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方法論記事

マウス同所性肝移植における血管再建のための縫合技術

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DOI：

10.3791/69234

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2025年10月14日

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1Department of Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University

この記事について

サマリー

肝上下大静脈 (SHIVC)、門脈、肝下下大静脈 (IHIVC) を含むレシピエントの血管再建は、マウス同所性肝移植を成功させるための重要な手順です。ここでは、マウス肝移植モデルにおけるSHIVCおよびIHIVC再建のための縫合技術とヒントを提供します。

要約

臓器移植における臨床課題に対処するには、動物モデルを用いたトランスレーショナルリサーチが不可欠です。マウス同所性肝移植 (LT) は、LT 後の肝再生、虚血再灌流障害、および免疫応答のメカニズムを調査するための有用なツールですが、この手順における技術的な課題により、その実現可能性が制限されています。マウス同所性 LT を成功させるための重要な側面は、肝上下大静脈 (SHIVC)、門脈 (PV)、肝下下大静脈 (IHIVC) などのレシピエントの血管再建です。これらの血管を再建する際の技術的な困難に加えて、無肝期の時間制限が 20 分以内であるため、この手順はより困難になります。PV 再建にはカフ技術を使用できますが、無肝期に SHIVC を再建するには安全かつ迅速な縫合技術が必要です。IHIVC 再建では、カフと縫合の両方の技術が適用できますが、縫合技術はドナー手術とバックテーブルの準備における手術時間が短縮され、カフ技術よりも大きな血管内腔を維持できます。ここでは、マウス同所性LTを促進するために縫合技術を使用したSHIVCおよびIHIVC再建のガイドラインを提供します。

概要

手術技術、免疫抑制薬、集中治療医療の進歩により、臓器移植は末期臓器疾患の標準治療として確立されています。肝移植 (LT) は現在、末期肝疾患および特定の肝悪性腫瘍に対する唯一の治癒的治療法です。LTの臨床課題に対処するには、動物モデルを用いたトランスレーショナルリサーチが不可欠です。マウスモデルではさまざまな遺伝子組み換え動物が利用できるため、マウス同所性LTは、肝再生、虚血再灌流障害、およびLT1後の免疫応答に関するメカニズムの洞察を探求するための重要なツールです。ただし、この手順の技術的課題により実現可能性が制限されるため、このモデルに取り組んでいる研究グループは制限されています 2,3,4,5,6,7,8,9,10。

マウス同所性LTは、1991年にQianらによって最初に記述されました2。ラットに同所性 LT 技術を適用して開発された外科的処置は、ドナー手術、肝移植片のバックテーブル準備、およびレシピエント手術の 3 つのステップで構成されます6。マウス LT の技術的に困難な部分は、肝上下大静脈 (SHIVC)、門脈 (PV)、および肝下下大静脈 (IHIVC) を含むレシピエントの胆道および血管再建です。外科的手技に加えて、クランプからPVフローの解放までの無肝段階は、マウス同所性LT 2,6,11を成功させるために20分以内にする必要があります。さらに、私たちの経験では、マウス LT で長期生存を達成するには、PV クランプから IHIVC 放出までの総再灌流時間は 30 分以内である必要があります。これは、不安定な全身血行動態状態の好ましい時間を約 30 分以内と記載したラット LT の以前の報告と一致しています12。したがって、マウスLTの技術的な困難と時間制限により、この手順はより困難になります。

カフ技術は PV 再建に使用できますが、無肝期に SHIVC を再建するには縫合技術が必要です。したがって、SHIVC 吻合には安全かつ迅速な縫合技術が不可欠です。カフと縫合技術の両方が IHIVC 再建に適用できますが、これまでのほとんどの研究ではカフ技術5、6、7、11、13 が採用されていました。ただし、IHIVC 再建でカフ技術を使用すると、ドナーおよびバックテーブル手術の手術時間が長くなります。さらに、レシピエント下大静脈(IVC)13のマージンが短いため、初心者にとってカフの挿入は縫合よりも難しい場合があります。

ここでは、マウス同所性LTにおける縫合技術を用いたSHIVCおよびIHIVC再建を成功させるためのガイドラインを提供します。

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プロトコル

動物実験はすべて京都大学動物実験委員会の承認を受け、京都大学動物保護ガイドラインに従って実施されました。マウスの手術は、全身麻酔下でイソフルラン吸入を使用して行われました。気化器を 3% イソフルランと 1 L/min 酸素に設定して麻酔を誘発しました。開腹術後、麻酔を維持するためにイソフルランを 1% に減らしました。このプロトコルで使用される顕微手術ツールは、以前に公開された血管再建プロトコル13 で使用されたものを含め、 材料表にリストされています。マウス同所性LT13を実行するには顕微鏡が必要でした。マウスの体温を維持するために加熱パッドが使用されました13。

