オルガノイド研究のための単細胞シードヒト腸オルガノイド

サマリー

私たちは、単細胞シード患者由来の腸オルガノイドを生成するプロトコルを提示し、異質性を低減し再現性を向上させる標準化された培養液を提供し、下流のアッセイや精密医療の応用に活用します。

要約

最近のオルガノイド技術の発展により、患者由来の腸オルガノイド(PDIO)が創出され、元の組織の構造的、機能的、遺伝的、エピジェネティックな特徴を再再現できるようになりました。しかし、従来の通過由来オルガノイドは、サイズや数が不均一な集団を生み出すため、同じ条件下でも結果が一貫性に欠ける。これに対処するため、ここで「単一細胞シードPDIO」と呼ばれる標準化されたアプローチが確立されました。この方法では、成熟したPDIOを酵素的に解離して単一細胞に分解し、定められた数で96ウェルプレートの個々のウェルにシードしました。この制御されたシーディングにより、PDIOのサイズと数が正規化されました。通過由来オルガノイドと比較して、単細胞シードPDIOはオルガノイド数の孔間変動および井戸内のオルガノイドサイズの変動が低減し、生成効率の決定と生存可能性アッセイの再現性向上に寄与しました。さらに、このプラットフォームはトランスクリプトミック解析やタンパク質発現プロファイリングを含む下流解析にも互換性があります。このアプローチは総合的に見て、実験の一貫性を高め、再現性のあるPDIOに基づく研究の実用的な基盤を提供する可能性があります。

概要

ヒト腸は、腸内細菌叢、腸上皮、^免疫系の精密な相互作用によって定義される非常に複雑な生態系です。これらの成分は厳密に調整されたシグナル伝達ネットワークを通じて腸の恒常性を維持します。例えば、腸内微生物群は10兆以上の微生物から成り、免疫細胞と相互作用して免疫システムの活動を調整し、腸内環境のバランスを保っています²。腸上皮はこの微生物叢と免疫系のクロストークを媒介する上で重要な役割を果たします(^3,4)。腸幹細胞(ISC)は上皮再生の主要な推進力であり、継続的に再生し、特殊な細胞タイプへと分化します。これには、分泌細胞系統(パネス細胞、ゴブレット細胞、腸内分泌細胞、タフト細胞)、吸収性腸球、マイクロフォール^{ド細胞などが含まれます。}これらの細胞は共に重要な物理的障壁と機能的インターフェースを形成し、炎症刺激から宿主を守る。

近年、PDIOはトランスレーショ^{ナルリサー}チにおいて強力なプラットフォームとして台頭しています。これらの三次元(3D)培養は、患者組織から分離されたISCから作られ、細胞外マトリックス(ECM)などの細胞外マトリックスで維持され、ISC^ニッチ8,9を再現する定義された成長因子とともに維持されます。特に、PDIOはドナー組織の遺伝的およびエピジェネティックな特性を保持し、持続的な増殖と再現性のある実験を可能にします。Satoらがロイシンリピート含有Gタンパク質結合受容体5⁺(Lgr5⁺)ISCs^からPDIOを初めて開発して以来、その後の研究でPDIOの生成と分化に必要な成長因子が特定され、研究室で広く採用されるプロトコルが確立^{されました。}.しかし、候補薬剤でPDIOを治療する実験環境は研究ごとに大きく異なり、しばしば十分に記述されていません。14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^、 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44^{,45、46、47}。さらに、PDIOは通常機械的破壊によって通過されるため、オルガノイドの大きさ、形態、空間配置に異質性が生じます。このばらつきは、薬剤の応答性やその分子メカニズムの正確な評価を複雑にしています。この制限に対処するため、最近の研究では単一細胞懸濁または選別単一細胞45,48,49,50,51,52,53,54から導出されたPDIOが開発されています。

