このプロトコルは、壊死性腸炎(NEC)の新生児マウスモデルと、その後の新生児マウス小腸からの固有層免疫細胞の単離の概要を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
壊死性腸炎 (NEC) は、新生児腸の重度の炎症性疾患であり、主に早産児に影響を及ぼします。NEC は、上皮損傷、微生物の腸内細菌叢の異常、および免疫応答の調節不全を特徴とし、多くの場合、腸の壊死や全身性炎症を引き起こします。ヒトの病気の重要な側面を要約する実験的なマウスモデルは、病気を引き起こし、治療法の開発に情報を提供するメカニズムの理解を進める上で不可欠でした。このプロトコルは、粉ミルク、断続的低酸素症、リポ多糖類(LPS)の経口投与、およびNECの乳児から培養した腸内細菌を利用した壊死性腸炎(NEC)の確立された新生児マウスモデルを記述しています。この組み合わせは、ヒト乳児のNECと一致する組織学的、転写的、免疫学的特徴を確実に誘導し、この分野における複数の重要な発見の基礎となっています。さらに、このプロトコルは、新生児マウスの小腸固有層からの免疫細胞の単離を記述する。固有層細胞単離により、フローサイトメトリー による 詳細な免疫細胞プロファイリングが可能になり、腸内の自然細胞集団と適応細胞集団の両方の分析が容易になります。
概要
壊死性腸炎 (NEC) は、ほぼ独占的に未熟児に影響を与える重度の腸の炎症性疾患です。超低出生体重児 (<1500 g) の約 7%-8% が NEC の影響を受け、外科的介入を必要とする新生児では、この疾患に関連する死亡率が 50% に近づく可能性があります1。NEC の病因は完全には理解されていません。しかし、現在の証拠は、NEC が未熟な腸バリア、調節不全の免疫シグナル伝達、および生物異常マイクロバイオーム 2,3,4 などの複数の要因の合流から生じることを示唆しています。これらの因子の収束は、特にトール様受容体 4 (TLR4) の活性化を通じて、腸内の炎症反応を開始および悪化させ、上皮損傷とアポトーシスや壊死を含むさまざまな種類の細胞死を引き起こす可能性があります 5,6。このプロトコルの目的は、ヒト新生児に観察される腸の炎症と腸の気腫症(腸壁内のガス)を要約し、疾患の病因のメカニズムの調査を可能にする、再現性があり生理学的に関連するNECのマウスモデルを提示することです。さらに、このプロトコルは、新生児マウスの小腸固有層からの免疫細胞の単離を記述しており、研究者はフローサイトメトリーを介して免疫細胞プロファイリングを実行できます。
新生ラットや子豚などの大規模な動物モデルと比較して7,8、新生マウスモデルには、低コスト、トランスジェニック動物へのアクセスの増加、より大きなコホートで実験を実行できることなど、いくつかの明確な利点があります。マウスNECモデルは、主に粉ミルクの摂食、寒冷ストレス、および低酸素症の組み合わせを利用して、ヒト患者で観察されるNECの複雑な病態生理学をシミュレートします7,8,9。しかし、NEC の多くのマウス モデルは、広範な微生物ストレッサーまたは微生物叢の人為的な変化への依存によって制限されており、臨床的関連性が損なわれる可能性があります。対照的に、このプロトコルに記載されているモデルは、ヒト乳児のNEC病因に関与するいくつかの重要な要因を統合することにより、これらの制限を克服します10,11。具体的には、このモデルは、腸のバリアの完全性を破壊することに関与している低酸素ストレス 3,12 と、腸の炎症を誘発する十分に特徴付けられた TLR4 リガンドであるリポ多糖類 (LPS) を添加した乳児用調製粉乳の経口投与、および臨床的に関連する腸内細菌異常マイクロバイオームを組み合わせたものです。腸の汎壊死を特徴とする最も重篤な形態の疾患10,13。これらの臨床的に関連する疾患特異的なストレッサーを統合することにより、私たちのモデルは NEC の臨床的および分子的特徴を正確に反映します。さらに、NEC 病因の根底にある免疫介在メカニズムを調査するためのフレームワークを研究者に提供するために、このプロトコルは、フローサイトメトリー分析のために新生児マウス小腸から固有層細胞を単離することを概説します。腸粘膜免疫活性の主要な部位として、固有層には、NEC 関連炎症で中心的な役割を果たす常在免疫細胞と浸潤免疫細胞の動的なレパートリーが含まれています14。フローサイトメトリーは、これらの免疫細胞集団を高分解能で特徴付けるための堅牢でスケーラブルなプラットフォームを提供し、細胞表現型の詳細な分析、免疫応答の定量化、およびNECの病因に関与する免疫学的シグネチャの同定を可能にします15。
