方法論記事

Huaihua粉末を用いたUPLC-Q-Orbitrap質量分析におけるDDAとDIAの取り込みモードの比較研究

DOI：

10.3791/69227

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2025年10月3日

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacy, Shizuishan Maternal and Child Health Hospital, 3Department of Assets and Laboratory Management, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

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この研究では、複雑な TCM である Huaihua Powder を分析するための DDA モードと DIA モード (UPLC-QE-Orbitrap MS) を比較します。最適化された DDA および DIA メソッドが開発されました。化合物は、Compound Discoverer を介して 同定されました。性能(化合物の同定、再現性、スペクトル品質、感度)が評価され、TCMスキャンモードの選択に経験的なガイダンスが提供されました。

要約

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この研究では、複雑な漢方薬(TCM)製剤の包括的な化学プロファイリングのために、データ依存取り込み(DDA)とデータ非依存取り込み(DIA)の2つの質量分析取り込みモードの比較性能を、超高速液体クロマトグラフィー-四重極-Orbitrap高分解能質量分析(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)と組み合わせて体系的に評価します。古典的に配合された処方箋である Huaihua Powder は、経験的評価のモデル システムとして採用されました。最適化された DDA と DIA の取り込み法が別々に確立され、DDA 法ではフラグメンテーションパラメーターをカスタマイズしたターゲット前駆体イオン選択戦略が組み込まれ、DIA 法ではターゲット m/z 範囲をカバーするセグメント化された可変ウィンドウ戦略が採用され、すべての前駆体イオンに対して偏りのないフラグメンテーションを実行しました。化合物の同定は、Compound Discovererソフトウェアを使用して実行されました。比較評価では、同定された化合物の数、再現性、MS/MSスペクトル品質、および低存在量の有効成分の検出感度を含む、2つの取り込みモードの性能特性に特に焦点が当てられました。結果は、DDAモードの方が検出された化合物の総数が多いのに対し、DIAモードの方が信頼度の高い同定の割合が高いことを示しました(スペクトルマッチスコア>0.8)で10.63%)。特に、DIAアプローチは、6つの代表的な化合物の保持時間とピーク面積において有意に優れた再現性を示し、ルチンは2つの取得モード間で保持時間RSDに>3倍の差を示しました。ただし、DDA は明確なフラグメントイオンを含むよりクリーンな MS/MS スペクトルを生成しましたが、DIA スペクトルは汚染イオンからの干渉を示しました。同時に、DIAは、DDAモードでイオンクロマトグラムとMS/MSフラグメントを抽出できない低存在量の有効成分を効果的に検出しました。この研究は、複雑なTCM製剤研究のための高分解能質量分析取得モードの選択に情報を提供するための重要な実験的証拠と分析データセットを提供します。その後の研究者は、両方のアプローチの補完的な利点を統合して、包括的な化合物特性評価において二重の目的を達成する可能性があります。

概要

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伝統的な漢方薬 (TCM) の処方は、成分濃度に大きなばらつきを伴う複雑な化学システムを備えており、特に多数の低存在量の有効成分が存在するため、分析技術に深刻な課題が生じています。古典的で有名な伝統的な漢方薬の処方である淮化粉末は、Sophora japonica、Platycladus orientalis の葉、Schizonepeta tenuifolia スパイク、Citrus aurantium peel の 4 つの薬草で構成されています。このフォーミュラには、フラボノイド、アルカロイド、揮発性油などの多様な生理活性物質が含まれており、その濃度には大きなばらつきがあります。これは、TCM 処方の物質的基礎を研究するための複雑なシステム1 の代表的なモデルとして機能します。その化学組成の正確、包括的、信頼性の高い特性評価は、薬力学的材料の基礎を解明し、品質管理基準を改善するための重要な前提条件です。

