ラットにおける半節骨幹骨欠損モデル:荷重を支える領域における骨代替物の性能評価

サマリー

本研究では、内固定・外固定を用いない荷重負荷条件下で骨代替材料の機械的および骨生成的性能を評価するために、ラット大腿半分節欠損モデルを確立しました。

要約

骨代替材料の正確な前臨床評価には、組織再生を支援するだけでなく、生理学的荷重を支える状態の機械的課題も反映したモデルが必要です。しかし、ほとんどの従来の動物骨欠損モデルはこの点で不足しています。例えば、カルヴァリアル欠陥モデルは広く使われていますが、荷重を支えない領域で作成されます。同様に、長骨のドリル穴や部分的な欠損は主に局所的な治癒に重点を置き、十分な荷重伝達が不足して機械的支持を評価することはできません。本研究は、固定装置を使用せずに荷重を支える文脈で骨代替材料の機械的および生物学的性能を評価するために、ラット大腿骨の標準化された半節骨幹骨欠損モデルを確立しました。高速ハンドピースと特殊な円筒形歯科バーを用いて、大腿骨の外側中央軸に長さ4mm、半径1.5mmの半円筒形の欠損を形成しました。異なる特性を持つ代表的な材料、ジェラチンメサクリロイル(GelMA)ハイドロゲルと3Dプリントポリメチルメタクリレート(3DP-PMMA)が、材料の機械的特性を区別するモデルの能力を検証するために埋め込まれました。着床後4週間に行われた放射線学、組織学的および免疫蛍光解析により、GelMAの埋め込みが不全結合を引き起こし、線維組織が優勢で骨統合が制限されることが判明しました。これに対し、3DP-PMMAは新しい骨形成、骨膜の連続性、ピエゾ型機械感受性イオンチャネル成分1発現(Piezo1⁺)およびレプチン受容体発現細胞(LepR⁺)のリクルートを促進しました。このモデルは、生体材料の荷重維持能力、骨誘導性、骨統合の可能性を評価するための実用的かつ再現性の高いプラットフォームを提供します。長骨再建や骨折修復などの整形外科用途の候補材料を選別する際に有用なツールとなります。

概要

生理的条件下では、骨は体の構造的な完全性と機械的機能を維持する上で中心的な役割を果たします。体重を支え、動きを可能にし、内臓を保護します。骨が外傷、腫瘍切除、または感染症によって損傷すると、特に荷重を支える領域において、機械的な連続性が途切れます。この障害はしばしば、骨の変形、可動性の低下、四肢の不安定さ、慢性的な痛み、さらには重度の骨折や出血による生命を脅かす問題を引き起こすこともあります^。現在では、骨移植やバイオマテリアルなどの骨代替品が臨床的に応用され、重度に損傷した骨組織の置換や大規模な骨欠損の修復に活用されています。同様に、埋め込み骨の代替品も機械的性能の低下によりインプラントの失敗を引き起こし、欠^損部位で非癒合や壊滅的な骨折を引き起こす^{ことがあります。}構造と機能の両方を回復するためには、骨の再生を促進するだけでなく、生理的負荷に耐える十分な機械的強度も持っていなければなりません⁵。

臨床翻訳に至る前の重要なステップは、生体材料が生体内で埋め込まれた後、荷重を支える骨領域の構造的支持に必要な機械的要求を満たせるかどうかを現実的に評価することです。多くのバイオマテリアルはin vitroや小型で荷重を支えないモデルで有望視されていますが、臨床現場への応用は、in vivoの機械的条件をシミュレートする信頼性の高い前臨床モデルの不足によりしばしば妨げられています。現在骨欠損研究に用いられている動物モデルには、下顎欠損⁶、頭骨欠損^7、長骨の穴抜き欠損^8、抜歯後のソケット⁹などがあります。これらのモデルは主に材料の骨形成能力を評価し、組織学的または放射線学的再生のエンドポイントに焦点を当てています^10,11。しかし、これらの部位は荷重を支えていないか機械的に保護されているため、長骨¹²で遭遇する動的応力条件を再現することはできません。圧縮強さアッセイや引張強度アッセイなどのin vitro技術で機械的特性を検証しても、in vivo環境に固有の動的負荷や宿主組織の相互作用を再現することはできません¹³。