このプロトコルで概説されているマウスNECモデルは、新生児腸の複雑な環境内での宿主とマイクロバイオームの相互作用、免疫応答、および炎症シグナル伝達の研究を可能にすることにより、 in vitro モデルを補完します。これは、 in vitro ではモデル化できない NEC 病因の重要な側面を再現するため、疾患メカニズムを解明し、治療戦略を評価するための貴重なツールとなります。種固有の違いは依然として制限ですが、このモデルは、NEC の理解を深め、的を絞った介入の開発を加速するための堅牢でアクセスしやすいプラットフォームを提供します。
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プロトコル
すべての方法は、ノースカロライナ大学チャペルヒル医学部の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって提供された倫理ガイドラインに従って実施されました。マウスは、ノースカロライナ大学チャペルヒル医学部のIACUC(プロトコル番号24-114)によって承認された研究提案に基づいて、実験動物のケアと使用のためのガイドに記載されている手順に従って飼育、維持、および飼育されました。C57BL/6Jマウスを、本研究で記載したすべての実験に使用した。子犬は生後4日目にモデルで開始され、体重は1.8〜2.3gでした。この体重範囲外の動物は除外されました。実験コホートはバランスの取れた性分布をしており、オスとメスがそれぞれ治療動物の約50%を占めていました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。
1. マウスNECモデル
注: 腸内細菌ストックは、最も重度の NEC を患った乳児から腸内内容物を得ることによって生成されます (NEC 合計は13,16)。腸溶内容物を1 x gで37°Cで16時間一晩培養し、3000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、50%グリセロールに再懸濁します。20 μLのアリコートをクライオバイアルにピペッティングし、長期保存のために-80°Cで保存します。このプロトコルで選択された培養時間は、ワークフローの効率のために選択されました。これらの時点は、モデル全体に影響を与えることなく、個々のラボのスケジュールに合わせて必要に応じて調整できます。さらに、このプロトコルは最大容量 40 匹のマウスに最適化されていますが、必要に応じてスケールアップできます。
- 細菌培養の準備
- 実験0日目の15:00に、 NECトータルの 乳児から培養した腸内細菌の20 μLアリコートを、2 mLのLuria-Bertani(LB)ブロスを含む15 mL培養チューブに加えます。細菌培養物をチューブの蓋を通気位置に置いて、オービタルシェーカーで37°C、1 x g、16時間一晩インキュベートし、LB汚染を評価するための対照として、2 mLのLBブロスのみを含む培養チューブを同時にインキュベートします。
- 細菌培養と透明なLBのみの対照の濁度を比較することにより、一晩の培養を視覚的に確認します。細菌培養が濁っているように見え、コントロールが明確なままである場合にのみ続行してください。
- 実験1日目の07:00に、接種した一晩培養物125 μLを、25 mLのLBブロスを含む通気蓋付きのT75細胞培養フラスコに分注します。合計4つのT75フラスコを調製し、37°C、1 x gのオービタルシェーカーで直立した位置で2時間インキュベートして、細菌培養を増殖させます。
注:一晩培養は、NECモデルの実験0、1、および2日目に調製されます。
- 実験0日目の15:00に、 NECトータルの 乳児から培養した腸内細菌の20 μLアリコートを、2 mLのLuria-Bertani(LB)ブロスを含む15 mL培養チューブに加えます。細菌培養物をチューブの蓋を通気位置に置いて、オービタルシェーカーで37°C、1 x g、16時間一晩インキュベートし、LB汚染を評価するための対照として、2 mLのLBブロスのみを含む培養チューブを同時にインキュベートします。
