マルチプレックス蛍光免疫測定法は、血清学的検査の基準になりつつあります。ただし、それらのアプリケーションは、複雑さと時間のかかるビーズ分析種カップリングプロセスによって制限されます。このレポートは、結果を得るまでの時間を大幅に短縮しながら、標準的な方法に匹敵する、半自動で再現性のあるマルチプレックスマイクロスフィアビーズカップリングプロトコルを提示します。
この記事について
サマリー
要約
節足動物媒介ウイルス(アルボウイルス)は、世界中に分布する蚊媒介性病原体のグループです。2016年に南北アメリカでジカウイルス(ZIKV)が発生し、これらの感染症が一般の人々に認識されて以来、アルボウイルスは公衆衛生上かなりの負担を課し続けています。以前は流行していなかった地域でのそれらの出現は、公衆衛生上の懸念の原因です。アルボウイルス感染症の監視と制御は、2024 年にアルボウイルス感染症と闘うための世界戦略計画を開始した世界保健機関 (WHO) の現在の優先事項です。マルチプレックス®技術は血清学的サーベイランスの分野に革命をもたらし、最小限のサンプル量で複数の抗体を同時に測定できるようになりました。マルチプレックス血清学的検査の開発における専門知識に基づいて、アルボウイルス抗原に対する抗体を検出するためのビーズベースのマルチプレックスアッセイが開発されました。このアッセイは、デング熱 (DENV)、黄熱病 (YFV)、ジカ熱、チクングニア熱 (CHIKV) ウイルスなどの一般的なアルボウイルスに特異的な複数の抗原で構成されています。半自動法を使用して、抗原をマイクロスフェアビーズに共有結合させました。この新しいプロトコルは非常に効果的で、再現性のある結果を確保しながら、1回の実験で最大96種類の抗原を結合させることができます。蛍光強度中央値(MFI)データは、ユーザーフレンドリーな蛍光イメージングシステムを使用して取得されました。流行国のヒト血清サンプルに適用すると、このアッセイは血清監視の取り組みのための強力なツールとなると予想されます。
概要
アルボウイルスは、毎年数千人の死亡者を総じて占めています。これらのウイルスは、感染した節足動物、主に蚊やダニ を介して 人間に感染します。アルボウイルス感染症の重症度は多様で、無症候性感染症から死に至る可能性のある重篤な疾患まで多岐にわたります。2024年、世界保健機関(WHO)は、デング熱ウイルス(DENV)の4つの血清型だけで1万人以上の死亡を記録した1。同年、このウイルスは5万人の重症者を含む1,400万人以上に感染した1。DENVは最も顕著なアルボウイルスですが、このグループには、世界中で複数の発生の原因となっている他の生命を脅かす病原体が含まれています。アフリカにおけるアルボウイルス感染症に関する最近の要約レビューでは、DENV、黄熱病ウイルス(YFV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、西ナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKV)などのこれらのウイルスが、2023年に大陸全体で少なくとも29件の発生を引き起こしたことが判明した2。2022年、WHOアフリカ地域事務所が発表した報告書は、地域全体のアルボウイルス監視における現在の限界を強調し、アルボウイルスの監視と制御の方法を開発する緊急の必要性を強調した3。
アルボウイルス感染症の臨床診断は、流行地域に存在する他の病原体に共通する発熱、関節痛、全身倦怠感などの症状が類似しているため、困難です4。さらに、ウイルスの共循環と潜在的な同時感染により、病因病原体の区別は困難です5.鑑別診断には検査室での確認が重要です。ヒトサンプル中のアーボルウイルスを検出するには、いくつかの方法が存在します。分子診断検査、ウイルス抗原検出、ウイルス単離などの直接的な方法は病原体の存在を検出し、血清学的診断などの間接的な方法はウイルス感染に対する免疫応答を測定します6。
アルボウイルスに対する抗体応答を検出するための多数の方法が開発されています。これらには、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、補体固定、赤血球凝集阻害、およびミクロスフェア免疫測定法6,7が含まれます。本レポートでは、アルボウイルス抗原に対する抗体応答を検出するための多重蛍光マイクロスフェアベースのイムノアッセイ(FMIA)を紹介する。マイクロスフェアベースのアッセイ8は血清学で広く使用されており、いくつかの利点がありますが、最も重要なのは、最小限のサンプル量で1回の反応で複数の分析種を検出できることです。目的の組換え抗原でコーティングされた光学的にコード化されたマイクロスフェア(磁性ポリスチレンビーズ)は、間接的な血清学的免疫測定法に使用されます。次に、結合したビーズをサンプルとインキュベートし、フィコエリトリン(PE)蛍光色素レポーターに結合した抗ヒトIgG二次抗体を使用して抗原特異的抗体を検出します。MFIとして報告される放出蛍光の検出には、いくつかの分析装置が利用可能です。