本稿では、補完的かつ実用的な手法の一つとして、「単一細胞シードPDIO」を導入し、従来のECMと培地を用いて単一細胞懸濁から標準化されたPDIOを生成する方法を紹介し、正確かつ再現性の高いアッセイを可能にします。簡単に言えば、成熟PDIOから分離された単一細胞を特定の細胞密度でECMに埋め込み、その結果得られた培養物を2週間にわたってモニタリングしながら、数、サイズ、形態を定量化しました。各ECMドームには既知のセル入力が埋め込まれているため、井戸ごとのオルガノイド数は一貫しており、生成効率を各オルガノイドライン^49,54の再生能力の読み取り値として計算できます。ドーム型マトリジェルは、その本質的な不安定性と限られた拡散から生じるWnt3a濃度の空間勾配によりサイズ異質性を生じ^ますが、単細胞シードPDIOにおけるウェル間サイズの変動は、通過由来オルガノイドよりも著しく低い^49,54です。しかし、この方法には実用的な限界もあります。蛍光活性化による細胞選別がない場合、一部のオルガノイドは二重項や三重項から生成され、PDIO内に固有の生物学的異質性が生じます。また、生成効率の違いにより、各オルガノイド系統の最適な単一細胞数を経験的に決定する必要があります。最後に、完全分化された単一細胞シードPDIOに対して、定量逆転写PCR(qRT-PCR)、ウェスタンブロット、免疫組織化学などの下流解析が行われました。

プロトコル

実験に必要なすべての材料と試薬は 材料表に記載されています。

1. 試薬および材料の調製

1. オルガノイド培養皿を37°Cのインキュベーターで90分以上予温します。
   注:培養プレートの予備加熱はECMの固化とドーム形状の維持に役立ちます。ECM重合に必要な最小時間は90分です。プレートは12時間以上予温されることを強く推奨します。
2. オルガノイド培養培地として、0.5%ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)を補足したオルガノイド培養培地(EXP)を使用します。
3. 単細胞シードPDIOの分化には、基礎培地に成長因子を補う分化培地(DIF)を使用します(表1)。基礎培地は、0.5%PS、0.25%ゲンタミシン硫酸塩、1%グルタミンを補足した高度なDMEM/F12と、以下の成長因子で構成されています:ノギン(100 ng/mL)、R-スポンディン-1(1 μg/mL)、Wnt3a(100 ng/mL)、表皮成長因子(EGF;50 ng/mL)、N-アセチル-L-システイン(1 mM)、[Leu¹⁵]-ガストリンIヒト(10 nM)、A 83-01(500 nM), インスリン様成長因子1(IGF-I;200 ng/mL)、線維芽細胞成長因子(FGF;100 ng/mL)、およびB-27サプリメント(1倍)(表1)。
   注意:PSとゲンタミシンは生物的危険性があり、手袋と目の保護具を着用して取り扱う必要があります。
4. 細胞回収液(CRS)を新たに準備し、バッファー(DMEM高グルコース1%BSA)、1 mM Y-27632、EXP、DIFを洗浄し、使用まで氷で保管してください。
   注意:予温培養プレートに加える前に、EXPとDIFを室温に少なくとも20分間平衡させてください。
5. ECMは氷の上で解凍し、常に冷蔵保存してください。
   注意:ECMは氷上で解凍する必要があり、早期重合を防ぐために常に冷蔵保存が必要です。
6. 酵素解離試薬を室温に平衡させます。試薬を37°Cの水浴で予温してから塗布します。
   注意:酵素解離試薬は刺激物であり、適切な個人用防護具を用いて取り扱う必要があります。

2. 凍結保存PDIOの解凍と回収

1. 液体窒素タンクからオルガノイド入りのクライオビアルチューブを回収してください。チューブキャップを少し緩め、37°Cの水浴で60〜90秒解凍します。
   注意:解凍後はすぐにチューブを氷に移してください。
2. ワイドボアピペットの先端を洗浄バッファーで予湿させ、クライオビュアルチューブからオルガノイドを50mLチューブに移します。
3. クライオビアを1 mLの洗浄バッファーで洗い流し、残りの内容物を50 mLチューブに移します。このすすぎの手順を2回繰り返します。
4. 遠心分離機で290 × g 、4°Cで7分間。 チューブの底にペレットが見えるようにしてください。
5. 上清液を吸引してください。
6. 広口径の事前湿潤ピペットチップを使ってECMで再懸濁します。
7. 事前に加熱された24ウェルプレートにECMを点滴し、37°Cで10分間培養します。
   注意:1ウェルあたり30μLのECMを使用してください。
8. EXPを加え、井戸の周囲を無菌のリン酸塩緩衝塩水(PBS)または蒸留水で囲みます。
   注意:1井戸あたり500μLのEXPを使用してください。EXP培養は最初の3日間は10μMのY-27632を補足し、その後Y-27632なしのEXPに切り替えました。