前臨床研究における大きなギャップは、荷重を支える条件下で骨代替品を生体内で機械的に評価できる標準化され再現可能な動物モデルの欠如です。これに対処するため、本研究ではラットにおける半節骨幹部骨欠損モデルが確立されました。このモデルは荷重負荷領域に安定かつ再現可能な欠損部位を提供し、生理的負荷下での骨代替材料の機械的支持能力を直接評価するとともに、同時に骨生成的アウトカムの評価を可能にします。さらに、このモデルは様々な動物種に適用でき、欠陥の大きさや位置は使用される動物に応じて調整されます。しかしながら、人間の骨の複雑な生体力学的環境を完全に再現するものではなく、非荷重欠損、頭蓋骨の治癒、非常に大きな構造的インプラントのみに焦点を当てた研究には、代替モデルの方が適している場合があります。

プロトコル

本研究で行われたすべての動物処置は、四川大学華西口腔医学院倫理委員会(WCHSIRB-AT-2025-342)の承認を受けています。オスのスプラグ・ドーリーラット(1匹あたり180g)は商業的な供給源から採取され、移植された材料に応じて2つのグループ(n=6個)にランダムに割り当てられました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 術前準備

1. 外科用アイテム
   1. 図1Aを参照する手術器具を、図の番号ラベルに対応する順序で準備します:曲がったピンセット、使い捨て滅菌メス、直線ハサミ、骨膜エレベーター、洗浄針、特定の歯科用ダイヤモンドバー(図1Bの拡大図参照)、高速ハンドピース、バーニアキャリパー、手術用モーター、モノフィラメント縫合(4-0)、針ホルダー。
   2. 灌漑用に0.9%の無菌生理食塩水を準備します。
2. 滅菌と消毒
   1. オートクレーブに耐えられる手術器具(曲がった鉗子、ハサミ、骨膜エレベーター、歯科用ダイヤモンドバー、高速ハンドピース、針ホルダーなど)を滅菌してください。
      注意:器具は医療用不織布で包み、オートクレーブテープで密封して121〜134°Cで20〜25分間蒸気滅菌を行う必要があります。
   2. バーニアキャリパーや外科用モーターなどの熱感性器具は、消毒のために少なくとも30分間紫外線に当ててください。使い捨ての滅菌メス、洗浄針、縫合糸などの使い捨て品は、使用まで元の滅菌包装のまま密封しておきましょう。
   3. 手術環境を無菌で温度管理していることを確認しましょう。手術台とその周囲の表面を75%エタノールで拭き取ってください。手術台を覆うには、無菌の医療用不織布を使いましょう。
      注意:エタノールは可燃性です。引火源から離して持ち込み、密閉容器に保管してください。エタノール廃棄物は指定された化学廃棄物容器に集め、適切に処分してください。手袋、白衣、安全ゴーグルなどの適切な個人用防護具を着用してください。
3. 麻酔
   1. ラットの体重を測り、麻酔用量(ケタミン100mg/kg、キシラジン10mg/kg、腹腔内投与)を計算します。
   2. 手術の20分前に麻酔を誘導し(機関承認のプロトコルに従い)、つま先のつまみに反応がないか、正しい反射が失われているかを確認して深さを確認します。
   3. 手術中に角膜乾燥を防ぐために両目に眼科軟膏を塗布してください。