アッセイの原理は、Angeloni et al.8 に詳述されています。簡単に言えば、目的の抗原は色分けされたマイクロスフェアに化学的に結合しています。このために、ビーズは最初に 1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド (EDC) と N-ヒドロキシスルホスクシンイミド (スルホ-NHS) で処理され、ビーズ表面のカルボキシル基が活性化され、アミン反応性化合物が生成されます。次に、この中間の半安定化合物を目的のタンパク質と混合し、タンパク質のアミン部分がビーズに共有結合し、表面に目的のタンパク質でコーティングされた安定したマイクロビーズを生成します。抗原結合ビーズをサンプルとインキュベートし、抗体が特定の抗原に結合できるようにします。抗原結合抗体は、蛍光色素に結合した抗免疫グロブリン二次抗体を使用して検出されます。PE標識二次抗体を使用しています。MFIは、光イメージャーを使用して測定されます(機器の詳細は 材料表に記載されています)。この装置は、赤色LEDと緑色LEDの2つのLEDライトを使用し、ビーズの内部色素とビーズ表面のレポーター蛍光を別々に励起します9。次に、フィルターを使用して、色に基づいてビーズを分類し、分析種から発せられる蛍光を定量します。
私たちは以前、SARS-CoV-210 およびワクチンで予防可能な疾患11 に対する抗体応答の検出にこの技術を適用し、マルチプレックス アッセイが血清有病率およびサーベイランス研究にとって非常に貴重なツールを構成することを示しました。このプロジェクトの目標は、FMIA の使用をアルボウイルスに属する複数の抗原に対する抗体応答の検出に拡張し、アフリカ地域のサンプルをスクリーニングにアッセイを適用することを目的として行うことです。
マルチプレックス技術を使用したアルボウイルスマルチプレックスアッセイは、非構造タンパク質1(NS1)12,13またはエンベロープドメインIII(EDIII)14などの異なる抗原標的を使用して、他の場所で説明されています。26のアルボウイルス抗原(NS1、EDIII、ウイルス様粒子(VLP)、およびその領域で共循環している病原体を検査するための他の複数の抗原を含む50プレックスアッセイが提示されます。このアッセイにより、これらの病原体の伝播強度を評価できます。アッセイの開発に使用される組換え抗原の要約を表1に示します。このレポートで提示されたプロトコルは、アルボウイルスの検出の最適化に焦点を当てた広範なメソッド開発研究を補完するために開発されました。
通常、マイクロスフェアビーズへの抗原のカップリング(または固定)は、シングルチューブ8 (手動カップリング)で行われる。このプロセスは時間がかかり、面倒で、再現性エラーが発生しやすいです。この記事では、ビーズへの抗原の化学的結合に関与する連続したステップを実行するために、自動化された機器を使用したプロトコルを報告します。この原稿では、新しいプロトコルの検証のために実行された手順を報告します。新しいプロトコルの検証は、手動法または自動プロトコルのいずれかで調製された抗原共役ビーズを使用して、50プレックスFMIAで測定されたIgG応答を比較することによって実行されました。この方法のさらなる検証は、アフリカとフランスのコホートからのヒト血清サンプルを分析することによって行われました。
自動ビーズカップリングプロトコルは高速で、1回の実行で最大96種類の分析種を同時にカップリングできます。さらに重要なことは、結果が確立された手動プロトコルを使用して得られた結果と同等であり、バッチ間のばらつきが減少していることです。
プロトコル
ヒトサンプルの使用について適切な倫理承認が得られました。サンプルは、以前の研究からの匿名化された残差でした。「標準プール」ORPAL サンプルの使用プロトコルは、スリナム国家倫理委員会 (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek)、意見番号 VG 25-17) によって承認されました。マダガスカルからのサンプルの使用は、 ロンドン衛生熱帯医学大学院の倫理委員会 (28541) および マダガスカル Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale (135MSANP/SG/AMM/CERBM ) によって PvSTATEM プロジェクトの一環として承認され、セネガルのサンプルの使用は、 セネガル国民健康研究倫理委員会 (CNERS Sénégal) によって進行中の Dielmo および Ndiop プロジェクトの一環として承認されました.これらのサンプル中のNTDsに対する抗体を測定する承認は、CNERS Sénégal(N 00000007 MSAS/CNERS/Sec)によって付与されました。フランスの非風土病サンプルは、フランスの病院の検査室での定期的な医療検査から得られ、フランスのデータ保護委員会(Commission Nationale de l'Informatique et des Libertes)の既存の規制とガイドラインに従って処理されました。ヒト血清サンプルは、アルボウイルスの有病率が高い地域の被験者と素朴なフランス人集団から採取されました。血清サンプルは、使用前に56°Cで30分間インキュベートすることにより、熱不活化しました。サンプルが不活化されていない場合は、安全キャビネットの下で操作してください。社内で合成されたEDIII組換えタンパク質を除き、ほとんどの組換え抗原は市販されています。データ収集には、イメージングベースの分析装置9 が使用されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。
