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方法論記事

腎臓近位尿細管細胞におけるミトコンドリア分裂/融合ダイナミクスの評価

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⸱

DOI：

10.3791/69268

⸱

2025年11月14日

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

この記事について

サマリー

この記事では、共焦点顕微鏡とImageJを使用して、Dendra2光スイッチング蛍光 を介して ミトコンドリアの分裂/融合ダイナミクスを評価する方法について説明します。

要約

ミトコンドリアは、ATP 合成における役割で最もよく知られており、細胞代謝の重要な調節因子として機能します。ミトコンドリアのダイナミクスは、ミトコンドリアの細胞内および細胞間運動、および分裂/融合のプロセスを理解します。これらのイベントは、細胞の恒常性、形態、生体エネルギー学、品質管理、およびストレス応答を維持することにより、ミトコンドリア機能を維持するための基礎です。一方、ミトコンドリアのダイナミクスの調節不全は、細胞の形態と機能に影響を与えます。ミトコンドリアの分裂/融合イベントの正確な測定は、細胞の健康状態を示す可能性があります。ミトコンドリアのダイナミクスを測定するための現在の方法論では、超解像顕微鏡、接続性のための蛍光技術(光退色後の蛍光回収(FRAP))、時空間制御のための光遺伝学的ツールなどの高度なイメージングが採用されています。定量分析では、計算ツールを利用して、核分裂/核融合バランスを示す長さ、数、分岐などのパラメータを測定します。ただし、これらの方法にはスキルと高度な機器が必要です。この記事では、ミトコンドリアのシトクロムcにタグ付けされたdendra2タンパク質の光スイッチング特性を使用して、核分裂/融合イベントを研究するために、ImageJ(フィジー)で無料で使用できるツールと組み合わせた共焦点顕微鏡の使用について説明します。

概要

ミトコンドリアは、エネルギー生産、細胞死、シグナル伝達に重要な役割を果たす動的な細胞小器官です1。ミトコンドリアの形態とは、ミトコンドリアコンパートメントのサイズと形状を指し、細胞内および細胞外の状態に非常に敏感であり、細胞の健康を維持するために重要です2。ミトコンドリアの形態は、ミトコンドリアの機能に関する重要な洞察を提供しますが、ミトコンドリアの形状の変化は、細胞代謝と全体的な健康に影響を与える可能性があります3。ミトコンドリア形態の破壊は、神経変性疾患、がん、代謝性疾患などのいくつかの疾患に関連しています4。ミトコンドリアの形態は、細胞の恒常性を維持し、さまざまな代謝要件に応答するために重要な融合および分裂/融合イベントによって動的に調節されます5,6。

ミトコンドリアのダイナミクスは、細胞小器官がさまざまなストレッサーや代謝要件に反応するのを助けます7。これには、継続的な分裂/融合、および細胞内または細胞間のミトコンドリアの移動が含まれます。ミトコンドリアは、分裂/融合イベントによる形態の変化を通じて細胞のエネルギー需要に適応します8。これらのプロセスはミトコンドリアの形状を決定し、エネルギー出力、活性酸素種(ROS)生成、ミトコンドリア品質管理などのミトコンドリア機能に影響を与えます7,9,10。さらに、ミトコンドリアの分裂/融合は、機能的なミトコンドリアネットワークを維持する相殺メカニズムです11。融合はミトコンドリア内容物の交換を可能にし、局所的な損傷に対する相補と緩衝を促進し、核分裂はマイトファジーを介して損傷したミトコンドリアの分離と除去を可能にします7,12。さらに、分裂はミトコンドリアの損傷した成分を分離するのに役立ち、それらは選択的オートファジープロセスであるマイトファジーによって除去されます13。一方、融合により、ミトコンドリア内容物の補完が可能になり、損傷した成分が希釈されます14。ミトコンドリアの分裂/融合の主要なプレーヤーは、ミトコンドリア外膜融合に不可欠なミトフシン(MFN1 / 2)です15,16、(OPA1):このダイナミン様GTPアーゼは、ミトコンドリアの内膜融合に関与しています16。核分裂タンパク質には、ダイナミン関連タンパク質1(Drp1)、核分裂促進タンパク質13,17が含まれます。ミトコンドリア分裂1タンパク質(Fis1)、ミトコンドリア分裂因子(Mff)、およびミトコンドリア分裂調節因子1様(MTFR1L)。ミトコンドリアの超微細構造を研究するために、超解像EMなどのいくつかの技術が使用されてきました18。STEDおよびMINFLUX超解像顕微鏡(ナノスコピー)と組み合わせた単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)を使用して、個々のミトコンドリアmRNAおよび関連タンパク質を視覚化しています18。単一分子局在顕微鏡(SMLM)技術は、膜間隔の変化を追跡します19。確率的光学再構成顕微鏡法(STORM)超解像顕微鏡法により、ミトコンドリア内膜複合体の研究が可能になります20。しかし、この高度な機器の使用は簡単にはアクセスできません。共焦点顕微鏡はアクセスしやすく、専門知識は少なくて済みます。さらに、ミトコンドリアを標的とする蛍光タンパク質の開発は、ミトコンドリア融合を視覚化および定量化するために光活性化可能な緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用しているため、生細胞におけるミトコンドリアダイナミクスの研究を大幅に前進させました21。