2. 手術

1. 敷地準備
   1. ラットを無菌の手術台に横向きに横たわりた姿勢で置きます。大腿骨突出部に対応する外側の太もも部分を剃り、2%ヨウ素ティンクで皮膚を消毒し、その後75%エタノールを消毒します(図2Ba)。
      注意:ヨウ素チンキは可燃性で刺激性があります。換気の良い場所で手袋、白衣、安全ゴーグルを着用して扱いましょう。使用済みのワイプや溶液は、機関の安全規則に従って指定された化学廃棄物容器に処分してください。
   2. 無菌を維持するために、手術部位に無菌の開孔シートをかぶせます。
2. 手術部位の開設
   1. 手術中は、組織の安定化、筋肉の保持、そして大腿骨の優しい固定を補助するために湾曲鉗子を使いましょう(図2Bb-h)。
   2. まっすぐなハサミで太ももの外側に2〜3cmの縦方向の皮膚切開をして、下の筋肉を露出させます(図2Bb)。
   3. 大腿直筋と外側広筋を特定し、直線ハサミ(図2Bc)で白い筋膜(図2Bbの黄色い矢印で示されている)に沿って慎重に分けてください。
   4. 大腿骨の外側表面にある筋肉の付着部を見つけて露出させます(図2Bd)。
   5. 使い捨ての滅菌メスで筋肉付着部に沿って縦方向の切開を行い、大腿表面にアクセスします(図2Be)。
      注意:軟部組織の分離のために鋭い解剖(ハサミやメスを使った)を行う際は、基礎となる血管や神経を損傷しないように注意してください。解剖学的構造に慣れていない場合は、細かい鉗子と骨膜のエレベーターを使って鈍的解離を行います。
   6. 骨膜昇降機を用いて鈍的解離を行い、筋肉の付着部を切り離し、大腿骨の中間骨幹を完全に露出させます(図2Bf)。
   7. さらに大腿骨を周囲の筋肉から切り離し、曲がった鉗子で大腿骨の中央軸を保持します(図2Bg)。
3. 半節骨幹欠損モデルの確立
   1. 平らな端の円筒形特定歯用ダイヤモンド(図1B)を高速ハンドピースに取り付け、手術用モーターで駆動します。手術用モーターを35,000回転に設定してください。
   2. 直接視覚化の際、大腿骨中軸の最も高い位置を欠損形成の解剖学的中心と特定します。この点からバーを使って垂直に下方向にドリルし、突然抵抗が失われ、欠損部内に血流が現れることが確認されます。これは完全な皮質貫通と髄質腔へのアクセスを示しています(図2Bh)。
      注:皮質厚の動物間変動を考慮すると、操作者は大腿骨解剖学に精通し、このステップを標準化するための事前実験訓練を行うことが推奨されます。
   3. 初期貫通点を中心とした制御された水平プッシュプル運動を適用して欠陥を拡大します。欠損を縦方向(大腿軸に沿って)および外側(大腿径に沿って)延長し、徐々に標準化された半円筒形の欠損を形成します。長さ4mm、半径1.5mmです(図2Bi、欠損の形態と位置は 図2A を参照)。
      注意:中心点が確定したら、バーニアキャリパーを使って段階的に欠陥を拡大し、すべての試料で均一な寸法を確保してください。特殊な歯科用バーの平らな円筒形設計は半円筒型の欠陥に合致し、効率的かつ再現性の高い準備を可能にします。
   4. 骨切断時の熱壊死を防ぐため、洗浄針を用いて無菌生理食塩水で手術部位を継続的に洗浄してください。
4. 骨置換移植
   1. 骨の破片を優しく取り除き、残留粒子を除去するために洗浄を行います。
   2. 欠陥部位に機械的性能試験用に、非荷重支えゼラチンメサクリロイル(GelMA)ハイドロゲル(材料 表参照)または荷重負荷を支える3Dプリントポリメチルメタクリレート(3DP-PMMA)を埋め込み、密着性を確保します(図2Bj)。
      注:ここで使用された2つのバイオマテリアルは、機械的および生物学的特性を表現するために意図的に選ばれています。GelMAハイドロゲルは軟らかく、荷重を支えない材料で骨形成ポテンシャルが限られているのに対し、3DP-PMMAは硬質で荷重を支える足場として機能し、効果的な応力伝達と骨形成の支援を行います¹⁴ (図2A)(図2A)。).この対比は、モデルが幅広い機械的強度や生物学的性能を持つインプラントを評価できることを示しており、実際には欠陥モデルは機械的特性を持つ他の候補材料の試験にも応用可能です。
5. 手術部位閉鎖
   1. 4-0モノフィラメント縫合糸と針ホルダーで筋肉層を縫合し、過度な緊張を避けるよう注意してください(図2Bk)。
   2. 縫合を中断して皮膚を閉じ、手術部位を2%ヨードホーサー溶液で消毒します(図2Bl)。

3. 術後ケア

1. ラットを消毒済みの恒温パッド(37°C)に移し、術後の回復を促します。
2. 適切な術後鎮痛剤(例:ブプレノルフィン0.03 mg/kgを皮下投与、12時間ごとに48〜72時間投与)。
3. 意識を取り戻したら、柔らかい寝床と食べ物や水へのアクセスが良い清潔なケージに入れてください。
4. 手術部位を毎日観察し、感染、裂け目、異常な腫れの兆候がないか確認してください。手術後少なくとも7日間はラットの行動、体重、可動性を観察し、回復を確保し福祉を評価してください。