1. カップリングに最適な抗原濃度を決定する
注:光退色を防ぐために、手順全体を通してマイクロスフェアビーズの光への曝露を最小限に抑えてください。バルクカップリングの前に、手動カップリングプロトコルを使用して各抗原のカップリング濃度を最適化します。プロトコルは、Angeloni et al.8 から適応されました。緩衝液と溶液については、 補足表1に詳述されています。
- カップリングに使用するビード領域を選択します。20秒間徹底的に渦を巻きます。チューブを最低60秒間超音波処理します。
- 200 μL(2.5 Mビーズ)のビーズを1.5 mLチューブに移します。
- ビーズを200 μL 100 mMリン酸一塩基性ナトリウム/0.125x Tritonで洗浄します。
- チューブを磁気チューブセパレーターに60秒間置きます。ビーズに触れずに慎重に上清を取り除きます。
- 一塩基性リン酸ナトリウム緩衝液を加えます。磁気ラックに60秒間放置します。上清を取り除きます。
- 80 μLの100 mM一塩基性リン酸ナトリウム、0.125x Triton、10 μLのスルホ-NHS、および10 μLのEDCを含むバッファーでビーズを活性化します。
- 一塩基性リン酸ナトリウム-スルホ-NHS-EDCをチューブに加えます。ローラーで室温で暗所で20分間インキュベートします。
- ビーズを250 μL PBS(1x)および0.125x Tritonで洗浄します。洗濯を3回繰り返します。
- 抗原を結合します。
- 抗原の異なる濃度(連続希釈)を、総容量1 mLの1x PBSおよび0.125 x Tritonで調製します。少なくとも2つの濃度の抗原をテストします。
- 活性化されたビーズに抗原溶液を加えます。室温で暗所で2時間、またはローラー上で4°Cで一晩インキュベートします。
- 結合ビーズを500 μL PBS-TBNおよび0.125x Tritonで洗浄します。洗浄を3回繰り返します。
- 結合ビーズを1 mLのPBS-TBNおよび0.125x Tritonに再懸濁します。
注:結合ビーズは、使用前に少なくとも24時間4°Cで保存してください。結合ビーズは、24時間後の試験と比較して、結合直後に試験した場合にMFIの変動性を示しました。 - その後の大規模カップリングで使用する最適な濃度を選択します。標準プールでのイムノアッセイには、異なる結合ビーズを使用します。線形標準曲線が得られた最低濃度を選択します。
注:標準プールに対する抗体応答の直線性の例は、結果セクション( 図1)に記載されています。
2. 大規模自動ビードカップリング
- Pro Magnetic COOHビーズを準備します。
- 必要なビーズを計算する: 500 ビーズ/サンプルを使用すると、5000 サンプルに対して 250 万ビーズで十分です。
- 前述のように、カップリングに使用するビード領域を準備します。
- 必要な量のビーズを割り当てられたウェルに移します。250万個に対して、200 μLのビーズ(Luminexの標準濃度は1.25e7ビーズ/mL)を使用しました。
- 抗原を準備します。これは、抗原の正確な量を確保するための重要なステップです。
- 最適化後、必要な抗原の量を計算します。各抗原に使用される濃度を 表1に詳述します。
- 1.5 mLの微量遠心チューブで、十分な量の目的の抗原を1 x PBS / 0.125 Tritonと完全に混合して、合計1 mLにします。
- 試薬でプレートを準備します。次のように深さ96ウェルプレートを準備します。体積はウェルあたりで、250万ビーズカップリングで計算されます。
- プレート1(チップコーム):チップコームをロードします。
- プレート2(ビーズ):8 μLの0.125x Tritonと200 μLのビーズ対象領域を追加します。
- プレート3(Wash1):200 μLの100 mM一塩基性リン酸ナトリウム/ 0.125x Tritonを加えます。
- プレート4(活性化):80 μLの100 mM一塩基性リン酸ナトリウム/ 0.125 x Triton + 10 μLスルホ-NHS + 10 μL EDCを加えます。
- プレート5(Wash2):250 μLの1x PBS / 0.125x Tritonを加えます。
- プレート6(カップリング):1 mLの抗原溶液を割り当てられたウェルに移します。
- プレート7(Wash3):500 μLのPBS-TBN/0.125x Tritonを加えます。
- プレート8(最終プレート、結合ビーズを含む):1 mLのPBS-TBN + 0.125x Tritonを加えます。
