FLEX:ショウジョウバエの飛行運動トレーニングプロトコル

サマリー

このプロトコルの目標は、ショウジョウバエに飛行運動を提供することです。代表的な結果は、飛行運動トレーニングが有酸素能力と高脂肪食に対する抵抗力の増加をもたらすことを示しています。

要約

ショウジョウバエは最近、肥満および関連疾患を研究するための一般的なモデルになっています。特定の食事を使用してショウジョウバエの代謝障害を誘発するのは比較的簡単ですが、ハエの運動モデルを作成することはより困難です。パワータワーやトレッドホイールなどの既存の方法では、バイアルを振ったり回転させたりして、ハエの負の走位性反応を利用してハエを登らせます。しかし、長時間の継続的な登山はハエにとって不自然であり、運動による怪我や死亡につながる可能性があります。この論文では、ハエの自然な飛行能力を活用し、より自然で生理学的で怪我のない運動アプローチを提供する新しい運動プロトコルを紹介します。実験は、5日間の飛行運動計画がハエの生体エネルギー能力を高め、西洋食(WD)の悪影響を打ち消し、登山行動を改善し、WD関連死亡率を低下させることを示しています。このプロトコルにより、多数のハエを同時に訓練して、運動と食事、薬物、老化、遺伝学などのさまざまな要因との相互作用を研究することができます。この方法を組み合わせることで、ハエの生理機能と行動に対する運動の影響を研究するための既存の方法を補完することができます。

概要

身体活動と運動は、即時および長期的な健康上の利点について集中的な研究の焦点となっています¹。代謝に対する強力な全身効果により、運動は代謝障害、心血管障害、神経障害の予防と治療にますます使用されています ^2,3,4。定期的な運動に関連する多くの健康上の利点の証拠が増えているにもかかわらず、それらの利点を支える正確な分子メカニズムはほとんど理解されていません⁵。これらのメカニズムを理解するには、革新的でハイスループットな動物モデルの使用が不可欠です。げっ歯類モデルは、代謝性疾患に対する運動の影響を調査するために一般的に使用されますが、そのような研究には多額のコスト、規制上の監視、および^{特殊な機器}が必要です^6,7。

最近、ショウジョウバエは運動生物学を研究するための新しいモデルとして浮上しました(レビュー8,9,10)。ショウジョウバエは、幅広い強力な遺伝ツール、短いライフサイクル、広範な子孫、経済的なメンテナンス要件を備えており、遺伝的、エピジェネティック、世代を超えたメカニズムを調査するための貴重なリソースを提供します。ハエの運動をモデル化する場合、現在の方法は通常、負のジオタクシス、つまり上向きに登るための行動反応に依存しています^11,12。

最初の自動運動プロトコルの1つは、パワー^タワー11と呼ばれる特別な運動装置を利用しました。パワータワーは、動物の入ったバイアルを繰り返し持ち上げてから落下させ、負のタクシー応答を誘導するモーターユニットを使用します¹¹。パワータワーでの長時間の運動は、加齢に伴う可動性と心臓機能の低下を大幅に減少させます¹³。さらに、パワータワー療法はハエにとってストレスになる可能性があり、過度のトレーニング強度は怪我や死亡を引き起こすことが報告されています¹¹。

この問題に対処するために、トレッドホイールと呼ばれる別の運動パラダイムが開発されました¹⁴.トレッドホイールもショウジョウバエの負の走位性反応を利用していますが、パワータワーのようにハエを持ち上げたり落としたりする代わりに、動物の入った小瓶を反転させます。パワータワーとは異なり、この方法はハエに優しく、運動による怪我や死亡率を防ぎます⁹。ただし、トレッドホイール内のハエは回転運動に慣れる可能性があり、結果の解釈を複雑にする可能性があります¹²。この問題に対処するために、運動中の活動を測定し、ショウジョウバエの活動を定量化し、慣れを説明するために、運動活動モニター (LAM25H、Trikinetics) が追加されました。その後、システムの名前は回転運動定量化システム(REQS)¹²に更新されました。

興味深いことに、ショウジョウバエの自然な飛行能力を利用して運動をモデル化した研究はほとんどありませんでした。飛行研究の主な焦点は、空中でのホバリングと操縦の空気力学と生体力学的側面にありました15,16,17,18。いくつかの研究では、^{フライト 19,20} に関連する生理学的および細胞的メカニズムが掘り下げられています。これらの研究では、飛行能力は飛行アッセイ^21,22を介して評価され、個々のハエが透明なアクリルの箱に放出され、安定した高度と飛行を維持する能力が観察されました²³。

