方法論記事

レチノール同位体希釈技術を用いたヒト被験者への投与用ビタミンAトレーサー用量の製剤

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DOI：

10.3791/69240

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2026年3月31日

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

この記事について

サマリー

レチノール同位体希釈技術に必要な安定同位体標識ビタミンAの調製は、食品安全基準に準拠する必要があります。プロトコルは、選択した投与システムおよび適用された分析プラットフォームに適した濃度での植物油の用量調製を示しています。

要約

レチノール同位体希釈(RID)技術は、同位体標識されたビタミンAトレーサーをヒト被験者に投与することに依存しています。ここでは、研究チームが研究および集団調査のためにビタミンA安定同位体トレーサーの調製方法を導く方法を紹介します。この記事では、トレーサーが人間に安全に使用されるよう、準備、材料、機器の調達、手順の概要を紹介しています。ビタミンA安定同位体トレーサーは市販可能で、通常は重水素[2H]または炭素13[13C]で標識され、全トランス異性体純度>95%、同位体富>99%です。ビタミンA安定同位体トレーサーの製備は、トレーサーを食用植物油に超音波処理と加熱によって溶かすことを含みます。トレーサーは、供給システムの体積制限内に十分収まる濃度で準備する必要があります。最後に、トレーサーは無菌の琥珀色のガラスバイアルに分割され、トレーサー濃度は分光光度測定で確認されます。

概要

ビタミンA欠乏を減らすことを目的とした介入プログラムの効果的なモニタリングを可能にするために、レチノール同位体希釈(RID)法は、さまざまな集団グループ1、2、3、4における全身ビタミンA貯蔵量(TBS)に関する情報を提供するために成功裏に適用されています。ビタミンA欠乏の確認には血清レチノール5、血清レチノール結合タンパク質(RBP)6,7,8および修正相対用量反応(MRDR)検査9がよく用いられますが、RIDは体内のビタミンA蓄積を亜臨床的欠乏から毒性まで全スペクトルにわたって正確に定量化できる唯一の方法です.既知の標示済みビタミンAを投与し、平衡後の血漿中希釈を測定することで、RID法はTBSおよび肝臓のビタミンA備蓄を正確に推定します。重要なのは、RID法は炎症のある集団でも信頼性が高く、介入効果の評価や重複する補給・強化プログラムにおける毒性リスク評価に欠かせない存在である13,14。

RID法を行うには、同位体標示されたビタミンAを経口投与する必要があります。多くの場合、レチニル酢酸を食用植物油に溶かしたものです。ほとんどの検査機関は、商業サプライヤー1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22の同位体標識済みビタミンAを入手します。市販されているビタミンA同位体トレーサーのほとんどは、炭素13(13C)または重水素(2H)の安定同位体を用いて標識されています(表1)。塗布される同位体用量の選択は、質量標識されたレチノールの血清または血漿濃度を決定する分析機器によって異なります。ガスクロマトグラフィー-質量分析法(GC-MS)および液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法(LC-MS/MS)は[13C]および[2H]22,23,24,25,26,27を解析できますが、ガスクロマトグラフィー-燃焼-同位体比質量分析法(GC-C-IRMS)は[13C]標識されたレチノールトレーサーのみを解析できます 4,2528。選択した分析機器の検出限界、対象群(子どもまたは成人)、および調査期間によって、投与すべき用量3、25、29が決まります。これまでのところ、適用された同位体用量は、子供の3,4,30で0.3〜4.3 mg RE(RE;1〜15 μmolに相当)、成人の2,3,31で0.6〜10.0 mg RE(2 〜 35 μmolに相当)の範囲で、最近の研究では子供に0.3〜0.6 mg RE(1〜3 μmol RE)および成人で0.6〜2.0 mg RE(2 - 7 μmol RE)の低用量が適用されています。ビタミンAの高量がビタミンAの基底となる動力学を乱すのではないかという懸念が高まりましたが、区画モデリングを用いた最近の解析では、子どもで7μmol RE、成人で14μmolの同位体投与量がTBSの予測精度に影響を与えないことが確認されました。ここでは、RID法の経口投与用同位体標識トレーサーの調製方法を、食品安全上の懸念を考慮し、正確な用量濃度の取得を実演します。同位体用量の調製はRID法において非常に重要です。