- 自動プロセッサーで カップリング・サイクル の実行をセットアップします。
- 製造元の指示に従ってマシンの電源を入れ、プロトコルを設定します。必要なソフトウェアは、PC15にダウンロードできます。実行固有のパラメータについては、 補足表 2 に詳しく説明します。
- プレートをマシンの割り当てられたスロットにロードします。プロトコルを選択します。サイクルを開始します。プログラムを完了するまでの推定所要時間は2:50時間です。
- サイクルの終わり
- 製造元の指示に従って、マシンの電源を切ります。指示に従ってプレートをアンロードします。プレート8にビーズ(茶色のペレット)が含まれていることを目視で確認します。さらに、実行レポートが機器からエクスポートされます。
- カップリングされたビーズをプレート8から個々の1.5 mLチューブに移して保管します。結合ビーズは、使用するまで4°Cで保存してください。
- ビーズを数えます。
注:セルカウンターを使用しました。血球計算器を使用した手動カウントについては、Luminexクックブックマニュアル8を参照してください。- 徹底的にボルテックス結合ビーズ。10 μLを細胞計数チャンバーに移します。製造元の指示に従って、mLあたりのビーズ数を読み取ります。
- セルカウンター上の画像を可視化して集計を確認します。非凝集ビーズの代表的な画像については 、補足図1 を参照してください。
- 凝集体が存在する場合は、少なくとも5分間完全にボルテックスし、超音波処理します。カウントを繰り返す
注:ビーズカウント後、抗体応答の直線性を評価するために、標準プール上で共役ビーズの免疫測定を行うことにより、カップリング効率を評価しました。
表1:50プレックスに含まれる抗原のパネル。 このアッセイには、アルボウイルス感染症と同時循環病原体を検出するための複数の抗原が含まれています。125万ビーズのカップリングに使用される抗原の量が提供されています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
3. マルチプレックスイムノアッセイ
注:MFI測定プロトコルの詳細な手順は、それぞれのマニュアル9に記載されています。ビーズが光にさらされ、光退色のリスクを最小限に抑えるために、ビーズを冷蔵庫から取り出す前に、すべての溶液とサンプルが準備されます。
- プレートレイアウトを設定します。96ウェルプレートを使用し、標準プールの連続希釈液と、最初の行にブランク(バッファーのみ)を含めました。
- サンプルと標準物質を別の非結合プレートのPBTバッファーで希釈します。サンプルには 1:200 希釈液 (最終濃度 1:400) を使用しました。標準曲線では、標準血清プールの 1:50 希釈液 (最終濃度は 1:100) と 10 回の 2 倍の連続希釈液を使用しました。
- 総容量50 μL/ウェルで使用する結合ビーズの量を決定します。ウェルあたり各ビーズのビーズ500個を使用し、PBTバッファーで体積に調整しました。
- 結合したビーズ混合物を30秒間完全に渦状にします。少なくとも60秒間超音波処理します。
- マルチプレックスプレミックスに追加する各結合ビーズの体積を計算して、各分析種のビーズが等しくなるようにします。ビーズの体積は次のように計算されました:ウェルあたりのビーズの体積=ウェルあたりのビーズ数/ビーズ数。
注:プレミックスに必要なビーズとバッファー量の計算例を 補足表3に示します。 - 適切なビーズ抗原量を遠心分離管に移します。
- PBTで音量を調整します。
- プレミックスをよく混ぜます。
- 50 μLのプレミックスをイメージングマイクロプレート(ps、fボトムプレートなど)に分配します。
- 希釈したサンプルを50 μLビーズに加えます。
- プレートシェーカーで室温、700rpmで30分間混合します。
- プレートを次のように3回洗浄します(手動洗浄)。
- プレートを磁気ラックに室温で60秒間置きます。プレートをラックにしっかりと保持し、上清を廃棄します。
- 100 μL PBTバッファーを加えます。磁気ラックに60秒間放置します。洗濯を繰り返す
注:あるいは、プレートワッシャー16 を使用することもできます。ウォッシャーは次のように設定されました:1サイクルの浸漬、続いて3サイクル(吸引、分注、浸漬)、および最終サイクルの吸引。
- 上清を廃棄し、希釈した二次抗体50 μLを加えます。
- サプライヤーの指示に従って、二次抗体の原液を調製してください。二次抗体の1/120希釈液を使用した。二次抗体の容量は次のように計算されました:二次抗体の容量=総容量/希釈係数。
- 二次抗体を適切な量のPBTバッファーと混合します。よく混ぜます。洗浄したビーズに希釈した二次抗体50 μLを加えます。
- 室温、700 rpmでシェーカーで15分間インキュベートします。
- 前述のように3回洗浄します。
- ビーズを150 μLのPBTバッファーに再懸濁します。
- 室温、700 rpmでシェーカーで5分間インキュベートします。製造元の指示に従って機器をセットアップします9.