- 実験グループへの子犬の割り当て
- 実験 1 日目の 07:00 に、生後 4 日目の子犬の体重を測定します。
注:最適な重量範囲は1.8〜2.3 gであり、外れ値は実験から取り除く必要があります。 - 実験マウスを粉ミルクで育てられたコホートとダムで育てたコホートにグループ化し、粉ミルクで育てられたマウスの平均体重を計算します。指定された粉ミルクで育てられたマウスをダムから分離し、37°Cに予熱した乳児保育器に収容された新しいケージに入れます。 ダムで餌を与えられた子犬は、ダムのある元のケージに保管してください。
注:新生マウスは、周囲温度の変化に特に敏感です。ダムから分離した後も一貫した温度調節を維持するために、粉ミルクで育てられた子犬は、37°Cに設定された温度管理された乳児保育器に保管されます。 このアプローチは、追加の温熱介入を使用せずに生理学的温度を維持する確立されたNECプロトコルと一致しています11、17、18、19。 - 実験2日目と3日目に繰り返し、粉ミルクで給餌されたマウスの体重を量り、毎日07:00の給餌時点より前の平均体重を計算します。
- 実験 1 日目の 07:00 に、生後 4 日目の子犬の体重を測定します。
- 細菌培養の光学密度(OD)の測定
- 37°Cおよび1 x gで2時間インキュベートした後、実験1、2、および3日目に拡張培養を含む4つのT75フラスコをオービタルシェーカーから取り出します。4つのT75フラスコの内容物を混ぜ合わせ、よく混ぜ、1 mLの細菌培養物をキュベットにピペットで入れます。
- キュベットに滅菌LBブロス1 mLを加えてブランク溶液を調製します。分光光度計で600nm(OD600nm)で細菌培養物の光学密度を測定します。
注:ターゲットOD600nm は0.6±0.02です。細菌培養のOD600nm が目標値を下回っている場合は、手順1.3.1で説明したようにインキュベーションを続行します。0.6 ± 0.02 の目標外径600nm に達するまで。OD600nm が0.6を超える場合は、細菌培養物を滅菌LBブロスで希釈します。
- キュベットに滅菌LBブロス1 mLを加えてブランク溶液を調製します。分光光度計で600nm(OD600nm)で細菌培養物の光学密度を測定します。
- 80 mLの細菌培養物を2本の50 mL遠心チューブに移し、3000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 各チューブの底にペレットが見えるかどうかを確認して、培養が成功したことを確認します。
- 37°Cおよび1 x gで2時間インキュベートした後、実験1、2、および3日目に拡張培養を含む4つのT75フラスコをオービタルシェーカーから取り出します。4つのT75フラスコの内容物を混ぜ合わせ、よく混ぜ、1 mLの細菌培養物をキュベットにピペットで入れます。
- フォーミュラの準備
- 実験1日目、2日目、3日目に09:00に粉ミルクの準備を開始します。16 mLの乳児用調製粉乳と8 mLの子犬用ミルクを2:1の比率で、滅菌50 mL遠心分離管に入れます。
- ペレット状の細菌培養物を含む2本の50 mL遠心分離管から上清を取り除きます(ステップ1.3.2)。
- 2つのペレットのそれぞれを2 mLのフォーミュラミックスに完全に再懸濁し、再懸濁液をフォーミュラミックスに移して、24 mLのNECフォーミュラを作ります。
注:NECフォーミュラの最終的な細菌濃度は、4〜5 x 109 CFU / mLでなければなりません。 - 6つの供給時点(10:00、13:00、16:00、19:00、22:00、07:00)のそれぞれに6本の50 mL遠心分離管にラベルを付けます。
- NECフォーミュラ4 mLを各標識チューブにピペットで入れます。
- LPS(5 mg/mL)ストックの6つのシングルユースアリコートを調製し、-20°Cの低結合マイクロチューブに保存します。 各時点で給餌する直前に、LPS(濃度については注を参照)をNECフォーミュラに追加します。