プロトコル

1. 参加基準および除外基準

  1. 研究1の基準は以下の通りです:参加基準:18歳から45歳までの健康な男女ボランティアを含めること。除外基準:妊娠、喫煙、高血圧、糖尿病、BMI>30、肝臓・腎臓・消化器疾患、脂質代謝障害、および研究開始3か月前にマルチビタミン(ビタミンA、C、Eを含む)またはβカロテンサプリメントの摂取を有しているボランティアは除外します。
  2. 研究2の基準は以下の通りです:対象基準:研究期間中ずっと研究対象地域に留まった12〜18か月の子どもを含む。除外基準:高用量ビタミンAサプリメントを受けておらず、地域市場でビタミンA強化食品に曝露されていない地域に住んでいた子どもは除外します。

2. RIDの安定同位体トレーサーの総量の決定

  1. 異性体純度を考慮して、被験者ごとにどの量の安定同位体トレーサーを投与すべきかを決定してください。生物活性や代謝経路が幾何学異性体間で大きく異なるため、全トランス400>95%の安定同位体を使用することが推奨されます。用量レベルはレチノール当量(RE)に基づいて計算してください。この計算方法の例は 表2に示されています。
  2. 投与量レベルに被験者総数を掛けます。必要なサンプルサイズの検出力計算に基づいて被験者総数を基準にし、予想される喪失率に応じて増加します(例表 2 参照)。ピペッティング損失を最大20%まで考慮して、必要なトレーサーの総量を増やしましょう。
    注意:原則として、バイアルからすべての物質を回収することは不可能であるため、同位体調製には余分な成分を含める必要があります。さらに、ピペットの先端外側に残る油の粘度による損失も発生します。投与時の正確な用量を得るためには、ピペット先端の外側に付着した余分な油を拭き取る必要があります。ピペットの先端を油に深く浸さないことで、オペレーターはピペッティング損失を最小限に抑えることができます。

3. 安定同位体トレーサーを溶解するために必要な植物油の量を決定する

  1. 被験者ごとに使用する植物油と投与量を決定します(表2)。被験者の投与時に使用される投与システムによって添加されるオイルの量を決定してください。
    注:ビタミンE含有量が高いため、ひまわり油を使用しています。これはビタミンAの安定性を助けます。しかし、他のグループでは地域の食事基準を満たすために他の植物油が使用されてきました。RIDは安定同位体標識トレーサーの正確な投与に依存しているため、食用油で調製した正置換ピペットの使用が推奨されます。最近のほとんどの研究では、特に1、7、23の子どもに投与した場合、最大250μLの量が使用されています。
  2. 安定同位体トレーサーの植物油中の用量濃度を計算します。必要な植物油の総量を決定します。計算された体積と植物油の相対密度に基づいて必要な油の重量を計算します(例は 表2 参照)。
    注意:安定同位体トレーサーの調製のために、オイルの重量を測定することが推奨されます。必要な油の総体積が計算されると、安定同位体標識トレーサーを注文できます。同位体トレーサーは、研究チームが植物油を直接同位体標識付きトレーサー入りのボトルに計量できる十分な容量のボトルで発送するよう依頼することが重要です。