注:イメージャ装置に付属のxPONETTソフトウェア17 を使用しました。蛍光読み取りの設定は、収集量を50 μL、最小測定値50ビーズ、XYヒーターなし、分析タイプなし、次のように設定しました。
4. データ分析
- 検証の実行
- 最小ビード数に達したことを確認します。統計的に有効なMFIを得るには、ウェルあたり少なくとも35個のビーズが推奨されます8。
- ブランクおよびネガティブコントロールサンプルのMFI値が最小であることを確認します。
- 標準曲線をプロットして、標準のMFI値を確認します。これらは、ブランクおよび/またはネガティブコントロールサンプルよりも高いです。
- サンプルデータ分析
- データをCSVファイルとしてエクスポートし、Rソフトウェアを使用して外部で分析します。
結果
プロトコルの検証に従ったプロセスを説明するために、アルボウイルスの3つのファミリーを表す3つの抗原を選択しました:フラビウイルス(DENV1 NS1タンパク質)、アルファウイルス(CHIKV VLPタンパク質)、およびブニャウイルス(RVFV NP)。抗原は、曝露前集団(ORPAL)、フランス(非曝露)集団血清、およびアフリカ(セネガルとマダガスカル)の2つのコホートの標準プールでテストされました。
抗体応答の希釈直線性
ビーズカップリングに使用する抗原の濃度は、ORPALプールの連続希釈を使用して決定されました。線形標準曲線が得られた最低濃度として最適濃度を選択しました(データは示していません)。 図1 は、各抗原に最適な濃度での選択されたアルボウイルス抗原の直線性を示しています。カップリングの品質管理のために、結合ビーズの各バッチは、事前に選択された濃度を使用して、ORPAL標準プールで希釈直線性についてテストされました。
標準的な手動カップリングアッセイとの比較性
新しい自動プロトコルを使用して得られたデータと確立された手動結合の比較可能性を評価するために、手動結合と自動結合で得られた結果から生成された標準曲線を比較しました。 図2 は、両方のアッセイの平行直線性を示しています。MFI値は抗原によって異なります。
ビードカップリングバッチバリエーション
同じカップリングバッチからのテストの再現性が評価されたため、カップリングバッチの変動は、Levey-Jenningsチャート18を使用して評価されました。代表的な抗原と対照BSA共役ビーズを使用し、ORPAL標準プールでテストしました。 図3 は、19種類のプレートからのMFIを、抗原ごとに異なる日にテストしたものです。結果として得られるMFIは、3つの抗原と対照の平均±3SDの範囲内に収まります。
MFIに及ぼす多重化の影響
アッセイの性能をさらに評価するために、いくつかの抗原のマルチプレックスが測定された抗体応答に影響を与えるかどうかをテストしました。応答は、ORPAL標準プールを使用して単一の抗原(またはシングルプレックスビーズ)と比較されました。 図4 は、MFIを単一の抗原または50の抗原を含むプレミックスから測定した場合に得られた結果の間に強い相関関係(R = 0.99、p < 2.2e-16)を示しています。
アフリカ集団におけるヒト血清サンプルからの抗体応答
多様なコホートのサンプルへのアッセイの適用性を評価するために、アルボウイルスへの曝露の可能性が高いアフリカ集団からのヒト血清サンプルの抗体応答を、おそらくこれらのウイルスへの曝露が低いフランスのコホートからの抗体応答と比較しました。合計で、マダガスカルでは1,596サンプル、セネガルでは1,428サンプル、フランスコホートでは84サンプルが検査されました。 図5 は、さまざまなコホートの密度プロットを示しています。セネガルのコホートでは、CHIKV VLP に対する反応についてデータの明確な二峰性分布が観察され、集団における CHIKV に対する 2 つの異なる反応が示唆されています。セネガルのコホートでは、DENV1 NS1 と RVFV NP でも微妙なバイモーダルテールが観察されますが、フランスとマダガスカルのコホートの間に差はありません。
図1:ORPAL標準プールでテストされた抗体応答の直線性。 選択されたアルボウイルス抗原を例として示します。蛍光強度の中央値(MFI)はy軸(対数スケール)に示され、x軸には標準プールの連続希釈が表示されます。パネル内のすべての抗原は、サンプルのバルクテストの前に、標準プールで事前テストされました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カップリング法による抗体応答の平行線形性。 ORPAL標準プール(x軸)の連続希釈液でテストされた代表的な抗原(ファセット)のMFI(y軸)のログ。色は、自動化(赤、緑、青)と手動(紫)のさまざまな結合方法を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:プレート間の変動。 BSA結合ビーズ(コントロール)、DENV1 NS1、CHIKV VLP、およびRVFVのLevey_Jenningsプロットは、1:400の濃度のORPAL標準プールについて示されています。結果は、異なる日に実行された19のプレートを表しています。MFI は y 軸に表示され、テストの数は x 軸に表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:モノアッセイおよびマルチプレックスアッセイに対する抗体応答の相関関係。 標準プールを最終濃度1:400で希釈し、50プレックス抗原を含むプレミックスと単一の抗原コーティングビーズを並行してテストしました。ピアソン相関を分析に使用しました。3つの代表的な抗原を例として示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:サンプルの風土病および非風土病コホートへのアッセイの適用。 このアッセイは、マダガスカル(緑)、セネガル(青)、フランス(赤)のサンプルでテストされました。サンプルを最終濃度 1:400 で希釈しました。X軸は正規化MFI(nMFI)を表し、同じ濃度(1:400)でのサンプルMFIと標準プールMFIの比率として計算されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:ビーズ凝集の代表的な画像の例。 パネル(A)は非凝集ビーズ、パネル(B)はビーズ凝集体を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:バッファーの表。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:KingFisher Apexビーズカップリングプロトコル設定。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表3:プレミックスのビーズ量の計算例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