ある特定の研究では、研究者らはボルテックス型シェーカーに取り付けられたボトルにハエを入れることにより、誘導飛行運動の効果を調べました。シェーカーは、プログラム可能なタイ^マー19を使用して、5分から10分の間のランダムな間隔でボトルを穏やかに振った。この研究では、誘導された飛行行動が老化を促進し、飛行筋の加齢に伴う抗酸化能力の喪失を報告しました¹⁹。私たちの研究室は、以前の研究に基づいて、自動化された負のジオタクシス システムと大型コンテナ²⁴ にハエを収容することにより、FLEX (飛行運動) と呼ばれる新しい運動プロトコルを開発しました。FLEXトレーニングでは、ハエはモーターに取り付けられた水平プラットフォームに縛られた1ガロンの透明なプラスチック製ドラム金魚鉢に入れられました。モーターはタイマーによって制御され、5分ごとにモーターの回転を開始しました。回転するたびにプラットフォームが上昇し、その後下に落とされ、ハエが飛び立ちました。FLEX は、5 日間、毎日 7 時間実行されました。運動に関連した死亡や怪我は観察されませんでした²⁴.さらに、西洋食 (WD) のハエにおける 5 日間の FLEX レジメンは、WD の悪影響を著しく打ち消し、生存率、登山行動、およびミトコンドリア呼吸を改善しました²⁴。この論文は、怪我を引き起こさない自然な飛行活動に基づく新しい運動パラダイムを提示します。これは、運動、食事、薬物、老化、環境、および/または遺伝学の間の相互作用を研究するために、多数のハエを同時に訓練できるハイスループット手順です。このプロトコルは、既存の運動方法を補完して、ハエの生理機能と行動に対する身体活動の影響を研究するために使用できます。

プロトコル

1. エクササイズマシンのセットアップと操作

1. 大学機械工場で機械を組み立てる。AC/DCモーターと35mm x 35mm x 0.5mmの水平アルミニウムプラットフォームを備えた35mm x 35mm x 1.4mmの長方形アルミニウムベースを使用します(図1A)。
2. 回転運動を直線運動に変換するには、モーターに取り付けられた直径15cmのカスタムメイドの回転丸型カムを構築します(図1B)。2cmのローラーでフォロアを水平プラットフォームの下部に取り付けて、プラットフォームがフォロワーによって持ち上げられ、フォロワーローラーがカムをクリアしたら元の位置に戻します。
3. 回転ポテンショメータでモーターの速度を調整し、全回転周期の長さが約5,360msになるようにします。
   注:正確なモーター仕様、フォロワーとローラーの寸法、およびカムの形状は重要ではありません。プラットフォームを確実に持ち上げたり下げたりしてハエを追い払い、落下頻度をユーザーが制御できる電動構成であれば、許容されます。
4. 1ガロンの透明なプラスチック製のドラム金魚鉢を、ネジアイに引っ掛けたバンジーコードでプラットフォームに固定します(図1C)。