注:NECフォーミュラに追加されるLPSの量は、子犬の体重1グラムあたり5μgのLPSの投与量を使用して、毎日07:00に計算された粉ミルクで給餌された子犬の平均体重に基づいています。最終的なLPS濃度は体重によって異なります。たとえば、給餌量が80 μL、子犬コホートの平均体重が2グラムの場合、式中のLPS濃度は0.125 mg / mLになります。
- 摂食
注:実験1日目に、NECモデルに配置されるマウスをダムから分離した後、3時間絶食します。最初のNEC粉ミルクの給餌は10:00で、22:00まで3時間ごとに続きます。実験2日目と3日目に、マウスは07:00、10:00、13:00、16:00、19:00、22:00に給餌されます。マウスは実験4日目に給餌されません。- マウスに給餌する直前に、LPSの1アリコートを解凍し、15秒間渦巻きさせます。マウスの平均体重に基づいて適切な量のLPSを、調製したNECフォーミュラの4 mLチューブ(計算についてはステップ1.4.6を参照)に加え、ピペッティングで十分に混合します。
- 1 mLのシリンジにNECフォーミュラを充填し、新生児末梢挿入中心カテーテル(PICC)ラインを取り付けます。シリンジまたはPICCラインに気泡や空気がないことを確認してください。
- PICCラインによる経口強制投与 を介して 子犬にNEC処方を投与します。
- 各子犬の首の付け根の緩んだ皮膚をそっと拘束し、マウスを直立した位置に保持します。鉗子を使用して、PICC ラインの遠位端を中咽頭と食道に誘導し、PICC ラインの先端を胃内に配置します。
注:PICCラインの挿入距離は、口角から胃のミルクスポットの上部までの距離に等しくなります。次に、油性マーカーを使用して、最適な挿入ポイントを PICC ラインに明確にマークする必要があります。 - PICCラインの挿入中に大きな抵抗を感じた場合は、PICCラインを取り外し、位置を変更し、慎重に挿入を再試行してください。
- 8 μLのNECフォーミュラをゆっくりと胃に分注し、誤嚥の兆候がないか給餌中ずっと子犬を注意深く監視します。胃分娩が成功したことを確認するために、白いミルクスポットの出現を観察します。
- PICC 回線を取り外します。子犬に呼吸困難や嘔吐がないか観察してください。子犬が粉ミルクを逆流させた場合は、糸くずの少ない実験用ワイプで口と鼻を吸い取ってください。
- 各子犬の首の付け根の緩んだ皮膚をそっと拘束し、マウスを直立した位置に保持します。鉗子を使用して、PICC ラインの遠位端を中咽頭と食道に誘導し、PICC ラインの先端を胃内に配置します。
- 給餌時点ごとにこのプロセスを繰り返します。
- 1日2回、13:00と19:00の給餌時間の直後に10分間、子犬を低酸素状態にします。
- 1日2回の給餌の後、95%の窒素と5%の酸素を含むガスタンクに接続された低酸素チャンバーに子犬を置きます。タンクバルブを開き、ハンドヘルドモニターを使用して密閉された低酸素チャンバー内の酸素レベルを監視します。低酸素チャンバーが5%±0.5%の酸素に達したら、子犬をこの酸素レベルに10分間維持します。
注:流量は、20分間にわたって安定した制御された速度で5%の酸素を2%から2%に減少させるように最適化する必要があります。
- 1日2回の給餌の後、95%の窒素と5%の酸素を含むガスタンクに接続された低酸素チャンバーに子犬を置きます。タンクバルブを開き、ハンドヘルドモニターを使用して密閉された低酸素チャンバー内の酸素レベルを監視します。低酸素チャンバーが5%±0.5%の酸素に達したら、子犬をこの酸素レベルに10分間維持します。
- 給餌の合間にマウスの子犬に、呼吸困難、青白い変色、または無呼吸の兆候がないか観察してください。これらの兆候がある場合は、影響を受けた子犬を低酸素症室から取り出し、回復を注意深く観察し、必要に応じてIACUCの方針に従って子犬を安楽死させます。
- NEC モデルの 72 時間の全期間、予定された時点で経口強制経口栄養と低酸素曝露を継続します。
注:実験1日目が月曜日の10:00に始まる場合、72時間のエンドポイントは木曜日の10:00に発生します。これはモデルの 4 日目として指定されます。マウスはモデルの4日目の07:00に給餌されず、組織収集のためにこの最後の10:00の時点で安楽死させます。