FMIA の使用により、血清学的検査の状況が変わりました。このアッセイの強みは、1回の反応で複数の抗原に対する抗体応答を評価できることにあり、結果が出るまでの時間が短縮され、検査コストが削減されます。これは血清学的サーベイランスにおいて特に重要です。ただし、FMIAアッセイの日常的な使用は、反応ごとに単一の抗原を処理する必要がある、労働集約的で時間のかかる手動ビーズカップリングステップによって妨げられます。このレポートは、抗原をビーズに化学的に結合させるための自動化された方法を紹介します。この自動化により、1回の実行で最大96個の抗原を同時に結合できるため、ハイスループット抗原結合に必要な時間が大幅に短縮されます。
図1 は、抗原がビーズに正常に結合したことを示しています。結果はまた、新しい自動プロトコルと確立された手動プロトコルとの間に強い並列性を示しており(図2)、評価された抗原に対するIgG応答の検出における精度が劣らないことを示しています。プレート間(図3)とビーズカップリングバッチ変動(図2)の結果は、自動カップリング法を使用した場合のデータの比較可能性を示しています。マルチプレックスMFIとシングルプレックスMFIの高い相関関係(図4)は、多数の抗原をマルチプレックスしても、このアッセイで使用される個々の抗原のセットに対する抗体応答に影響を与えないことを示しています。
アッセイの検証のために、風土病コホートと非風土病コホートの両方からのサンプルがテストされました(図5)。アフリカではアルボウイルスの血清有病率研究はまだ不足していますが、入手可能なデータ19、20、21、22 は、個々の国間および国内で変動する IgG 血清有病率の微妙な状況を示唆しています。特に、既存のデータは、セネガルではマダガスカルと比較して3つのウイルス(チクングニア熱、デング熱、リフトバレー)の有病率が高いことを示唆しており、たとえば19です。これらの有病率は、他のコホートと比較した場合、セネガルのさまざまな抗原に対する明確で明確な反応を示したこの報告の観察と一致しています。これは、血清有病率が比較的高い状況で抗体プロファイルを区別するアッセイの能力を裏付けています。マダガスカルコホートの観察データは、サンプル収集サイト22におけるウイルスの有病率の低さが報告されていることによって説明される可能性がありますが、非流行コホートとのデータの比較可能性は、フランスのコホートのサンプルサイズが小さいことによって部分的に説明される可能性があります。さらに、報告された地域間の変動性は、データセットで観察された違いを説明する可能性があります。IgG 血清有病率を評価するための広範な研究が必要です。ただし、このレポートで提示されたデータは、開発されたアッセイが評価されたアルボウイルス抗原に対するIgG応答を検出するために特異的であり、風土病地域からのデータと、同じ集団内の微妙で異なる応答を区別することを示しています。
主な技術的課題には、非常に少量の使用にもかかわらず均質な抗原溶液の達成、プレミックス中のビーズ領域の等モル表現の確保、ビーズ凝集の最小化などが含まれていました。96ウェルプレートで均一な溶液を達成することの難しさを克服するために、すべての抗原溶液をプレートに分配する前に1.5 mLチューブで完全に予混合するステップが実装されました。さらに、結合ビーズをカウントし、プレミックスに同数のビーズ領域が追加されるようにボリュームを調整するステップが追加されました。ビーズの混合を容易にし、プレミックス内の凝集を最小限に抑えるために、超音波処理ステップも含まれていました。
この限定的な研究では、すべてのサンプルがビーズカップリングから1か月以内にテストされたため、結合ビーズの安定性とアッセイ性能への影響は評価されませんでした。この評価はこのレポートの範囲を超えており、将来の研究で評価される予定です。これらの制限にもかかわらず、このレポートは、アルボウイルスを含むさまざまな病原体に対する抗体応答を検出するための迅速かつ信頼性の高い方法を提示します。アルボウイルス感染症の血清学的サーベイランスは、疾患を制御するために不可欠であり、これらのウイルスに対する抗体反応を検出するための再現性のある迅速な方法が利用可能になったことは、感染の不均一性を評価し、これらの感染症の負担を軽減するための標的介入を評価する世界的な取り組みの大幅な進歩を表しています。さらに、このレポートの焦点はアルボウイルスにありますが、このプロトコルは幅広い抗原に広く適用でき、この分野における大きな進歩を表しています。
開示事項
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
著者らは、各研究施設の研究参加者と地域医療従事者に心から感謝します。また、サンプル収集、データ収集、および実験室分析におけるすべての研究所および現場スタッフの献身的な努力に感謝します。この研究は、ウェルカム・トラストからのアフリカ全域のアルボウイルスの伝播強度と気候変動への介入の影響(xSTAR)助成金の再構築によって支援されました[228185/Z/23/Z]。オープンアクセスの目的で、著者は、この投稿から生じる著者が承認した原稿バージョンにCC BYパブリック著作権ライセンスを適用しました。また、サンプルの使用許可をいただいた方々にも感謝いたします:Rob Van Der Pluijm(パリ・パスツール研究所感染症疫学・分析)、Maylis DouineとAlice Sanna(Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane、Centre Hospitalier de Cayenne、カイエン)。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ | - | 一般実験用消耗品 | |