ミトコンドリアの分裂と融合を研究するために、細胞はDNAに結合してDNA損傷を誘導し、ミトコンドリアを介したアポトーシスで最高潮に達するシスプラチンなどの薬物にストレスまたは曝露されます23。本研究では、光活性化性ミトコンドリアマウス由来の光切り替え可能なタグ付きDendra2ミトコンドリアを用いて、ミトコンドリアが豊富で再生能力が高いシスプラチン処理腎尿細管細胞における分裂・融合事象を研究しました。ただし、このプロトコルは、光切り替え可能なタグ付けされたデンドラ2ミトコンドリアを持つ任意の細胞型で使用できます(図1A-C)。

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プロトコル

すべての動物作業は、テンプル大学の施設動物ケアおよび使用委員会、テンプル大学によって承認されたプロトコルに従って実行されました (動物プロトコル-5183)。Dendra2タンパク質を発現するミトコンドリアを持つファムマウスを購入しました。

1. 細胞培養培地の調製

  1. ビーズ24 を使用して糸球体内皮細胞から分離した後、プロトコルに従って腎臓近位尿細管細胞を単離します(図1A)。Boucharebらは、蛍光ミトコンドリア(mito-Dendra2)を発現するトランスジェニックマウスの腎臓から糸球体内皮細胞(GEC)を磁気ビーズを用いて単離・培養する方法を開発しました。GECを単離した後、ペレットに残った尿細管を単離して培養します。
  2. 5%FBS(熱不活化)、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加した10 mLのDMF-12で、10 cmの皿で腎臓近位尿細管細胞を培養します。尿細管が尿細管から移動するまで2〜3日間尿細管を成長させます。
  3. 2日間飢餓した後(FBSを含まないDMF-12を使用)後、形態によって尿細管細胞を選択します。
    注:実験には、50〜70%のコンフルエントセルを含むディスクを使用します。播種する前に血球計算盤で細胞を数えます。
  4. 実験用の細胞の播種:実験要件に応じて、ウェルあたり1〜5×10〜5 細胞の密度で細胞をガラス底培養プレートに播種します。シスプラチンを添加する前に、細胞が付着して一晩成長するのを待ちます。
    注: シスプラチンは危険な化学療法薬であるため、人員と環境を保護するために安全プロトコルに従うことが重要です。この目的のために、クラスIIの生物学的安全キャビネット、個人用保護具(PPE)、除染、流出防止、および廃棄物処理(有害薬物廃棄物化学療法)の指示に従ってください:二重手袋、グーグルを着用し、作業面を除染し、こぼれキットをワークステーションの近くに保管し、廃棄物容器に明確にラベルを付けます。DMSO の場合は、PPE を着用し、ドラフトで作業し、流出の除染と廃棄手順に従ってください。

2. シスプラチンによるストレスの誘発

  1. シスプラチン培地の調製
    1. DMSOに溶解して、50 mMのシスプラチンのストック溶液を調製します。
    2. ガラス底培養プレートに1-5 x 10 6近位管状細胞を プレートし、2 mLのDMF-12培地を加えます。
      注:ガラス底培養ディスクを使用できます。
    3. 実験プレートに最終濃度2μMのシスプラチンを加え、DMSOの最終濃度として0.004%にします。
      注:1,998 μLのFBS遊離DMF-12培地で希釈した2 μLの50 mMシスプラチンを調製し、80 μLを実験プレートに加えます。
    4. 細胞を24時間インキュベートします。