1. 動物

  1. 重さ25〜30gのマウスを使用してください。
    注:体重20〜35 gのマウスを使用できますが、約25 gのマウスがドナーとレシピエントの両方に適しています。年齢と脂肪肝はLTの結果に影響を与えるため、実験の目的ごとに適切なマウスを選択する必要があります。

2. ドナー肝臓におけるIHIVCの解剖

  1. IHIVCを周囲の組織から分離します。必要に応じて、電気焼灼で腰静脈を密閉します。
  2. IHIVCから脂肪を取り除き、血管壁を露出させます。
  3. 右腎動脈と静脈の上のIHIVCを解剖します(図1)。
    注: IHIVC 再建に縫合技術を使用する場合、ドナー部位の右腎静脈の解剖は不要です。IHIVC 再建に縫合技術を適用する場合、ドナー手術には通常 30 分もかかりません。

3. ドナー肝臓におけるSHIVCの解剖

  1. PVからの貯蔵液を灌流した後、SHIVCの前壁と後壁を切断します(図1)。
    注:横隔膜CRUからSHIVC後壁を分離することは、再建のための十分なマージンを得るために重要です。

4.肝移植片のバックテーブル準備

  1. 前述のように、PVにカフを取り付けます13。
  2. クランプ・クリップをIHIVCに取り付けます。
  3. 肝臓を逆さまにして、SHIVCの断端を露出させます。
  4. SHIVCの両端に10-0ナイロンのステー縫合糸を置き、ブルドッグクランプで保持します。
    注:バックテーブルの準備には、IHIVCへのカフアタッチメントなしで約10分かかります。

5. レシピエントにおけるSHIVCの再構築

  1. SHIVCを4-0シルクで囲み、肝臓を下に引っ込めます。
  2. 無肝期の前にイソフルランの濃度を0.3〜0.5%に減らします。
  3. マイクロセレファインを使用して、IHIVCを右腎静脈の上にクランプします。
  4. ピーン鉗子を使用してPVをクランプします13。
  5. 肝臓を下に引っ込めながら、ブルドッグクランプを使用して横隔膜でSHIVCをクランプします。
  6. SHIVCの前壁を切断し、次に後壁を切断します(図1)。
    注: レシピエントとドナーの横隔膜 crus から SHIVC 後壁を分離することは、再建のための十分なマージンを得るために重要です。
  7. PVとIHIVCをレシピエントの肝臓に密着して解剖した後、レシピエントから肝臓を取り出します(図1)。
  8. 準備した肝移植片をレシピエントの腹腔に入れ、肝臓を適切に配置します。
  9. SHIVCの右端にステー縫合糸を配置して結紮し、ブルドッグクランプで保持して縫合糸をレシピエントの腹側に向かって引っ張ります(図2A)。
    注:SHIVCの右側は腹腔の奥深くにあります。SHIVCの右側を引き出し、後壁が前に来るようにします。
  10. SHIVCの左端にステー縫合糸を配置して結紮します。
  11. 左側からSHIVCの後壁に管腔内法で連続縫合を開始します(図2A)。
  12. SHIVCの後壁の右端に到達したら、手術台を反時計回りに90°回します。
    注:左利きの外科医の場合は、手術台を時計回りに90°回転させます。あるいは、外科医は回転せずに前壁を前から後ろに縫合することもできます。
  13. 右側からSHIVCの前壁に何度も縫合して縫合を続けます(図2A)。
    注:後壁には約6〜8針、前壁には約8〜10針が必要です。出血を防ぐためには、前壁の左端の縫合糸が重要です。
  14. SHIVC内の空気を洗い流した後、SHIVCの左側にあるステー縫合糸で連続縫合糸を結紮します。
  15. 手術台を時計回りに90°回転させて、レシピエントの位置を元の位置に戻します。
  16. PVの再構成と再灌流の後、SHIVCのクランプを外します。
    注:SHIVCの再構築には10〜15分かかります。PV クランプ時間は LT の結果に影響を与える可能性があるため、無肝時間 (PV クランプから PV クランプ解除まで) は、外科医のスキルに基づいて最大 20 分間固定する必要があります。PV 再灌流後、麻酔を維持するためにイソフルランを 1% にリセットします。