超高速液体クロマトグラフィー-四重極-静電場 Orbitrap 高分解能質量分析 (UPLC-QE-Orbitrap MS) は、その卓越した分解能、感度、質量精度により、複雑な TCM システムにおける化学成分を分析するためのコア プラットフォームとして浮上しています。データ収集戦略に関しては、データ依存集録(DDA)とデータ独立集録(DIA)の2つの主流モードです2,3,4(図1)。DDAモードは、プリセットルール(前駆体イオン強度閾値、動的除外など)に基づいて、高存在量イオンのフラグメンテーションを選択的にトリガーし、構造解明を容易にするターゲットを絞った高品質のMS/MSスペクトルを生成します。ただし、低存在量イオンをカバーするには制限があります 5,6,7,8。 対照的に、DIAモードは、連続または可変ウィンドウを使用して、指定された質量電荷比範囲内のすべての前駆体イオンの非差別フラグメンテーションを実行します。理論的には、検出可能なすべてのイオンを捕捉し、検出の幅と再現性を大幅に向上させ、特にノンターゲットグローバル分析に適していますが、結果として得られる混合MS/MSスペクトルは解釈がより複雑になります5,9。

現在、DDAおよびDIA技術はTCM分析に個別に適用されていますが、同じ複雑なTCMフォーミュラシステム(Huaihua Powderなど)内の同定幅(特に低存在量成分の場合)、MS/MSスペクトル品質、検出感度などのコア性能指標に関する体系的で実証的な比較研究は依然として不十分です。複雑なTCMマトリックスにおけるこれら2つのモードの適用可能なシナリオ、利点、および制限を明確にすることは、研究者が特定の実験目的に基づいて戦略選択を最適化するために重要です10。

このプロトコルの適用可能性について読者を導くために、主要なパラメーターと制限事項をここに要約します。この方法は、フラボノイドとアルカロイドを含むシステムに最適化されたパラメーターを使用して、複雑なハーブマトリックスのプロファイリングに非常に効果的です。臨界 DIA 変数ウィンドウは、経験的テストの後、30 m/z に設定されました。このパラメータは、異なる物理化学的特性を持つサンプルに合わせて調整する必要があります。このメソッドは、低存在量イオン(ピーク面積~105)を確実に検出しますが、データ品質を確保するには、別々の正イオン化モードと負イオン化モードで取得する必要があります。主な制限は、DIAがスペクトルライブラリと信頼性の高い識別のための高度なデコンボリューションソフトウェアに依存していることであり、これは計算リソースの要件に影響を与えます。

したがって、この研究は、古典的なフォーミュラ Huaihua Powder をケーススタディとして使用して、UPLC-QE-Orbitrap MS プラットフォーム上の DDA および DIA スキャン モードの包括的なパフォーマンスを詳細かつ体系的に比較することを目的としています。Huaihua Powder分析に合わせた最適化されたDDAおよびDIAスキャン方法が開発されます。データ処理は、Compound Discoverer ソフトウェアを使用して実行され、次の次元で 2 つのモードを評価および比較します。(2)取得したMS / MSスペクトルの品質。(3)代表的な化合物のピーク面積と保持時間の再現性。4)低存在量の有効成分の検出感度。この研究は、複雑なTCMシステムの研究において高分解能質量分析スキャンモードを選択するための確かな実験的証拠とデータサポートを提供し、「幅と深さのバランス」を達成し、TCMの近代化を進めるためのDDAとDIAの補完的な利点の可能性を探ることが期待されています。

実験中、DIA取得モードにおけるセグメント変数ウィンドウのパラメータ設定については、30m/zに設定することを推奨します。同時に、プラスイオンとマイナスイオンを別々に収集する効果が優れています。

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プロトコル

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この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 淮化粉末試験液の調製

