動直後に増加し、6時間でピークに達しました。これらのタンパク質レベルは、運動後12時間で低下し始め、48時間までにベースラインに戻りました。結論として、急性の徹底的な運動は、ラットの腱と骨の接合部に微小損傷と小胞体ストレスを誘発しますが、不可逆的な損傷は発生しません。これらの微小損傷のタイムリーな治療と修復により、過度の損傷や腱障害の発症を防ぐことができます。

概要

アキレス腱障害は、頻繁な足首の酷使による損傷によって引き起こされる一般的な臨床症状です。この障害は、腱の腫れ、痛み、機能障害を特徴とします。高齢者やアスリート、特にランナーやジャンパーに多く見られます。アキレス腱障害は、非挿入性腱障害と挿入性腱障害に分類されます。非挿入性腱障害は、骨挿入から2〜6 cm上の腱に影響を及ぼし、挿入性腱障害は腱と骨の接合部1に影響を及ぼします。さらに、非挿入性腱障害は、太りすぎ、高齢で、活動性の低い人に発生する傾向がありますが、挿入性腱障害は、より活動的な人に発生する傾向があります1。

腱が骨に挿入される腱と骨の接合部には、腱組織から骨組織への段階的な移行が含まれ、石灰化していない線維軟骨や石灰化した線維軟骨が含まれます2。この変化により、柔らかく柔軟な腱組織から硬い骨への移行がもたらされます。工学用語では、この領域はアンカーポイントとして機能し、関節の動きを促進するために筋力を伝達します3,4。したがって、この領域はストレス集中の場所であり、スポーツでは酷使による怪我がよく起こります。

臨床研究は主に非挿入性腱障害に焦点を当てており、腱と骨の接合部2 における挿入性腱障害にはあまり注意が払われていません。研究によると、過度の負荷はコラーゲンの混乱と断片化、脂肪組織の浸潤、腱の血管新生を促進します。また、線維軟骨細胞過形成、軟骨内骨化、および石灰化していない線維軟骨領域と石灰化した線維軟骨領域の両方の骨棘を引き起こします5。しかし、最近の研究では、挿入性腱障害において、筋肉の収縮パターンが運動量よりも重要な役割を果たす可能性があることが示唆されています 6,7。したがって、腱と骨の接合部に対する過剰使用の影響を理解するには、さらなる研究が必要です。これまでの研究では、長時間のジャンプやランニングなどの使いすぎがこれらの接合部に及ぼす影響が調査されてきました。しかし、急性の徹底的な運動の影響を調査した人はほとんどいません。最近の研究では、急性運動がラットの腎臓に小胞体ストレスを誘発し、IL-6シグナル伝達と熱ショックタンパク質(HSP)のアップレギュレーション、およびミトコンドリア呼吸複合体mRNAの減少を示すことが示唆されています8。そのような変化が腱と骨の接合部で起こるかどうかは報告されていません。この研究は、急性の徹底的な運動によって引き起こされる変化と根底にあるメカニズムを解明するために、腱と骨の接合部 (付着部) に焦点を当てています。この発見は、挿入性腱障害の予防戦略の開発に貢献することを目的としています。

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プロトコル

すべての動物実験は、四川省高等中国医学研究所科学技術部が定めた実験動物の倫理基準(承認番号:2023DS01)に従って実施されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 実験計画と手順

  1. 動物
    36匹の雄の12週齢のCD-Sprague-Dawleyラットを収容し、実験期間を通じて 自由 に給餌を与えました。環境は、温度20〜25°C、湿度レベル50%〜60%に維持され、12時間の明暗サイクルが行われました。
  2. グループデザイン
    1週間の適応摂食後、ラットは対照群(Con、n = 6)または徹底的な運動群(EE、n = 30)のいずれかにランダムに割り当てられました。EE群のラットは、傾斜10度の上り坂トレッドミルで10m/minの速度で15分間3日間走る適応訓練を受けた。アダプティブトレーニングに続いて、EEグループはさらに5つの時間サブグループに分けられました:徹底的な運動後、0時間、6時間、12時間、24時間、および48時間。
  3. 介入手順
    対照群のラットは運動しませんでしたが、EE群のラットは10度の傾斜で上り坂のトレッドミルで徹底的なランニングを受けました(図1A)。ベッドフォードプロトコル9に従って、運動負荷は3つのレベルに分けられました:レベル1で10 m / minで15分間、レベル2で15 m/minで15分間、およびレベル3で20 m / minで疲労するまで(図1B)。疲労は、低強度の電気(150 V、0.5 mAの交流)と音の刺激(70 dB)を繰り返したにもかかわらず、ラットが1分10秒未満の期間に3回走れなくなり、トラックに立ち往生したままになったときに決定されました。