4. サンプル採取とデータ収集

1. サンプル採取
   1. 二酸化炭素吸入でラットを安楽死させ、その後(機関承認プロトコルに従い)二次確認を行います。
   2. 着床後4週間に大腿骨標本を収穫し、最初に2つの材料グループ(n=6組)に無作為に分けて材料の機械的性能を評価します。
      注:GelMA群では、手術直後に3匹の動物が完全骨折を起こし、除外され、3つの標本が後続解析のために残されました。
   3. 大腿骨標本を4%のパラホルマルデヒドに48時間、4°Cで固定します。
      注意:パラホルマルデヒドは有毒であり、認定されたフムフードで取り扱うべきです。手袋、白衣、安全ゴーグルまたはフェイスシールドを着用してください。廃棄物溶液はラベル付きの有害化学廃棄物容器に集めて処分してください。
2. マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)評価
   1. 着床後4週間に採取した大腿動脈標本に対して、以下のスキャンパラメータでμCTスキャンを実施します:X線チューブ電位70 kVp;X線強度0.2 mA;フィルターはAL 0.5mm;積分時間:1×300 ms;ボクセルサイズは17μmです。
   2. μCTマシンソフトウェアに用意されたあらかじめ定義されたスクリプトを使って3D再構築を行います。専用画像処理ソフトウェアのリスライス機能を用いて欠損部位の断面画像を作成します。各ソフトウェアマニュアルに記載されている標準ワークフローに従ってください。
3. 組織学的染色
   1. サンプルを4°Cで12%エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)(pH7.2)を使い、シェイカーで6週間脱炭素します。
      注意:EDTA溶液は2日ごとに交換してください。脱石灰の進行状況を定期的に確認してください。脱鈣は、試料が圧力下で柔軟になるか、針を通過したときに完了します。
      注意:水性化学廃棄物に関する機関ガイドラインに従ってEDTA溶液を処分してください。汚染された生物材料は生物有害廃棄物として処理されるべきです。
   2. 試料を段階的にエタノール希釈液で脱水し、その後パラフィンに埋め込みます。
   3. パラフィン埋め込みサンプルを矢状状に6μm厚のスライスに切ります。
      注意:挿入された材料と宿主組織の界面を含む切片を必ず含めてください。
   4. 市販キット(材料 表参照)を用いてヘマトキシリン・エオシン(H&E)およびマッソンのトリクロム染色を行います。すべての手順は、製造元の標準プロトコルに厳密に従って、逸脱なく実施してください。組織病理学で欠損部位の治癒を観察します。
      注意:染色剤や汚染された消耗品は、施設のバイオセーフティおよび有害廃棄物処理プロトコルに従って処分してください。
4. 免疫蛍光(IF)染色
   1. キシレンおよびグラデッドエタノール溶液を用いて、厚さ6μmのパラフィン断片を脱水・再水和します。
      注意:キシレンは可燃性かつ有毒です。手袋、白衣、安全ゴーグルを着用して、排気フード内でキシレンを扱う。廃棄物溶媒は化学廃棄物容器に別々に集めて適切に処分してください。
   2. 抗原回収を行うには、シトレートバッファー(pH 6.0)で95〜100°Cで15〜20分間培養します。スライドを自然に室温まで冷やします。
   3. 切片をリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で5分間洗浄し、20分間0.1%トリトンX-100をPBSで処理して抗体の浸透を促します。その後、室温でPBSで5%牛血清アルブミン(BSA)を1時間ブロックします。
      注意:Triton X-100は厄介者です。換気の良い場所で手袋、白衣、安全ゴーグルで扱う。Triton X-100溶液は化学廃棄物として指定された容器に処分してください。すべての手技において、BSAやPBSなど組織切片に接触した溶液は生物学的廃棄物とみなされ、機関のバイオセーフティプロトコルに従って収集・廃棄されるべきです。
   4. 一次抗体(抗ピエゾ型機械感受性イオンチャネル成分1(Piezo1、希釈1:200)、抗レプチン受容体(LepR)、希釈1:50)で切片を希釈バッファーで培養します。各切片に希釈抗体溶液50μLを塗布し、加湿チャンバーで暗闇4°Cで12〜18時間培養します。
   5. スライドをPBSで洗浄(3分×5分)、その後、蛍光色素結合の二次抗体(希釈した1:200)で培養します。各切片に50μLの希釈抗体溶液を塗布し、室温の加湿チャンバーで暗闇のまま2時間培養します。
   6. スライドをPBSで再度洗い流します(3分×5分)、その後、4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)(希釈した1:50)で核を5分間カウンターステインします。
   7. セクションにはアンチフェード用マウンティングメディウムを使い、カバースリップで覆います。
   8. 適切なフィルター設定でレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて画像を可視化し、キャプチャします。