  1. 中国薬局方2020年版(第I部)の「ソフォラの花炒め」の加工基準に従って、原来のソフォラの花の材料を適量取り、不純物や枝を取り除き、灰や破片をふるいにかけ、熱した鍋に入れ、弱火(100°C)で濃い黄色になるまで炒めます。取り出して冷まします。
  2. Platycladus orientalisの葉の加工品は、中国薬局方(パートIV)の2020年版の「0213調製の一般規則」に従って調製します。Platycladus orientalisの葉を適量取り、不純物を取り除き、熱したフライパンに入れ、弱火(100°C)で黄色になるまで炒めます。取り出して冷まします。
  3. 中国薬局方 2020 年版 (パート I) の「ふすま炒め Fructus Aurantii」の方法に従って、Zhike の加工品を準備します。ジケ原料を適量取り、不純物を取り除き、100°Cに加熱し、適量の麦ふすまを1:10(材料と賦形剤)の割合で振りかけます。
    1. 煙が立ち上ったら、生のジケスライスを加えてさっと炒めます。表面が黄色または濃い黄色に変わったら取り除き、ふすまをふるいにかけ、冷まして取っておきます。
  4. Chinese Medical Formulology (New Century 3rd Edition) の 1:1:1:1 重量比の処方に従って Huaihua Powder を準備します。各ハーブパウダー1gを正確に計量します(5番ふるいでふるいにかけます)。
    1. 粉末を乳鉢で混ぜ合わせ、漢方薬粉末の「粉砕混合法」に従って混合します:10分間、一方向に穏やかかつ一貫して粉砕します。
    2. 目に見える縞模様、凝集物、色の変化が観察されない場合、粉末が均一に混合され、混合物全体にわたって均一な外観が得られると考えてください。この方法を使用して、最終的な淮化粉末サンプルを調製します。
  5. 標準化された目視検査プロトコルを使用して混合の均一性を評価します。白い背景に対して一貫した照明条件下で粉末混合物を調べます。
    注:混合物が均質であると見なすのは、次の基準をすべて満たしている場合にのみです。全体的に均一な色で、個々の成分の縞や斑点が目に見えることのない。粗い発散や細かい発散のない一貫したテクスチャー。複数のポイントからサンプリングした場合、色合いに明らかな変化はありません。綿密な検査で検出できる凝集した粒状の塊はありません。この評価は、一貫性を確保するために、2 人の独立したアナリストによって実行されます。
  6. よく混合された Huaihua Powder サンプルの 0.1 g を正確に計量します。サンプルを10 mLのメスフラスコに移します。メタノール8mLを加えます。
  7. 500 Wの出力と40 kHzの周波数で60分間超音波抽出を実行します。室温まで冷まします。メタノールでマークまでボリュームを補います。
    1. よく振とうして、最終濃度 10 mg/mL の Huaihua Powder 抽出物を得る。0.22 μmの微多孔質膜(PVDF)でろ過します。濾液をテスト用のサンプルバイアルに移します。
      注:実験中、有機廃液およびその他の関連する有毒および有害試薬が分類され、ラベルが付けられました。そして、2週間ごとに、成都中医薬大学の資産実験管理室のスタッフが、統一されたリサイクルと処理のために資格のある機関に輸送します。