ラットは、指定された時間(徹底的な運動後0時間、6時間、12時間、24時間、および48時間)に3%ペントバルビタールナトリウム(200 mg / kg)の過剰な腹腔内注射 によって 犠牲にされました。踵骨の皮膚と皮下組織を注意深く解剖し、アキレス腱を踵骨の2cm上を眼科用ハサミで切断しました。右踵骨(付属のアキレス腱を含む)は、組織病理学的検査および免疫組織化学的検査のために4%パラホルムアルデヒドで保存されました。さらに、左側からの3つのランダムサンプルを、超微細構造の変化を研究するための電子顕微鏡検査のために2%パラホルムアルデヒド-2.5%グルタルアルデヒド溶液に保存しました( 図1C)。

2.腱と骨の接合部の組織学

サンプルを4%パラホルムアルデヒドで48時間固定し、15%EDTAで室温(20〜25°C)で4週間脱灰し、溶液を毎日交換しました。脱灰プロセスは、力を加えずに針で簡単に骨を突き刺すことができるときに終了しました。脱灰後、サンプルは、段階的な一連のエタノールとキシレンを含む自動プロセスを通じて脱水され、続いて PBS で 3 回洗浄されました。サンプルをパラフィンに矢状に埋め込み、5 μm で切片化しました。ヘマトキシリン-エオシン染色は標準的な手順に従って実行され、画像は Panthera デジタル三眼マイクロカメラ システムを使用して 20× 倍率および 40× 倍率でキャプチャされました。

3. 電子顕微鏡スキャン

左側のサンプルに2%パラホルムアルデヒド-2.5%グルタルアルデヒドを48時間プレフィックスし、一連のアセトン溶液で脱水し、エポキシ硬化分析装置に浸透させ、矢状に埋め込みました。半薄切片をメチレンブルーを使用して染色し、腱と骨の接合部を同定しました。厚さ約60〜90 nmの極薄切片をダイヤモンドナイフで切断しました。これらの切片を酢酸ウラニルで10〜15分間染色し、続いてクエン酸鉛を1〜2分間染色しました。セクションは、透過型電子顕微鏡で6000×、12000×、および25000×の倍率で検査されました。

4. 免疫組織化学的アッセイ

腱と骨の接合部は、前述のように定期的に脱灰され、切片化されました。クエン酸緩衝抗原回収液と10分間インキュベートした後、サンプルを3%H2O2 で10分間処理して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、続いて正常なヤギ血清で25°Cで20分間ブロックした。次に、切片をGRP78(1:100)を含む一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。 CHOP(1:100)およびカスパーゼ-12(1:100)。続いて、サンプルを二次抗体とともに25°Cで2時間インキュベートした。 DABを用いて25°Cで8分間発色し、茶黄色の正シグナルが得られた。核をヘマトキシリンで3分間再染色し、Image-Pro Plus 6.0ソフトウェアを使用して平均密度を分析しました。腱と骨の接合部の3つの関心領域(腱、線維軟骨、および石灰化した線維軟骨)を分析のために選択し、平均値を計算しました。

5. 統計分析

GraphPad Prism 8を使用して、データを分析し、チャートを生成しました。すべてのデータは、平均±標準偏差として表されます。異なるグループ間の比較は一元配置分散分析を使用して行われ、ペアワイズ比較には最小有意差 (LSD) 検定が使用されました。0.05< P 値は統計的に有意であると考えられました。