6. レシピエントにおけるIHIVCの再構築

  1. IHIVC の両端に 10-0 ナイロンでステー縫合糸を配置して結紮します。
  2. ブルドッグクランプでステー縫合糸を持ち、両側に引っ張り、IHIVC切り株が広くまっすぐになるようにします。
  3. 後壁の左側に管腔内法で連続縫合を開始します(図2B)。
  4. 右側に到達したら、レシピエントの右側から前壁で何度も縫合を続けます(図2B)。
    注:IHIVC再建には手術台の回転は必要ありません。後壁と前壁ごとに約6〜8針で十分です。
  5. IHIVC内の空気を洗い流します。
  6. IHIVC クリップをグラフト側から外し、次にレシピエント側から外します。
    注: IHIVC の左側にあるステー縫合糸による連続縫合糸の結紮は不要です。IHIVCの再建には8〜10分かかります。PV クランプから IHIVC 放出までの総再灌流時間は 30 分以内である必要があります。

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結果

マウスレシピエントは、寒冷虚血時間を延長することなく、正常な肝移植片を使用して血管再建が成功したとき、30分以内に麻酔から回復しました。>90% の成功率は、この手順に熟練していると見なすことができます。ある外科医の学習曲線を調べて、LT 後の回復率 (麻酔からの回復)、無肝時間 (クランプから PV フローの解放まで)、および総再灌流時間 (PV のクランプから IHIVC フローのリリースまで) について調試しました。満足のいく回復率を得るには60症例以上が必要であり、20分以内の安定した無肝時間と約30分の総再灌流時間を得るには80症例以上が必要でした(図3A-C)。

次に、2 人の熟練した外科医によって行われた IHIVC 再建のためのカフと縫合技術に関する手術結果を評価しました。縫合技術を使用したIHIVCの直径は、カフ技術を使用したものよりも有意に大きかった(図4A)。さらに、I...

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ディスカッション

この記事では、マウス同所性 LT における縫合技術による SHIVC および IHIVC の再建のための詳細な技術を文書化しました。血管再建、特に無肝期に縫合技術を必要とする SHIVC 吻合は、マウス LT を成功させるための重要なスキルです。安全で確実な縫合技術に加えて、マウス同所性LT 2,7,11で再現性のある結果を得るには、無肝期を20分以内に保つために迅速な縫合が必要です。

前壁縫合糸の作業スペースを確保するには、手術台を反時計回り(左利きの外科医の場合は時計回り)に90°回転させる必要があります。あるいは、外科医はテーブルを回さずに前壁を前から後ろに縫合することもできます。縫合時間は方法によって異なるため、外科医のスキルと好みに基づいてどちらの方法も選択できます。

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、日本学術振興会(研究課題番号:24K19356)の助成を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10-0マイクロ縫合糸AROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
16 G 静脈内カテーテルテルモSR-FF2032IHIVCカフ
20 G 静脈内カテーテルテルモSR-FF1651PVカフ
8-0編み込みシルク夏目製作所CR9-80B28-0絹
Belzer UW冷蔵ソリューション アステラス製薬臓器保存液
ブルドッグクランプBブラウンFB329R型ブルドッグクランプ
ブルドッグクランプ夏目製作所C-42-S-2SHIVCクランプ用
C57BL/6 マウス  オリエンタルバイオサービス
鉗子ファインサイエンスツール11231-30
イソフルラン吸入液ビアトリス麻酔
マイクロブランテッドチップ 0.1 mm x 0.06 mm ファインサイエンスツール11253-20ストレートマイクロ鉗子
マイクロハサミ村中医療機器451-609-13
マイクロセレファインファインサイエンスツール18055-03IHIVCクランプ用
マイクロセレファインファインサイエンスツール18055-04PVクランプ用
ロック付きマイクロセレファインクランプアプリケーターファインサイエンスツール18056-14ベッセルクリップアプリケーター
マイクロセレファイン ファインサイエンスツール18055-4ベッセルクリップ
マイクロ縫合糸エスキュラップFD281R型
マイクロセレファインクランプアプリケーターファインサイエンスツール18056-14
ニードルホルダーエスキュラップFD231R型
No.11 スペアブレードFEATHER 安全カミソリ11ブレード
眼科用ハサミ、丸型ハンドルBブラウンFD103R型マイクロハサミ
プラスチック製の長方形の容器  ダイソー長さ10cm、幅15cm、高さ6cm
SuperGripのヒントファインサイエンスツール00649-11 湾曲マイクロ鉗子
SZX7オリンポスSZX7顕微鏡
ヴァンナスハサミ世界の精密機器501232
血管クリップベアメディック株式会社TKF-1-30肝移植片のIHIVCクランプ用

参考文献

  1. Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
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