4. 食品準備用の専用エリアでの安定同位体標識トレーサーの準備

  1. 安定同位体トレーサーの総量が入った琥珀瓶の蓋を慎重に開け、分析天秤に置いてからゼロに焦がされます。
  2. 無菌の10 mLシリンジで、目標の重さ(± 0.1 g)になるまでオイルを滴り加えます。
    注意:一部のレチニル酢酸結晶がアンバーボトルのキャップ内に閉じ込められている可能性があるため、ボトルを開ける際には非常に慎重に行う必要があります。植物油を琥珀色のボトルに加えた後、キャップを慎重に戻し、手で慎重に振ってキャップ内に残ったレチニル酢酸結晶を再び浮遊させます。
  3. ボトルを超音波パワー14 W/L、動作周波数44 kHzの超音波水浴に入れます。水をボトル内の油のレベルより上、蓋の高さより下まで注ぎ、水が誤って調合物に入らないようにします。
  4. ボトルを15分間ソニック処理し、その後手で慎重に混ぜ、さらに15分間ソニック処理を続けます。超音波洗浄水浴の温度が50°Cを超えないように注意が必要です。
    注:ひまわり油を用いて調製したところ、50°Cに30分間曝露しても シスレ チノイドへの異性化は起こらないことがわかりました( 図2参照)。ただし、調製物はHPLCによる分析を行い、熱異性化の範囲を評価する必要があります。
  5. ボトルを50°Cの温水浴に30分間入れて、微結晶を完全に溶かします。
  6. 実験室で200倍倍の光学顕微鏡で微小結晶の存在を調べるために、20μLの油サンプルを取ります。微小結晶がある場合は、超音波処理と加熱の手順を繰り返します。
  7. 完全に溶解したら、油の全量を2〜4mLの滅菌ガラス琥珀バイアルに分割します。この手順では交差汚染を避けるために正置換ピペットを使用してください。
    注:ガラス琥珀バイアルに添加される安定同位体トレーサーの体積は、1日のリクルート率によって調整できます。例えば、1日5人の被験者がリクルートされ、投与量が150μLの場合、バイアルは5回分の投与量とピペッティング損失を考慮できる十分な容量が必要です:5×150μL x 1.2 = 900μL。
  8. 安定同位体濃度を三重量で測定します。安定同位体標示トレーサーの準備中、200 μLの純粋な植物油(分光光度ブランクの調製用)と200〜350 μLの安定同位体用量を別々の2 mL琥珀バイアルに備蓄します。
    1. 投与濃度が0.5 mg RE≤場合は、安定同位体350 μLを別個の2 mLの琥珀バイアルに備蓄します。0.5 mg RE>濃度の場合、安定同位体用量200 μLを別個の2 mL琥珀バイアルに備蓄します。
  9. バイアルに不活性ガス(Ar)を布層にかけて同位体標識トレーサーの酸化を遅らせ、密閉して同位体濃度、投与量(後で決定)、調製日、プロジェクト名を標示したクライオボックスに保管します。出荷まで冷凍庫は-20°Cの食品冷凍庫で保管してください。このような条件下では、トレーサー用量は少なくとも2年間安定しています。