3. PDIOの通過

1. 使った経験値を吸引してください。
2. ワイドボアのピペット先端を洗浄バッファーで予湿らせ、細胞解離試薬1mLを加えてECMを剥離し、内容物を15mLチューブに移します。
3. チューブをロッカーの上で室温で10分間孵化させます。
4. 遠心分離機で300 × g 、4°Cで7分間。
5. 上清液を脱出し、洗浄バッファー1mLを加えます。20回の再停止。
6. さらに洗浄バッファー1mLを加え、20回再懸浮させて50mLチューブに移します。
7. 遠心分離機で300×g、4° Cで7分間。
8. 上清液を吸引してください。
9. 広口径の事前湿潤ピペットチップを使ってECMで再懸濁します。
10. 事前に加熱された24ウェルプレートにECMを点滴し、37°Cで10分間培養します。
    注意:1ウェルあたり30μLのECMを使用してください。
11. EXPを加え、井戸の周囲を無菌のPBS1倍または蒸留水で囲みます。
    注意:1井戸あたり500μLのEXPを使用してください。EXP培養は最初の3日間は10μMのY-27632を補足し、その後Y-27632なしのEXPに切り替えました。

4. 単細胞シードPDIO培養

1. 使った経験値を吸引してください。
   注意:抗生物質を含む廃棄物(例:PSやゲンタミシンを含む使用済み培地)は、処分前にオートクレーブ処理してください。
2. 滅菌1xPBSを1mLで洗浄します。
3. ワイドボアピペットの先端を洗浄バッファーで予湿させ、300μLのCRSを加えてECMを剥離し、内容物を50mLチューブに移します。
4. 遠心分離機で300 × g 、4°Cで5分間使用(図1A)。
5. 上澄液を吸引し、洗浄バッファー3mLを加えて20回再懸濁します。
   注意:この工程は機械的にオルガノイドを破壊します。
6. 遠心分離機は300× g 、4°Cで5分間使用します(図1B)。
7. 上清液を吸引し、10 μM Y-27632を含む予温酵素解離試薬5 mLを加えます。2〜3回して37°Cの水浴で20分間孵化し、5分ごとにチューブを振る。
   注:デブリの集合体は通常、孵化から10分以内に現れます。酵素解離試薬の総処理時間を20分以内に制限してください。過剰消化は単一細胞の収量と生存能力を著しく損なうため、25分を超えてはいけません。
8. DMEM高グルコースを10mL追加します。
9. 遠心分離機は300× g 、4°Cで5分間使用します(図1C)。
10. 上清液を吸引し、洗浄バッファー1mLを加えます。20回の再停止。
    注:酵素解離試薬を含む廃棄物は、施設のバイオセーフティガイドラインに従い、廃棄前に0.5〜1%の漂白剤で少なくとも30分間不活化する必要があります。
11. 40μmのセルストレーナーを通し、新しい50mLチューブにフィルターを入れます(図1D)。
    注:このステップは成熟したオルガノイドから単一細胞を分離するために非常に重要です。単一細胞の分離には40μmのセルストレーナーを用いるべきです。
12. トリパンブルーを使って細胞数を数えます。計算された容量を1.5mLのチューブに移します。
    注:事前に加熱された96ウェルプレートで、1ウェルあたり3,000〜4,000個のセルをプレートします。
13. 遠心分離機は300× g で4°Cで5分間過ごします(図1E)。
14. ピペットで上澄液を除去します。
15. 広口径の事前湿潤ピペットチップを使って、細胞をECM(100〜500セル/μL)で再懸浮させます。
16. ECMを事前に温めた96ウェルプレートに点滴し、37°Cで10分間培養します。
    注意:1ウェルあたり10μLのECMを使用してください。
17. 井戸にDIFを加えましょう。井戸の周囲には無菌の1倍PBSまたは蒸留水を置いてください。
    注意:1井戸あたり150μLのDIFを使用してください。DIF培養は3日間10μM Y-27632を補足し、その後Y-27632なしのDIFに切り替えました。培地を3日ごとに交換し、合計10日間維持してください。