結果

本研究では、ラットの半節型骨幹骨欠損モデルを、大腿骨中央軸に長さ4mm、半径1.5mmの欠損を平らな円筒形の特定の歯用ダイヤモンドバーでドリルすることで確立しました(図2A)。材料の機械的および生物学的性能を試験するモデルの能力を示すため、欠陥をGelMAハイドロゲルまたは3DP-PMMAのいずれかで埋め込む2つの比較群を設定しました(図3、図4、図5)。GelMAハイドロゲルは機械的強度が低く、骨形成能力が最適でないのが特徴ですが、3DP-PMMAは信頼性の高い荷重耐力と効果的な応力伝達特性を持つと仮定されています^(15,16)。GelMA群では、半数の動物が手術直後に完全な骨折を起こし、さらなる解析から除外されまし...

ディスカッション

骨誘導性、骨統合性、生体適合性といった広く強調されている特性^{に加え、骨}代替品の機械的応答性と荷重維持能力も同様に重要であり、特に体重を支える骨の欠陥修復に活用^{されています。}従来の機械的性能評価は通常、ユニバーサル試験機、圧縮試験、引張^{強度分析などの}in vitro方法^{に依存しています。}有益ではあるものの、これらのアプローチは^{生理的条件下}で埋め込まれた材料と宿主組織との複雑な機械的相互作用を捉えきれていません。このギャップを埋めるために、荷重を支える環境での機械的刺激を模倣したin vivoモデルが、骨代替品の真の構造的性能を評価するために不可欠です。一般的な骨欠損モデルの中で、頭頂欠損は膜内骨化を研究するため...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2%ヨードホル溶液	成都金山化学試薬有限公司	全くありません
3Dプリントポリメチルメタクリレート(3DP-PMMA)	四川大学高分子科学工学学院よりご厚意で提供	全くありません
4% パラホルムアルデヒド	バイオシャープ	BL539A
エタノール75%	成都金山化学試薬有限公司	全くありません
綿球	海石海諾集團有限公司、nbsp;Ltd.	全くありません
綿棒	ラコン医療機器株式会社	全くありません
DAPI染色溶液	Beyotime	分類番号#C1005
使い捨て滅菌メス	杭州華為医療用品有限公司	20100227
ゼラチンメサクリロイル(GelMA)ハイドロゲル	四川大学高分子科学工学学院よりご厚意で提供	全くありません
GelMA 20%	Cellink	IKG125000005
ヤギ抗マウスIgG H&L(Alexa Fluor® 594)	アブカム	ab150116
ヤギ抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor® 488)	アブカム	AB150077
ヘマトキシリンと嗜青染色キット	バイオシャープ	C1005
高速ハンドピース	佛山SCS医療機器有限公司	9018499000
灌漑針	四川新世紀医療ポリマー製品有限公司	全くありません
マッソンSトリクロームステインキット	ソーラービオ	G1340
医療用不織布	河南雅度工業有限公司およびnbsp;	全くありません
医療用不織布	河南雅度工業有限公司およびnbsp;	全くありません
マイクロコンピュータ断層撮影(およびmicro;CT)	スキャンコ・メディカルAG	μCT 45
断面画像(リスライス機能)を模倣する20.0	マフィリアライズ	全くありません
ニードルホルダー	成都石風有限公司	全くありません
OB-R/レプチン受容体抗体(B-3)	サンタクルーズ	SC-8391
オリンパス研究グレード 全スライドスキャンシステム VS200	成都知識技術有限公司	VS200
骨膜エレベーター	成都石風有限公司	全くありません
PIEZO1抗体	ノヴァス	NBP1-78446
生理食塩水溶液	四川科倫製薬有限公司	全くありません
Scancoの3D画像再構成用医療ビジュアライザーソフトウェア(事前定義スクリプト)	スキャンコ・メディカルAG	全くありません
特定歯科用ダイヤモンドバー(TF-22/170-021m/845-021m)	電通歯科材料会社	全くありません
スプラグ・ドーリーのネズミとnbsp;	バーネス・ワイル・バイオテック社	全くありません
ストレートシザーズ	成都石風有限公司	全くありません
サージカルモーター	マラソン	N3-140232
外科用縫合(4-0モノフィラメント)	杭州華為医療用品有限公司	全くありません
バーニアキャリパー	デリ	DL91150