5. 実験室での安定同位体トレーサー濃度の測定

  1. 安定同位体トレーサーを3個のボボメトリックフラスコにn-ヘキサンで希釈します。トレーサー投与前に、n-ヘキサンをキャリブレーションラインより1cm下までボボリューメトリックフラスコに充填してください。
    1. 安定同位体トレーサーの希釈量をトレーサー用量濃度で算出します。安定同位体トレーサーの用量濃度が0.5 mg RE≤場合は、安定同位体用量100 μLを50 mLの容量フラスコにn-ヘキサンを加えて希釈します。投与濃度が0.5〜2 mg REであれば、安定同位体用量50 μLを50 mLの容量フラスコにN-ヘキサンを投与します。投与濃度が>2 mg REであれば、安定同位体用量50 μLを100 mLの容積フラスコにn-ヘキサンを投与します。
    2. 50〜100μLの油を直接ヘキサンに注ぎ、ガラス製パスツールピペットで50〜100mLの容量に、追加のヘキサンを加えたフラスコを作ります。フラスコを10回逆さにして、油とヘキサンを混ぜます。
      注意:ヘキサンは適切なPPEを着用し、排気キャビネット内で取り扱うべきです。廃棄物ヘキサンは、認定業者によって専門的な処理のために専用容器に集められます。
  2. 分光光度の空白フラスコは、安定同位体トレーサーと同じ体積(50または100μL)をピペットで抽出し、ヘキサンに分散して準備します。適用された希釈量(50または100 mL)が安定同位体トレーサーと同じであることを確認しましょう。フラスコを10回逆さにして、油とヘキサンを混ぜます。
    注:安定同位体トレーサーまたは純油のピペッティングには、100μLの正置換ピペットを使用します。正確な体積をピペット化するためには、先端を下向きに綿布紙で拭き取り、外側のトレーサーや油分を除去することが重要です。直接交換用ピペットの先端を拭く際は、紙が先端の開口部に触れないように注意が必要です。なぜなら、先端内部から油が抽出されるからです。
  3. 分光光度計をヘキサン中の植物油を分光光度の空白として使い、325nmの波長に設定した分光光度計を用いて、石英キュベットの安定同位体トレーサー濃度を測定します(例は 表3参照)。
    1. ヘキサン中の植物油を分光光度の空白として測定を開始します。各測定の合間に、クォーツUVキューベットをN-ヘキサンで3回洗い流してきれいにしてください。すべてのサンプルが測定された後、純粋なn-ヘキサンでキュベットを丁寧に洗浄してください。
  4. 平均AU値を用いて安定同位体トレーサーの濃度を決定し、ビア・ランバートの法則を用いて同位体特異的なモル消光係数を適用します。これから、1回あたり必要な調製安定同位体トレーサーの体積を算出します(下記および 表3の代表的な結果の例を参照)。

結果

トータル同位体トレーサー線量サイズの計算
100人の被験者を対象とした研究では、合成に必要な[13C 10]レチニル酢酸の総量を計算しました(表2)。この量は、必要なサンプルサイズ(n = 100)、予想される損失(n=15;15%の喪失)、ピペッティング損失(20%)および1回あたりのレチニル酢酸イオン濃度(0.4 mg RE;適用質量分析計の感度、実験期間、被験者の年齢層に基づく)の検出力計算に基づいています。得られた総量のRE(55.2 mg RE)は、[13C10]レチニル酢酸塩(63 mg)の必要な重量に換算されます。

所定濃度で[13C10]レチニル酢酸を溶解するために必要なひまわり油の体積を計算するために、まず投与量を150 μL/用量(0.15 mL/用量)に設定しました。その後、ひまわり油1 mL中の[13C10]レチニル酢酸塩濃度を計算します(表2)。[13C10]レチニル酢酸(63 mg)の必要な重量を必要な用量濃度で割ると、必要なひまわり油の総体積が得られます。最後に、ひまわり油の重さはひまわり油の相対密度を用いて決定されます。

オイル中の[13C10]レチニルアセテートの正確なターゲット線量濃度は、ビア・ランバート法則に基づく分光光度計を用いて安定同位体トレーサー濃度を測定することで確認されました(表3参照)。測定中の安定同位体トレーサーの希釈(希釈係数500)を考慮すると、油中のレチニル酢酸イオン濃度は2.58μmol/μL [13C10]となります。したがって、0.4 mg RE用量に必要な最終的な安定同位体トレーサーの体積は155 μLと判定されました(表3)。

トレーサー用量の異性化の可能性の検査
得られたトレーサー用量の異性体純度は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いてシス異性化の検査によって決定されました。図2)。これを行うために、ステップ5.1.2の希釈トレーサー溶液のサンプルを窒素ガスで乾燥させ、残留物を100%エタノールに再溶解して注入しました。Liuらの手法を用いて3つのリピートサンプルのHPLC解析を行い、シス異性化の有無を確認しました(図2参照)。トレーサー用量の純度は試験中ずっと監視し、用量が劣化していないか確認する必要があります。