| 1000 mL フィルターユニット 0.2 um | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 567-0020 | |
| 25 mL貯留槽およびnbsp; | 熱力学 | 95128095 | |
| 50 mLFalcon チューブ | - | 一般実験用消耗品 | |
| 96枚の深い井戸板 - キングフィッシャーDW | 熱力学 | 10373480 | |
| 自動プレートワッシャー(オプション) | テカン | HydroFlex Plusマイクロプレートワッシャー | |
| B百日咳FHA | ネイティブ抗原 | 血圧-FHA-50 | |
| バランス | - | 一般実験機器 | |
| ベンチ遠心分離機 | - | 一般実験機器 | |
| BioPlex Pro 磁気 COOH ビーズなど; | ルミネックス | MC10xxx (x=ビーズ領域) | |
| 牛血清アルブミン、BSA | シグマ | A7906 | |
| ブランソン・ウルトラソニック ブランソニック超音波クリーナー モデルB200 | フィッシャー・サイエンティフィック | 15-337-22 | |
| BSA | シグマ・オルドリッチ | A7906 | |
| CCHFグランティア | ネイティブ抗原 | REC31639-100 | |
| 細胞計数器/血球計 | バイオラッド/メルク | TC20 /Z359629 | |
| CHIKV E2 | ネイティブ抗原 | REC31617-100 | |
| CHIKV VLP | ネイティブ抗原 | チクヴ-VLP-100 | |
| 透明なフラットボトム免疫非滅菌96ウェルプレート | 熱力学 | 3455 | |
| CMV粒子 | ネイティブ抗原 | CMV-HP-100 | |
| カウントスライド、セルカウンター用の二重チャンバー、nbsp; | バイオラッド | L003662 A | |
| CP23 | ネイティブ抗原 | 生産プロット | |
| CT694 | ネイティブ抗原 | 生産プロット | |
| CtxB | |||
| DENV1 EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| DENV1 NS1 | ネイティブ抗原 | デンヴ1-NS1-100 | |
| DENV1 VLP | ネイティブ抗原 | デンヴックス4-VLP-100 | |
| DENV2 EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| DENV2 NS1 | ネイティブ抗原 | DENV2-NS1-100 | |
| DENV2 VLP | ネイティブ抗原 | デンヴックス4-VLP-100 | |
| DENV3 EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| DENV3 NS1 | ネイティブ抗原 | DENV3-NS1-100 | |
| DENV3 VLP | ネイティブ抗原 | デンヴックス4-VLP-100 | |
| DENV4 EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| DENV4 NS1 | ネイティブ抗原 | デンヴ4-NS1-100 | |
| DENV4 VLP | ネイティブ抗原 | デンヴックス4-VLP-100 | |
| ジフテリア毒物 | ネイティブ抗原 | DIP-TNL-100 | |
| EBV-GP125 | ネイティブ抗原 | REC31601-100 | |
| EDC | シグマ | 03449 | |
| エタノール 100% | - | 一般検査 | |
| フィルムアルミニウムシール 非滅菌 | - | 一般 | |
| 蛍光イメージング装置 - MAGPIXシステム | ルミネックス | MAGPIX-XPON4.1-CEIVD | |
| プレート用ハンドヘルド磁石 - 磁気96ウェルセパレーター | ルミネックス | CN-0269-01 | |
| HEV-ORF2 | ネイティブ抗原 | REC31653-100 | |
| 稲羽OSP | Boston_MGH | - | |
| キングフィッシャー・ディープウェル96井戸の先端コーム | 熱力学 | 17170069 | |
| リーシュマニアK28 | クリニサイエンス | MBS3040095 | |
| ルミネックスMAGPIXキャリブレーションキット | ルミネックス | MPX-CAL-K25 | |
| ルミネックスMAGPIX検証キット | ルミネックス | MPX-PVER-K25 | |
| 磁気管分離器 | インビトロジェン | ダイナマグ | |
| MAGPIXドライブフルードプラス | ルミネックス | 40-50030 | |
| はしか国立公園 | ネイティブ抗原 | REC31796 | |
| マイクロプレートシェーカー | ランドックス | ||
| マイクロプレート、96ウェル、PS、F底(煙突井戸) | グライナー-バイオ1 | 655096 | |
| ミリク H20 | - | 一般検査 | |
| マルチチャネルピペット10、300 | サルトリウス | ||
| ニ | ネイティブ抗原 | 生産プロット | |
| 小川OSP | Boston_MGH | - | |
| ONNV E2 | クリニサイエンス | IT-022-006エピソード | |
| 粒子処理装置 | 熱力学 | サーモサイエンティフィック キングフィッシャーフレックス | |