- 動物の安楽死と組織の採取
- モデルの 4 日目の朝に、各子犬の体重を量り、性別を記録し、IACUC ガイドラインに従って安楽死させます。
- 安楽死後、各子犬から血栓活性化剤とゲルを含む血清分離チューブに血液を採取します。
- 16,000 x g で 4 °C で 20 分間遠心分離して、血清を分離します。血清を標識された1.7 mLチューブにピペットで入れ、-80°Cで保存します。
- 腹壁と腹膜を通る1〜2cmの正中線切開を行い、消化管を露出させます。膨張、紅斑、腸壁内のガス蓄積(腸気腫症)、目に見える気泡など、NECの特徴がないか、露出した腸を検査します。
- 遠位直腸を通して十二指腸を特定して切除します。ティッシュを氷の上のシャーレに入れます。氷冷のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して腸をすすぎます。
- 盲腸を特定し、近位に切断して盲腸と結腸を小腸から分離します。回腸遠位部から始まり、空腸に向かって部分を切り取ります。転写分析のために、RNA溶解バッファーと1.5 mm酸化ジルコニウムビーズを含むチューブに1 cmのピースを氷上に置きます。
- 24 Gの鈍い端の針に取り付けられたPBSを含むシリンジで1.5 cmのピースを洗い流し、1 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む微量遠心チューブに入れます。1 cmの腸片をスナップフリーズし、タンパク質分析のために-80°Cで保存します。1 cmの腸片をスナップ凍結し、追加のアッセイのために-80°Cで保存します。
- ビーズビーター(5.50 m / s、1.0分、サイクル= 1.0、一時停止滞留:10秒、4°C)でRNA溶解バッファーに収集された組織をプロセスして組織を均質化し、-80°Cで保存します。
- 組織固定
- 4%PFAで収集した組織片を4°Cのロッカーに置き、24時間固定します。24時間後、各チューブから4%PFAを除去し、1 mL PBSと交換して組織を洗浄します。チューブを4°Cで15分間ロッカーに戻します。PBS洗浄を1回繰り返します。
- PBSを取り出し、各チューブに1 mLの50%エタノールを加え、チューブを4°Cで15分間ロッカーに戻します。50%エタノールを除去し、1 mLの70%エタノールを加え、組織がパラフィン組織学ブロックに処理できるようになるまで4°Cで保存します。
注:さらなる分析のために、必要に応じて追加の腸セグメントまたは便サンプルを収集することができます。
- PBSを取り出し、各チューブに1 mLの50%エタノールを加え、チューブを4°Cで15分間ロッカーに戻します。50%エタノールを除去し、1 mLの70%エタノールを加え、組織がパラフィン組織学ブロックに処理できるようになるまで4°Cで保存します。
- 4%PFAで収集した組織片を4°Cのロッカーに置き、24時間固定します。24時間後、各チューブから4%PFAを除去し、1 mL PBSと交換して組織を洗浄します。チューブを4°Cで15分間ロッカーに戻します。PBS洗浄を1回繰り返します。
2.固有層免疫細胞の分離
注:このプロトコルは、約1週間齢の新生マウスから固有層細胞を単離するために最適化されています。スペクトルフローサイトメトリーに参照サンプルが必要な場合は、離乳(生後3〜4週)を使用できます。離乳サンプルの場合は、プロトコルで指定されたすべての試薬量を2倍にします。
- 試薬の調製
- 10mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)を含むCa2+ およびMg2+ を含まないハンク平衡塩溶液1xを調製し、室温で保存します。
- 5%ウシ血清アルブミン(BSA)をPBS + 5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)に溶解し、4°Cで保存することにより、蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを調製します。
- 固有層細胞単離を行う前日に、5mM EDTA、5%ウシ胎児血清(FBS)、および1mMジチオスレイトール(DTT)をHBSS W / Oに添加して、前消化溶液を調製します。