トレーサー用量濃度が時間経過における用量の割合に与える影響
異なる用量レベルの適用により、摂取量の割合が時間とともに変動し、分析プラットフォームがすべての被験者で必要な時間に[13C10]レチノールを検出する能力に影響を与える可能性があります。成人または子供(図3B)に1 mgまたは0.4 mgのレチニル酢酸塩を油に投与したところ(図3A)、1mg投与後の用量が0.4mgの[13C 10]レチニル酢酸塩よりも増加し、適用されたLC-MS/MSの検出能力が確認されました [13C 10]。]投与後最大28日までの被験者におけるレチノール。これは、異なる時間点での線量割礼に関する情報が、適用された線量レベルが適用された分析プラットフォームの検出レベルを超える信号を得るのに十分高いかどうかを判断する上で重要であり、この情報は理想的には代表的なサンプルを用いたパイロット試験で取得すべきであることを裏付けています。

figure-results-1
図1:ビタミンAトレーサー用量の調製フローチャート。 安定同位体投与量の調製を行うための重要なステップには、必要な量の決定、得られたトレーサー用量の濃度、用量純度の確認が含まれます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-2
図2:レチニル酢酸の異性化を調べるためのトレーサー用量のHPLCクロマトグラム。各工程ごとにHPLC分析で同位体用量のHPLC分析を用いて、(A)超音波検査および(B)50°Cに加熱した後の[13C10]レチニル酢酸塩の潜在的異性化が評価されました。解析は、Liuらの手法を用いてダイオードアレイ検出を用いたHPLC上で行われました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-3
図3:[13C10]レチニル酢酸塩摂取後の血漿レチノール用量の時間経過観察平均。(A)英国成人45名、フィリピンの子ども1名(112名)から、それぞれ1mgまたは0.4 mgのレチニルアセテート投与された用量割合[13C10]。用量の割合 = {血漿[13C]レチノール濃度(μmol/L) × 推定血漿体積(L)÷[13C]用量(μmol)。データはSEM±幾何平均として表示されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

安定同位体供給元/製造元
[D4]-レチニル酢酸塩Buchem BV/ReseaChem GmbH/ケンブリッジ同位体研究所
[D6]-レチニル酢酸Buchem BV/ReseaChem GmbH/ケンブリッジ同位体研究所
[D8]-レチニル酢酸塩Buchem BV/ReseaChem GmbH/ケンブリッジ同位体研究所
[13C3]-レチニル酢酸塩ブーヘムBV/ReseaChem GmbH
[13C4]-レチニル酢酸塩Buchem BV/ReseaChem GmbH/ケンブリッジ同位体研究所
[13C8]-レチニル酢酸塩Buchem BV/ReseaChem GmbH/ケンブリッジ同位体研究所
[13C10]-レチニル酢酸塩Buchem BV/ReseaChem GmbH/ケンブリッジ同位体研究所

表1:市販の安定ビタミンA同位体トレーサー。 異なる供給元からの 13Cおよび 2H表示のレチニルアセテートトレーサーのリスト。

パラメータ
サンプルサイズ [n]:100
離脱率[n](%):15 (15%)
ピペッティングの損失:20%
MW [13C10]レチニル酢酸塩:338.5 μg/μmol
MW [13C10]レチノール:296.46 μg/μmol
投与量:被験者1人あたり0.4 mg RE [13C10]レチニル酢酸塩
計算方法
必要なREの総量:= 投与量(mg RE)× サンプルサイズ × 消耗 × ピペッティング損失
= 0.4 mg RE × 100 × 1.15 × 1.2
= 55.2 mg RE
必要なレチニル酢酸塩の総量[13C10]:= mg RE × MW [13C10]レチニル酢酸 / MW [13C10]レチノール
= 55.2 mg RE × 338.5 μg/μmol / 296.46 μg/μmol
= 63.0 mg [13C10]レチニル酢酸塩
オイル中の[13C10]レチニル酢酸塩の用量濃度:[13C10]レチニル酢酸塩 [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10]レチニル酢酸塩 / MW [13C10]レチノール) / 0.15 ml
= (0.4 mg RE × 338.5 μg/μmol / 296.46 μg/μmol) / 0.15 ml
= 3.04 mg/ml
必要なひまわり油の総量:= 油中の総[13C10]レチニルアセテート重量/用量濃度
= 63.0 mg / 3.04 mg/ml
= 20.7 mL オイル
必要なひまわり油の重量:= ひまわり油の総体積 × 相対密度
= 20.7 ml × 0.92 g/ml
= 19.0 g ひまわり油