| PBS 10x PH~7.0 | ユーロメデックス | ET330 | |
| PE結合抗ヒトIgG Fc二次抗体 | ジャクソン免疫研究 | 709-116-098 | |
| PfAMA1 | 社内制作 | - | |
| PfMSP1 | ネイティブ抗原 | REC32013-100 | |
| PGP3 | ネイティブ抗原 | 生産プロット | |
| ピペットチップ(サプライヤー)10 & micro;L、200 & micro;L、1000 & micro;L | - | 一般実験用消耗品 | |
| Pm MSP1 | クリニサイエンス | CUST-PRT-31102024-1B | |
| ポーランドMSP1 | クリニサイエンス | CUST-PRT-31102024-1A | |
| PvMSP1 | ネイティブ抗原 | REC31724-100 | |
| RソフトウェアR4.4.1 | - | - | |
| RVFV NP | ネイティブ抗原 | REC31640-100 | |
| シングルチャネルピペット 10p、20p、200p、1000p | エッペンドルフ | ||
| パチン | 社内制作 | - | |
| S-NHS | シグマ | 56485 | |
| アジ化ナトリウム | シグマ | S2002 | |
| 次亜塩素酸ナトリウム溶液(漂白剤) | - | 一般的な家庭用漂白剤 | |
| 破傷風毒素 | ネイティブ抗原 | REC31801-100 | |
| サーモサイエンティクス BindIx ソフトウェアバージョン 1.1 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | - | |
| トリトン | サーモ・サイエンティフィック | A16046 | |
| チューブローラー | イカ | ローラー6D -100219627 | |
| トゥイーン-20 | シグマ | P7949 | |
| USUV EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| USUV NS1 | ネイティブ抗原 | USUV-NS1-100 | |
| ボルテックス | - | 一般実験機器 | |
| VSP3 | ネイティブ抗原 | 生産プロット | |
| VSP5 | ネイティブ抗原 | 生産プロット | |
| WNV EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| WNV NS1 | ネイティブ抗原 | WNV-NS1-100 | |
| xPONENTソフトウェア | ルミネックス | 89-30000-00-759 レヴA 5月19日 | |
| YFV EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| YFV NS1 | ネイティブ抗原 | YFV-NS1-100 | |
| ジクヴ EDIII + SNAP | 社内制作 | - | |
| ZIKV NS1 | ネイティブ抗原 | ZIKV-NS1-100 | |
| ZIKV VLP | ネイティブ抗原 | ZIKV-VLP-100 |
参考文献
- Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
- Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
- World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
- Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
- Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
- Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
- Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
- Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
- Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
- Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
- Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
- Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
- Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
- Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
- KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
- Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
- XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
- Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
- Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
- Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
- Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
- Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).
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