- Roswell Park Memorial Institute 1640培地(RPMI)に10%FBSおよびmg/mLコラゲナーゼIVを添加することにより、固有層細胞単離を行う直前に消化液を調製します。
注:HBSS W/Oは事前に調製し、室温で保存することができます。FACSバッファーは事前に調製し、4°Cで保存する必要があります。 前消化および消化溶液は、固有層分離を行う直前に新鮮に調製し、氷上に保管する必要があります。
- 消化のための腸組織の収集と準備
- 盲腸の位置を特定し、近位に横断して盲腸と結腸を除去します。遠位小腸(回腸)の2〜3 cmを切除し、シャーレ内の氷冷のHBSS W / Oの上に置きます(ステップ1.6.5から再開します)。
- 注射器に取り付けられた24Gの鈍い端の針を使用して、鉗子で組織を安定させながら、氷冷のHBSS W / Oで腸管腔を完全に洗い流します。洗い流した後、腸管腔に便がないことを目視で確認します。
- 細い鉗子またははさみを使用して、腸セグメントから残っている結合組織を慎重に取り除きます。
- 腸を縦方向に切って開き、横方向に1〜1に切ってから、cmセグメント。
- 固有層解離
- 腸セグメントを、氷上で冷却した1 mLの前消化溶液を含む1 mLの遠心分離管に移します。
- サンプルを37°Cで20分間連続回転させてインキュベートし、組織の解離を促進します。
- チューブをそっと回転させ、5 mL遠心分離管の上に置かれた10 μmのセルストレーナーに内容物を注ぎます。
注:10 μmストレーナーを通して回収された濾液には上皮内リンパ球(IEL)が含まれており、必要に応じて下流の分析に使用できます。 - 組織断片を、37°Cに予熱した消化液10 mLを含む新しい15 mL遠心分離管に移します。続いて、サンプルを37°Cで連続回転させながら40分間インキュベートします。
- サンプル全体を自動組織解離チューブに移し、時計回りと反時計回りの方向を交互に、それぞれ15秒の4回の回転サイクルからなる解離プログラムを実行します。
注:自動組織解離器の代替手段は、2つの顕微鏡スライドのつや消しチップを使用して腸組織を手動で粉砕することです。この方法を使用する場合は、細胞の生存率を大幅に低下させる可能性があるため、過度の機械的ストレスを避けるために、穏やかで均一な圧力を加えてください。 - 細胞懸濁液を穏やかにボルテックスし、組織解離チューブ内のサンプルを300× g で4°Cで5分間遠心分離します。
- ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引し、氷冷したFACSバッファーのmLで細胞を再懸濁します。
- 10 μmのセルストレーナーを5 mLの遠心分離管に置きます。再懸濁した細胞懸濁液をフィルターに移し、追加のmLの氷冷FACSバッファーでフィルターを洗浄します。
- 細胞をカウントし、トリパンブルーまたは生存率色素を使用して生存率を評価します。フローサイトメトリーに必要な容量を30 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞を下流のアプリケーションにすぐに使用して、生存率とマーカー発現を維持します。
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結果
このプロトコルに記載されている NEC の新生児マウス モデルは、この疾患の主要な特徴を再現しています。カプラン・マイヤー生存分析(図1A)は、ダム給餌対照と比較してNEC治療群の生存率の有意な減少を明らかにしました(9/21対8/8; p = 0.0063)。モデルにかけられたマウスの腸の肉眼的検査(図1B)は、腸の膨満、気泡、目に見える 腸の気腫症 (腸壁内のガスの蓄積)など、NECの特徴的な特徴を示しました。H&E染色 による 組織学的評価により、NEC様腸損傷を有する動物における絨毛破壊の斑状領域の存在と正常な腸構造の破壊がさらに確認されました。さらに、炎症遺伝子発現の分子分析により、ヒトの疾患にも関連している主要な炎症誘発性マーカーの強力なアップレギュレーションが実証されました。ダムで育てられた対照マウスと比較して、実験的NECに曝露されたマウスは、 Il1b (...