表2:安定同位体トレーサー線量計算の例。 パラメータの表示と計算によるトレーサー用量および植物油量の決定。

パラメータ
ヘキサンにおける[13C10]レチニル酢酸のモル消光係数(E1%1cm):52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
希釈係数:500(50mLのヘキサンに100μLのオイル調製)
測定された平均吸水率:0.917
MW [13C10]レチノール:296.46 μg/μmol
計算方法
ヘキサン中の[13C10]レチニル酢酸イオンの濃度(mol/L):濃度(mol/L)= 吸収量 / E1%1cm × キュベットの長さ(1cm)
= 0.917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1.739 x 10-5 mol/L
濃度をμmol/μLに変換する方法:濃度(mol/L)=濃度(μmol/μL)
1.739 x 10-5 mol/Lは1.739 x 10-5 μmol/μLに相当します
希釈の補正:油中の1.739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8.697 x 10-3 μmol/μL
μLあたりの重量(μg/μL):= [13C10]レチニル酢酸 μmol/μL オイル中 × MW [13C10]レチノール
= 8.697 × 10-3 μmol/μL × 296.45 μg/μmol = 2.58 μg/μL
1回あたりの体積:= 体積(μL/400μg投与量)= 400μg / 2.58μg/μL = 155μL

表3:安定同位体トレーサー用量濃度の決定。 経口投与に必要なトレーサー用量濃度および必要な体積を決定するためのパラメータと計算。

ディスカッション

ヒト研究で使用される安定同位体トレーサーは一般的に安全と考えられており、適用濃度25,35で生物学的または生理学的な悪影響は報告されていません。しかし、安定同位体トレーサーは経口投与が必要なため、トレーサー用量が食品安全基準に準拠していることが不可欠です。これは、安定同位体表示ビタミンAの供給者や製造者に対し、供給されている同位体7、20、24に対して食品安全検査を実施させることで達成できます。同様に、同位体の調製と保管は食品調理専用のエリアでのみ行うことが不可欠です。さらに、安定同位体調製に使用されるすべての機器は同位体調製専用で、食品調理用の区域に保管されなければなりません。

レチニル酢酸塩標識同位体は、以前エタノールで溶解され、その後窒素ガスで乾燥させられ、植物油36に溶解されていました。ここでは、音響測定と加熱の組み合わせを用いて同位体標識トレーサーを植物油に溶解させる方法を紹介します。この方法は食品準備場ではより容易ですが、トレーサーを植物油に溶かすために熱を加える際は注意が必要です。オールトランスレチノールは熱処理中に13-シス-レチノールに異性化され、高温で加速します。37。光への曝露によりレチノールの異性化がさらに増加します。さらに、レチノールの安定性は植物油の脂質酸化特性にも影響を受けます。植物油中のαトコフェロール含有量はビタミンA保持に良い影響を与え、ひまわり油はαトコフェロール33の含有量が最も高いため、トレーサー用量の準備にはひまわり油を使用することにしました。トレーサーを溶かすために最大50°Cの熱を加える決定は、化粧品にレチノール結晶を溶かす際に熱を加えることが大きな損失なしに行われたことに基づいています。記載されたプロトコルの下ではレチニル酢酸塩の有意な劣化は見られませんでしたが、熱処理直後にトレーサー用量のシス異性化を確認することが重要です(図2)。さらに、トレーサー用量の安定性を試験全体を通じて監視し、適用されたトレーサー用量濃度を確認することを推奨します。