2. UPLC-Q-Orbitrap HRMSの検出条件

  1. クロマトグラフィーシステムパラメータ設定
    1. C18カラム(3.0 mm×100 mm、2.6 μm)を使用します。カラム温度を30°Cに維持します。 移動相 A(0.1 % ギ酸水溶液)と移動相 B(アセトニトリル)を使用します。
    2. 勾配を次のようにプログラムします:0〜10分、5%〜20%B。10-25分、20%-50%B;25〜40分、50%〜95%B;40-45分、95%B.流量を0.3 mL/分に設定します。サンプルを5 μL注入します。
  2. 以下のパラメータ設定で質量分析研究を行います。
    注:イオン源:加熱エレクトロスプレーイオン化(H-ESI);スキャンモード:DDA取得モードでは、正イオンと負イオンの両方を同時に取得します。DIA取得モードでは、正イオンと負イオンを別々に取得します。イオン源パラメータ:スプレー電圧+3.5kV(正イオン)/-2.8kV(負イオン);シース気流速度40 arb;補助気流速度 10 arb;吹き気体速度1 arb;イオン透過管温度:320°C;蒸発温度:350°C;SレンズRFレベル:55%。
    1. データ依存集録(DDA)法の構築と最適化
      1. フルMSスキャン(フルMS)の場合は、次の設定を選択します。
        注: 解像度: 35,000;スキャン範囲:100-1000 m / z;自動ゲイン制御 (AGC) ターゲット: 3e6;最大注入時間(最大IT):100ミリ秒。
      2. データ依存MS/MSスキャン(dd-MS2)で、次の設定を選択します。
        1. 分子イオンの選択では、強度しきい値を5e4に維持します。非荷電イオンと同位体ピークを除外します(同位体除外を有効にします)。高強度イオンの繰り返し選択を防ぐために、15秒の除外時間と±10 ppmの質量許容差で動的除外を適用します。
        2. フラグメンテーション設定では、次の状態を維持します。分離ウィンドウ: 1.0 m/z;フラグメンテーション法:高エネルギー衝突解離(HCD);正規化衝突エネルギー(NCE):20、40、60 V;二次解像度:17,500;AGCターゲット:1e5;最大IT:50ミリ秒;TopN戦略:各スキャンサイクルでフラグメンテーションの強度が最も高い上位3つの分子イオンを選択します。
    2. DIA法の構築と最適化
      1. フルMSスキャンの場合は、DDAメソッドと同じパラメータを使用します。
      2. データに依存しないMS/MSスキャン(DIA-MS/MS)では、セグメント化された可変分離ウィンドウ戦略を確立します。
      3. 目標範囲を100〜1000 m / zとして定義します。最適化されたクロマトグラフィー条件下で、高品質のDDAスペクトルを使用して、m/z範囲全体にわたるイオン存在量分布に基づいてウィンドウを分割します。可変ウィンドウを設定して、セグメント間の総イオン存在量のバランスをとり、飽和や不足を回避します。
      4. 30ウィンドウに最適化して、カバレッジとサイクルタイムのバランスをとります。
        注:フラグメンテーション設定 - フラグメンテーション方法:HCD;NCE:20、40、60 V;解像度: 17,500;AGCターゲット:1e6;最大IT:自動;セグメント化された可変ウィンドウ:30 m / z。ループ数: 30。
      5. 各分離ウィンドウセグメントの中心分子量(例:m / z 115、145、175、205 ...925, 955, 985.
    3. データ収集プロセス
      1. システム平衡化:クロマトグラフィーカラムを移動相で少なくとも 5 分間平衡化します。
      2. 実験前サンプルの実行: 調製手順に従って Huaihua Powder 試験溶液を調製します。5つの連続したサンプルを注入します。システムの安定性を評価します(保持時間RSD<2%、総イオン電流強度RSD<5%)。
      3. ブランク実行:メタノールブランク溶液を注入してバックグラウンド減算を行います。
      4. Huaihua Powderサンプルの実行:ランダムな順序で注入によって各サンプルを分析します。スキャンモード(DDA、DIA)ごとにすべてのサンプルを個別に実行します。
    4. データ処理
      1. 化合物の同定
        1. 質量分析で取得した生データをCompound Discovererソフトウェアにインポートします。不明なコンポーネントの識別ワークフローを確立します。ピーク処理とピークアライメントを実行します。測定されたMS/MSスペクトルをmzCloudオンラインMS/MSデータベースおよびmzVaultローカルMS/MSデータベースと照合します。
        2. 次のフィルタリングパラメータを適用します:ピーク面積しきい値105、一次イオンと二次イオンの両方で質量偏差±5 ppm、およびマッチングスコア≥80。ろ過されたイオンをデータベース、参照標準、関連文献からの化合物情報と比較して、化学成分を特定します。
        3. Compound Discoverer ソフトウェアでの特定の操作:新しい分析プロセスを作成し、 Stats Online および Local Database Searchers ワークフローで Natural Product/Natural Product Unknown ID を選択します。
        4. ピークの同定と抽出のために、化合物の検出ノードが含まれていることを確認します。Search mzCloud データベースと Search mzVault データベースをワークフローに追加します。
        5. 生データファイルを追加し、フィルタリングパラメータを設定します(ピーク面積しきい値105、一次イオンと二次イオンの両方で質量偏差±5 ppm)。[ 実行 ] をクリックして分析を実行します。
      2. 関連指標の比較分析
        1. 同定量:DDAモードとDIAモードの両方について、正イオンモードと負イオンモードで同定された化合物の総数を比較します。各モードのイオン分布マップを構築します。
        2. 再現性研究:DDAモードとDIAモード(n = 5)の間で、存在量(ルチン、ケルシトリン)、中存在量(ネオヘスペリジン、ナリンギン)、および存在量(トリメチルコルヒシン酸)の代表的な化合物の保持時間(RT)とピーク面積(AA)の差を比較します。
        3. MS/MSスペクトル品質:Q-Markerのキー化合物であるプルゴンのMS/MSフラグメントイオンスペクトルの品質をDDAおよびDIAモードで評価します。
        4. 低存在量成分の検出:DDAモードとDIAモード5での代表的な低存在量化合物(カルボン、アデノシン)のMS/MSフラグメントの検出を比較します。