2. FLEXプロトコル

1. ハエは、24°Cのインキュベーターまたは湿度60%、明暗サイクル12時間の部屋に保管します。
2. 孵化後3〜4日以内に年齢に合ったハエを集めます。収集後、ハエを運動グループと座りがちなグループにランダムに割り当てます。運動グループと座りがちなグループの両方に同じ数のハエを使用します。
   注:ハエは、飛行運動を妨げないため、ボウルあたり30〜400匹の範囲の密度で飼育することができます。ただし、比較可能性を確保するために、実験群と対照群は、数、性別、年齢を常に一致させる必要があります。
3. 座りがちな管理されたハエに7 mLの製剤食品を提供します。食品バイアルをボウルにテープで固定します。
4. 運動療法を開始する前日に、軽くて短い CO₂ 麻酔を使用してハエをボウルに移します。ボウルの開口部を輪ゴムで固定したメッシュで覆います。
   注:ハエは、パッド上の軽いCO₂ の下で短時間麻酔する必要があります。永続的な行動への影響を避けるために、曝露は短くする必要があります。したがって、運動実験の1日前に麻酔を行う必要があります。
5. ボウルをバンジーコードでプラットフォームに固定します。運動トレーニングは、温度24°C、湿度60%の部屋で行います。部屋の湿度が制御されていない場合は、濡れた綿の入った小瓶を金魚鉢に入れ、小瓶をボウルの壁にテープで固定して、ハエが水にアクセスできるようにします。
6. 対照実験(偽運動)の場合は、エクササイズマシンの隣に配置されたボウルに同数のハエを置きますが、プラットフォームには取り付けられていません。
7. 運動は5日間連続で飛ぶ。
   1. 2つのタイマーでモーターを制御します(図1D)。最初のタイマーは、一日の特定の時間にマシンのオンとオフを切り替えます。午前8時に運動を開始し、午後3時に終了します。
   2. 2 番目のタイマーを使用して、一連の 3 つのモーター回転を開始し、各シーケンスは 5 分ごとに発生します。回転するたびにプラットフォームが上昇し、その後下に落下し、ハエが飛び始めます。
   3. 特定の日の運動治療が完了したら、ボウルをインキュベーターに戻します。このプロトコルは、特定の実験に合わせて簡単に変更できます。
      注意: 湿度が60%未満になると、死亡率が増加する可能性があります。少数のハエは、最初の落下後に飛行を開始しない場合がありますが、通常は 2 回目または 3 回目の落下後に飛行を開始します。すべての個体の飛行を追跡することは不可能ですが、大多数のハエは飛行に従事しており、すべてのハエが最終的に運動に参加すると想定されています。さらに、大きなコンテナは、ドロップ間の自発的な飛行のためのスペースを提供します。
8. FLEXレジメンの最後に、ボウルを冷蔵室に5分間置いてハエを固定します。次に、ハエを新しい食品バイアルに移して表現型特性をさらに分析するか、関心のある分子および/または生化学的アッセイのために微量遠心チューブに移します。
   注:さらなる分析の例には、行動および生化学的アッセイおよび/または遺伝子発現が含まれます。生きたハエを含むアッセイは、表現型アッセイの特定の目標に従って迅速に実施する必要があります。プロトコルは、実行する評価に応じて、生化学/分子生物学用のサンプルを凍結し、適切に保存してここで一時停止できます。プロトコルの概要を 表1に示します。

結果

FLEX プロトコルは、以前に私たちの研究室から公開された研究で検証されました。発表された研究では、飛行運動が西洋食 (WD) の代謝への悪影響を軽減することを示しました²⁴。この食事療法は、標準的なニュートリフライブルーミントン食事に基づいて作られ、15%のNutiva USDA認定オーガニック、非遺伝子組み換え、レッドパーム油、15%のスクロース、および0.1 M NaClが以下に追加されました。

運動がWDの悪影響を防ぐことができるかどうかを調べる目的で、生後3〜4日の成体のオスのショウジョウバエを次の4つのグループのそれぞれにランダムに割り当てました:1)CDの座りがちなハエを制御します。2)WDで座りがちなハエ。3)CD(CDE)の運動ハエ。4) WD (WDE) で運動が飛びます。

実験では、5日間のFLEXレジメンがWDのハエの死亡率を大幅に低下させ(~2倍)、飛行運動がWDの悪影響を著しく相殺した...

ディスカッション

FLEXプロトコルは、ショ ウジョウバエ の有酸素運動を誘発するための新規で生理学的に関連する方法を提供します。負のジオタクシーや機械的攪拌に依存するパワータワーやトレッドホイールなどの従来のパラダイムとは異なり、FLEXはハエの生来の飛行挙動を利用します。このアプローチにより、運動誘発性の損傷やストレス反応が最小限に抑えられ、運動生物学にとってより安全で生物学的に適切なモデルとなります。

昆虫は、非常に高い質量比代謝率を特徴とする、最もエネルギー的に要求の厳しい有酸素運動の1つとして飛行に依存しています²⁶。何百万年にもわたる進化を通じて、彼らはホバリング飛行を洗練させ、採餌中も空中に浮遊したままにすることができます。ショウジョウバエの翼の鼓動は1000Hzを超える可能性があり、有酸素代謝を20〜100倍に上昇させ、動物界全体で記録された最高の代謝率の中で^{27,28です27,28}。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
17×100 mm 14 mLポリプロピレン培養チューブ	VWR	60818-689
1ガロンクリア プラスチック製ドラムフィッシュボウル	ペットコ	該当なし	ペットコで入手可能
8コンセントのサージプロテクターと7日間デジタルタイマー付き	BN-LINK	EGPH020028	Amazonで入手可能です
AC/DCモーターおよびnbsp;	デイトン	モデル12W368、トルク80 IN-LBS
ブルーミントン製剤ダイエット	ニュートリフライ	66-112	サンディエゴのGenesee Scientific Inc.より入手可能
キムワイプ	フィッシャー・サイエンティフィック	06-666	キンバリー・クラーク・プロフェッショナル 34120
カウントダウンと無限短サイクルを備えたアウトレット多機能プログラムタイマー	NEARPOW	SPM10188153502	Amazonで入手可能です