トレーサーは、必要な投与に用いられる投与システムの体積制限内に十分収まった濃度で調製されなければなりません。RIDは安定同位体標識トレーサーの正確な投与に依存しているため、投与には正置換ピペットの使用が推奨されます。過去には成人16、20、40の用量が最大1mLで適用されてきましたが、乳幼児や子供に耐えやすいことが示されているため、100〜250μLの量を投与する方が容易です。あるいは、カプセルフォーム17で投与することも可能ですが、オイル漏れを防ぎ、研究対象内での受け入れを確保するために特別に設計されたカプセルを選ぶことが重要です。最後に、適用された投与量レベルは対象集団の年齢層に依存します29、適用分析プラットフォームの低レベル検出能力3、および対象集団の全身貯蔵量、より高い総体内貯蔵量では血漿比が低い1。

上記の例で示されているように、ひまわり油中の2.58 μg/μL濃度の[13C10]酢酸レチニルは、155 μLのひまわり油に0.4 mgのREトレーサーを供給し、250 μLの正置換ピペットで正確に投与可能です。供給システムの体積制限内に濃度を得るためには、トレーサーを溶解させるために選ばれた植物油を、安定同位体トレーサー入りのボトルに0.1gまで正確に計量することが極めて重要です。例えば、3.04 mg/mL濃度で合計63 mg [13C10]のレチニル酢酸塩を製製し、比重が25 °Cで0.92 g/mLの場合、トレーサー入りのボトルに19.0 g(20.7 mL x 0.92 g/mL)の油を計量する必要があります。安定同位体トレーサーの最終濃度は分光光度計の測定で確認されますが、同位体トレーサーと塗布油の正確な計量により、各投与量の指定量に近い濃度が保証されます。

オイルの調製剤は、1日の必要量に応じて割り当て、バイアル内の全用量が開封後2週間以内に使用されるようにすることが望ましいです。使用中は油の準備を現場で氷嚢に置き、投与完了後はできるだけ早く再冷凍するのが最善です。オイルの調製は繰り返しの凍結・解凍サイクルの影響を受けませんが、使用しないときは光から常に保護し、冷凍保存する必要があります。

まとめると、このプロトコルはRID法のトレーサー用量の正確な調製と品質管理を詳細に説明し、正確な投与量、安定性、安全性を確保しています。この手法はトレーサーの必要量を計算し、植物油への溶解度を最適化し、分光光度法とHPLCを用いて純度と濃度を検証します。厳格な取り扱いおよび保管ガイドラインにより、正確な同位体ベースの評価において信頼できるトレーサーの完全性が保証されます。

開示事項

著者たちには宣言するものは何もない。

謝辞

この研究の支援はビル&メリンダ・ゲイツ財団(プロジェクト番号:OPP1115464)およびウィーンの国際原子力機関(IAEA、プロジェクト番号E4.30.30)によって提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
投与量のアリクオート用に2mlの琥珀色ガラスバイアルフィッシャー11573690研究のサンプル数や毎日投与されるボランティアの数によっては、例えば4mlのようなより大きなアンバーバイアルの使用が効率的かもしれません
100mlのボリュームフラスコフィッシャー11323644パイレックス ホウケイ酸ガラス クラスA認定ボリューメトリックフラスコ
50mlのボリュームフラスコフィッシャー11313644パイレックス ホウケイ酸ガラス クラスA認定ボリューメトリックフラスコ
分析的体重計など;フィッシャー13592970
毛細血管ピストン(ピペットチップ) CP100 10x96 TIPACKギルソンFD148314
毛細血管ピストン CP1000ST 2x91ギルソンF148180
毛細血管ピストン CP250ST 6x96ギルソンF148714
段ボール製のクライオボックススターラブA9623-8181
ヘルマ・キュベット UV水晶SLSCEL1600
HPLC認証済みHPLC用ヘキサン95% n-ヘキサンフィッシャーH/0406/17
2mlの琥珀色ガラスバイアル用の蓋フィッシャー11573542
Microman E M1000E ピペット(正置換式)ギルソンFD10006
Microman E M100E ピペット(正置換式)ギルソンFD10004
Microman E M250E ピペット(正置換式)ギルソンFD10005
顕微鏡ニコンエクリプス E400
顕微鏡ガラススライド シグマ41122601
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参考文献

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