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結果

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化合物の全体的な同定

2 つの取り込みモードでの Huaihua Powder の総イオン電流クロマトグラムを図 2 に示し、全体的な差は最小限です。DDA取得モードでは、ポジティブイオンモードとマイナスイオンモードの両方で合計14,958の化合物が同定され、DIA取得モードで9,489の化合物が同定されました(図3A)。このうち、DIAモードでの高いマッチングスコア(≥80)を持つ化合物の割合は、DDAモード(DDA:6.50%;直径:10.63%)(図3B)。正イオンモードと負イオンモードにおけるDDAとDIAのイオン分布図を図3C-F

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ディスカッション

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この研究では、DIA取得モードでは、セグメント化された変数ウィンドウの値設定が大きすぎてはならないことがわかったことは特に言及する価値があります。300mzと100mzに設定しようとしましたが、最終的なスペクトル効果は悪かったです。検討と試みを繰り返した結果、最終的に 30mz の取得ウィンドウが最も適しているものとして選択しました。したがって、取得ウィンドウの設定は、実験の成否に決定的な影響を与えます。

同時に、DIAモードでの正イオンと負イオンの分離および同時取得が実験結果に及ぼす影響について、事前実験も実施されました。プラスイオンとマイナスイオンを一緒にスキャンすると、全体的なスペクトルの品質と分解能が低下します。主な理由は、サイクルタイムが長すぎて、各モードで第1レベルのスペクトルが少なすぎることです。それに対応して、化合物のクロマトグラフィーピークポイントの数も減少し、試験要件を満たせなくなります。したがって、正イオンと負イオンを別々にスキャンすることを選択しました。

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開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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本研究は、四川省自然科学財団の青少年基金 (No.2025ZNSFSC1823) によって財政的に支援されました。四川省科学技術革新苗木プロジェクト(MZGC20230055);成都中医薬大学「Xinglin Scholars」保育才能特別プロジェクトのための分野人材研究促進プログラム(MPRC2022017)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトニ トリルサーモフィッシャー/クロマトグラフィー純度
Compound Discoverer 3.3ソフトウェアサーモフィッシャー/質量分析データ処理と化合物同定
フルクタス・アウランティ四川省内江省220709淮化粉末の処方に含まれるハーブ
Platycladus orientalisの葉山東臨沂240619淮化粉末の処方に含まれるハーブ
シゾネペタスパイク江蘇省台州240601淮化粉末の処方に含まれるハーブ
ソフォラの花四川広安241017淮化粉末の処方に含まれるハーブ
超音波洗浄機Jietuo超音波洗浄装置株式会社240HT型淮化粉末の成分抽出
UPLC-Q-Orbitrap HRMSサーモフィッシャー/高分解能質量分析計
水ワトソンズ・カンパニー/超純水