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ディスカッション
このプロトコルは、NEC の生理学的に関連する新生児マウス モデルと固有層免疫細胞単離を統合し、腸の炎症中の粘膜免疫応答を調査するための包括的なプラットフォームを提供します。このモデルは、ヒトNEC症例からの腸内マイクロバイオーム、低酸素ストレス、粉ミルク摂取などの臨床的に関連する曝露を組み合わせることにより、ヒトの疾患で観察される複雑で多因子の病因を要約します10,13。このアプローチにより、同じ腸組織からの転写分析やプロテオミクス分析とともに詳細な免疫表現型解析が可能になり、NEC の病態生理学と潜在的な治療法の評価に関する独自の洞察が得られます。ここでは、結果を最適化し、モデルの翻訳的関連性と実行の成功を最大化するために研究者が対処すべき重要な考慮事項と制限について説明します。
このプロトコルには、実験のばらつきを減らし、全体的な死亡率を減らし、サンプルの品質を向上させるために最適化が必要な可...
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開示事項
著者は、この原稿に関連する利益相反はないことを宣言します。
謝辞
この原稿は、R01DK124614、R01HD105301、DP1DK140012、Chan Zuckerberg Initiative Grant number 2022-316749、Yang Biomedical Scholar Award、およびノースカロライナ大学チャペルヒル校小児科によって支援されました。
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材料
```html
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mL Syringe-Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309659 | フォーミュラミルク投与用シリンジ |
| 1.5 mL semi-micro Disposable Cuvettes | BRAND GMBH + CO KG | 759085D | |
| 1.7 ml Microtubes Clear | Axygen - Corning Inc. | MCT-175-C | ノンパイロジェニック& Rnase-/Dnase-free |
| 5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580 | Airgas | X02NI95C2003186 | |
| Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93 | eBioscience Inc. | 14-0161-85 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93 | eBioscience Inc. | 14-0161-86 | |
| APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGc | BioLegend | 128015 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70 | BD Biosciences | 564455 | |
| BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5 | BD Biosciences | 566408 | |
| BD Microtainer SST | Becton Dickinson | 365867 | 血清チューブ |
| BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200 | Fisher Scientific | 12-111-365 | |
| BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20 | Fisher Scientific | 12-111-366 | |
| BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200 | Fisher Scientific | 12-111-362 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563795 | |
| BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8 | BD Biosciences | 751263 | |
| BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2 | BD Biosciences | 563415 | |
| C57BL/6J Neonatal Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD45-VioGreen mouse | Miltenyi Biotec | 130-102-412 | |
| CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286 | Miltenyi Biotec | 130-119-659 | |
| CFX Opus Real-Time PC Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | LS004188 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma | D9779-5g | |
| eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Life Technologies Corp. | 00-5523-00 | |
| EDTA (0.5M), pH 8.0 | Quality Biological Inc | 351-027-721 | |
| Esbilac Puppy Milk Replacer | Pet-Ag, Inc. | 99502-1 | 子犬用ミルク |
| Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mL | Fisher Scientific | 13-678-11F | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Genie Temp-Shaker 300 | USA Scientific, Inc. | SI-G1600 | |
| gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130096334 | |
| Ghost Dye Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| Glycerol ReagentPlus | Sigma-Aldrich | G7757-500ML | |
| GraphPad Prims Software, Version 10.0 | GraphPad | N/A | |
| Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent Stopper | Fisher Scientific | 07-000-212 | |
| Handi+ Oxygen analyzer | Maxtec | N/A | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Gibco | 141650-095 | |
| HEPES Buffer | Mediatech, Inc. | 25-060-CI | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenburg, Inc. | N/A | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | N/A | |
| Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cm | Fisher Scientific | 12-460-655 | |
| Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cm | Fisher Scientific | 12-460-598 | |
| Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style Forceps | Fisher Scientific | 12-460-110 | |
| Isolette Infant Incubator | Air-Shields Vickers | C100-200-2 Series 02 | マウス用インキュベーター |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L3129-10mg | |
| Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics Powder | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3451 | 1.5 ml、透明、目盛付き、滅菌済み |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONEC-W | |
| Ohaus scout portable balance | Fisher Scientific | 302530 |
参考文献
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