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結果

図2Aに示すように、対照群では、腱と骨の接合部にある軟骨細胞とコラーゲン線維細胞が規則的に配置されており、線維軟骨と石灰化した線維軟骨の間には、潮痕(黄色の矢印)として知られる滑らかな青い線があります。徹底的な運動グループでは、腱と骨の接合部で超微細構造の変化が起こりました。変化には、軟骨細胞の増加(緑色の円)、コラーゲン線維の菲薄化と破裂(青い矢印)、および潮汐の変化が含まれ、「炎」または閉じた円(赤い矢印)に似た隆起または不規則な青い線として現れます。これらの変化は、運動後0時間と6時間で最も顕著でした(図2B、C)。しかし、超微細構造の変化は回復期間(運動後12時間、24時間、および48時間)にわたって徐々に回復しました(図2D-F

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ディスカッション

腱と骨の接合部は、付着部または挿入部位とも呼ばれ、腱を骨に挿入することを可能にし、靭帯と腱が骨に付着する応力集中部位です4。アンカーポイントとして、足首の動きを促進し、ふくらはぎの筋肉の収縮力を足の靭帯と腱に伝達し、足首と足の動きに参加します2。腱と骨の接合部は、腱、線維軟骨、石灰化線維軟骨、および骨 2,3 の 4 つの連続した領域で構成されています。線維軟骨から石灰化した線維軟骨への移行帯には、潮汐マーク4、11、12、13として知られる青い線があります。使いすぎによる損傷、繰り返しの機械的刺激、および...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、自然科学財団(助成金番号23ZRYB03)、研究イノベーションチームプロジェクト(TD-2022-04)、臨床医学科学教育イノベーショングループ、四川省中医薬学院、および四川省中医薬管理局が資金提供した2025年の研究プロジェクト(25MSZX329)から受けた支援に心から感謝の意を表したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2%パルホルムアルデヒド-2.5%グルターアルデヒド溶液MKBio、中国MM1515、およびnbsp;電子顕微鏡スキャン
抗カスパーゼ抗体杭州華安バイオテクノロジー有限公司HA500144免疫組織化学的アッセイ
抗CHOP抗体杭州華安バイオテクノロジー有限公司ET1703-05免疫組織化学的アッセイ
抗GRP78抗体杭州華安バイオテクノロジー有限公司ER1706-50免疫組織化学的アッセイ
バイオ顕微鏡モティック工業グループ株式会社中国BA210デジタル腱-骨接合部組織学のための生体顕微鏡免疫組織化学的アッセイ
CD-スプラグ-ドーリーラット北京ビタルリバー実験動物技術有限公司SCXK2021-0007 CD
クエン酸バッファー抗原回収溶液ZSGB-Bio、中国ZLI-9065, 免疫組織化学的アッセイ
DAB  ZSGB-Bio、中国ZLI-9018 免疫組織化学的アッセイ
EDTAシノファーム・チミカル・リーガント株式会社10009717ヘマトキシリン・エオシン染色 
エポックス812シノファーム・チミカル・リーガント株式会社XW00000020電子顕微鏡スキャン
エタノール シノファーム・チミカル・リーガント株式会社10009218ヘマトキシリン・エオシン染色 
GraphPadプリズム8 グラフパッド・ソフトウェア株式会社 GraphPadプリズム8 統計解析
H2O2nbsp;シノファーム・チミカル・リーガント株式会社011092708免疫組織化学的アッセイ
イメージプロプラス 6.0メディア・サイバネティクス株式会社 アメリカ合衆国イメージプロプラス 6.0免疫組織化学的アッセイ
パラホルムアルデヒド シノファーム・チミカル・リーガント株式会社20230408ヘマトキシリン・エオシン染色 免疫組織化学的アッセイ
PBSZSGB-Bio、中国ZLI-9062電子顕微鏡スキャン
透過式電子顕微鏡日本電子光学研究所株式会社JEM-1400Flash、日本電子顕微鏡スキャン
ラット&ラットのためのトレッドミル鼠BioMed Easy Technologies Co., Ltd  中国SA101トレッドミルで徹底的な運動を行った
キシレンシノファーム・チミカル・リーガント株式会社10023418ヘマトキシリン・エオシン染色 

参考文献

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