参考文献

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  1. Wang, D., et al. Establishment of fingerprint and chemical composition study of the classic formula Huaihua San based on two mass spectrometry techniques. Chin Herb Med. 56 (10), 3499-3512 (2025).
  2. Stincone, P., et al. Evaluation of data-dependent MS/MS acquisition parameters for non-targeted metabolomics and molecular networking of environmental samples: Focus on the Q Exactive platform. Anal Chem. 95 (34), 12673-12682 (2023).
  3. Guo, J., Huan, T. Comparison of fullscan, datadependent, and dataindependent acquisition modes in liquid chromatographymass spectrometry based untargeted metabolomics. Anal Chem. 92 (12), 8072-8080 (2020).
  4. FernándezCosta, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  5. Wang, H. D., et al. A novel hybrid scan approach enabling the ionmobility separation and the alternate datadependent and dataindependent acquisitions (HDDIDDA): Its combination with offline two-dimensional liquid chromatography for comprehensively characterizing the multicomponents from Compound Danshen Dripping Pill. Anal Chim Acta. 1193, 339320(2022).
  6. El Boudlali, H., et al. High-resolution accuratemass spectrometry-baseduntargeted metabolomics: Reproducibility and detection power across data-dependent acquisition, dataindependent acquisition, and AcquireX. Comput Struct Biotechnol J. 27, 2412-2423 (2025).
  7. Guo, J., Shen, S., Xing, S., Huan, T. DaDIA: Hybridizing data-dependent and data-independent acquisition modes for generating high-quality metabolomic data. Anal Chem. 93 (4), 2669-2677 (2021).
  8. Wu, Y., Wang, Y. A comparative study of dataindependent acquisition and datadependent acquisition in liquid chromatographymass spectrometrybased untargeted metabolomics analysis of Panax genus sample. Anal Bioanal Chem. 417 (14), 3215-3228 (2025).
  9. Barkovits, K., et al. Reproducibility, specificity, and accuracy of relative quantification using spectral library-based data-independent acquisition. Mol Cell Proteomics. 19 (1), 181-197 (2020).
  10. Barbier Saint Hilaire, P., et al. Comparative evaluation of data-dependent and data-independent acquisition workflows implemented on an Orbitrap Fusion for untargeted metabolomics. Metabolites. 10 (4), 158(2020).
  11. Zheng, R. L., et al. Screening and extraction process optimization for potential α-glucosidase inhibitors from quinoa seeds. Food Med Homol. 1, 9420004(2024).
  12. Cao, Z. X., et al. Analysis and comparison of staminate flowers components in five Chinese walnut varieties. Food Med Homol. 1, 9420005(2024).
  13. Zhou, J. W., et al. Anti-virulence potential of carvone against Serratia marcescens. Food Med Homol. 1, 9420001(2024).
  14. Tabb, D. L., et al. Interrogating dataindependent acquisition LCMS/MS for affinity proteomics. J Proteins Proteom. 15 (3), 281-298 (2024).
  15. Wartmann, Y., Boxler, M. I., Kraemer, T., Steuer, A. E. Impact of three different peak picking software tools on the quality of untargeted metabolomics data. J Pharm Biomed Anal. 248, 116302(2024).
  16. Bilbao, A., et al. Processing strategies and software solutions for data-independent acquisition in mass spectrometry. Proteomics. 15 (56), 964-980 (2015).
  17. Guan, S., Taylor, P. P., Han, Z., Moran, M. F., Ma, B. Data-dependentindependent acquisition (DDIA) proteomics. J Proteome Res. 19 (8), 3230-3237 (2020).

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