結果

単細胞シードPDIOを作成するために、NYUグロスマン医学部の機関審査委員会(炎症性腸疾患患者における粘膜免疫プロファイリング)のもと、2.8mm標準生検鉗子を用いた監視大腸内視鏡検査中に、同意した健康被験者から粘膜ピンチ生検を採取しました。S12-01137)。次に、成熟PDIOから分離された6,000個の細胞をECMに解離し、DIFで培養することで単細胞シードPDIOが生成されました。オルガノイドは単一細胞から発生し、6日目に芽状構造を形成し始めました(図2)。このアプローチの利点を評価するために、機械的破壊によって生成されるパセージ由来のPDIOと、1,000、3,000、または5,000細胞を植え付けたPDIOを確立し、EXPまたはDIF¹³で培養しました。オルガノイド形成は、解離した単細胞の入力数に比例していました(図3A)。EXPで培養されたオルガノイドは主に嚢胞構造を示し、主にISCとトラン...

ディスカッション

PDIOは、個々の患者の遺伝的およびエピジェネティックな状況を忠実に保存するため、精密な疾患モデリング、薬物スクリーニング、再生医療において大きな可能性を秘めています。しかし、オルガノイド生成や特性評価の標準化が困難であるため、実用的な応用はしばしば妨げられています。これらの課題を克服するために、単一細胞懸濁液または単一細胞由来のPDIOを用いたアプローチが最近の研究45,48,49,50,51,52,53,54で導入されています。従来のEC...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
[Leu15]-ガストリン I 人間	シグマ・オルドリッチ	G91450-0.1mg
15 mL円錐形チューブ	SPL	50015
20倍PBS、pH 7.4	ビオセサン	P2007-7.4
50 mL円錐形チューブ	SPL	50050
83-01	トクリス	2939-10mg
高度なDMEM/F-12	ギブコ	12634010
アクシジェン1000とマイクロ;L型ピペットの先端、ワイドボア、クリア、無菌	アクシゲン	T-1005-WB-C
アクシジェン200 &マイクロ;L型ピペットの先端、ワイドボア、クリア、無菌	アクシゲン	T-205-WB-C
B-27サプリメント(50X)血清フリー	ギブコ	17504044
牛血清アルブミン	ロッシュ	10735078001
コーニング96ウェルクリアポリスチレンマイクロプレート	コーニング	3599
コーニングセルの回復ソリューション	コーニング	354253
コーニングECMマトリックス(コーニング・マトリゲル)	コーニング	356231
Costar 24ウェルクリアTC処理済み多重ウェルプレート	コーニング	3526
DMEM高グルコースと安定グルタミン、ピルビン酸ナトリウム	バイオウエスト	L0103-500
ゲンタミシン	ギブコ	15750060
穏やかな細胞解離試薬	幹細胞	100-0485
ヒトFGF-塩基性(FGF-2/bFGF)(154 aa)組換えタンパク質	ギブコ	100-18B-100UG
ヒトIGF-I、動物性を持たない組換えタンパク質	ギブコ	AF-100-11-500UG
ヒトノギンタンパク質	アクロバイオシステム	ノンH5219-1mg
ヒトR-スポンディン1 / RSPO1(21-146)タンパク質	アクロバイオシステム	RS6-H4220-1mg
インテスティカルトオルガノイド成長培地(ヒト)	幹細胞	6010
L-グルタミン100X	バイオウエスト	X0550-100
マウスEGF組換えタンパク質	ギブコ	315-09-100UG
N-アセチル-L-システイン	シグマ・オルドリッチ	A9165-5 g
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液100X	バイオウエスト	10022-100
組換えヒトWnt3a代理母	アクロバイオシステム	WNE-W5253-50ug
トリプLE(酵素解離試薬)は酵素(1X)を発現し、フェノールレッド なし;	ギブコ	12604013
Y-27632ジヒドロクロライド	トクリス	1254-10MG