3. イメージング

  1. 共焦点顕微鏡の使用
    1. レーザーを405 nm(Dendra2光変換)、488 nm(未変換のDendra2励起)、および561 nm(光変換されたDendra2、Alexa 594)に構成します。
    2. レーザーをオンにして、安定化するまでの時間を確保します(~10分)
  2. 核分裂と核融合の事象の研究
    1. レーザーを405 nm(Dendra2光変換)、488 nm(未変換のDendra2励起)、および561 nm(光変換されたDendra2、Alexa 594)に構成します。
    2. 培養ディスクをインキュベーションチャンバーに入れます。
    3. チャンバーの周囲に水を加え、温度を37°Cに設定します。 CO2の供給を維持する必要があります。
    4. インキュベーションチャンバーを平衡化させます。温度変化は細胞にストレスを与えます。
    5. ミトコンドリアイメージングのために、より高い倍率と解像度を使用して細胞を視覚化します。
    6. 左上隅のドロップダウンメニューを開き、FRAPオプションを選択します(図2A-D)。
    7. 光退色が実行される LAS X ソフトウェアを使用して、関心領域 (ROI) を定義します。
      注:関心領域は任意のサイズで描画できますが、個々のミトコンドリアが分析されるため、結果には影響しません。
    8. 低レーザー強度で一連の漂白前の画像を取得して、ベースラインの蛍光強度を確立します。光スイッチング(0.00)、48nm(0.20)、および56nm(0.20)用の405nm波長を設定し、細胞の焦点を確実に集束させます。
      注:レーザー波長に続く括弧内の値は、光退色に影響を与えないため、任意の値に設定できるレーザー強度を示しています。
    9. 細胞を光漂白するには、高強度のレーザーパルスを照射してROIを漂白します。FRAP レーザーを 405 nm(4.00)、488 nm(0.00)、および 561 nm(0.00)に設定します。59回の反復でプレブリーチを5.140秒に設定し、ポストブリーチを希望のタイミングに設定します(図2B)(プレブリーチとポストブリーチレーザー強度は括弧内に記載されています)。
    10. 漂白後のイメージングでは、低レーザー強度で画像を取得し続け、蛍光の回復を10分間観察します。FRAPレーザーは405 nm(0.00)、488 nm(0.50)、および561 nm(0.50)に保ちます。
      注:漂白時間は細胞の種類によって異なる場合がありますが、私たちの手では、尿細管細胞と弁間質細胞(VIC)のミトコンドリアにも同様の漂白タイミングが使用されました。FRAPが終了したら、漂白後の画像を取得するだけでなく、画像または生細胞イメージング(図3 および 補足ビデオ1)を行うことができます。

4. 画像解析

注:ミトコンドリアはデンドラ2タンパク質でタグ付けされているため、光退色を受けると、デンドラ2タンパク質の不可逆的な立体配座変化により、561 nmレーザーで検出される赤色蛍光が増加します。赤いミトコンドリアが漂白されていない緑色のミトコンドリアと融合すると、その組み合わせは黄色になります。この現象を利用して、動的核分裂/核融合イベントを測定できます。

  1. 融合した赤と緑のミトコンドリアのプロファイリング
    1. RGB プロファイラー プラグインをインストールして、選択範囲全体の赤と緑の信号をプロファイリングします。
      注: Web サイトの指示に従って、プラグインをフィジー セクションに追加します。
    2. ImageJを開きます(図4A)。
    3. [ ファイル ]メニューから、分析するファイルを見つけて開きます(図4B)。
    4. カラーモードコンポジットを選択し、自動スケールオプションをオンにして、ビデオを開いて分析します(図4C)。
    5. 解析する長方形の領域を選択します(図4D)。
    6. 選択した長方形の領域の近くにカーソルを合わせ、右クリックして[ 複製 ]を選択します(図4E)。
    7. 画像のすべてのスタックを複製する複製 ハイパースタック オプションを選択します(図4F)。
    8. 複製されたスタックをRGB形式に変換するには、画像を選択し、画像ドロップダウンでRGBオプションを選択します(図4G-H)。
    9. RGB画像が複製され、1フレームのみが選択されます(図4I)。
    10. 画像内のミトコンドリアが湾曲している場合は、その長さに沿って線を引きます。次に、[ 編集] メニューに移動し、[ 選択範囲] を選択して、[ まっすぐにする] をクリックします (図 5A)。
    11. 画像のタイトルを選択し、線幅を 20 ピクセルに設定します (図 5B)。
    12. ミトコンドリアをまっすぐにした後、目的のミトコンドリアに沿って線を引き、直線と一直線になることを確認します(図5C)。
    13. RGB プロファイラー プラグインを開きます (図 5D)。
    14. 有効にすると、プラグインは描画された線に沿って赤と緑の蛍光強度を示すプロットを生成します。各ピークの高さは蛍光強度に正比例します(図5E)。
      注:ミトコンドリアの形態は、ミトコンドリアアナライザープラグイン25を使用して計算することもできます。露光に使用する領域を選択し、選択した領域の閾値を解析し、ミトコンドリアの形態を測定し、2D解析を行います。面積の周囲やその他のパラメータを選択できます。

5. 融合イベントの分析

  1. 融合前のベースラインを確立する:ミトコンドリア融合の前に、赤色蛍光(561 nm)が1つのミトコンドリアに局在し、緑色蛍光(488 nm)が隣接するミトコンドリアに局在することを確認します。対応する強度プロットには、赤と緑の 2 つの異なるピークが、重複を最小限に抑えて表示する必要があります。
  2. 融合後のイベントの確認:融合後、赤いシグナル(Dendra2マトリックス含有量を表す)が隣接する緑色のミトコンドリアに広がり、含有量の混合を示します。強度プロットには、赤と緑のピークが重なり合って表示され、核融合イベントが確認されます。
  3. 融合イベントの評価は、生細胞イメージングで融合するために健康なミトコンドリアと光退色されたミトコンドリアを慎重に選択することによって決定できます。赤と緑の比率が時間の経過とともに変化した場合、融合イベントを示します。

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結果

初代尿細管上皮細胞を酵素消化によりマウス腎臓から単離し、5%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMF-12で37°C、5%CO2で培養した。80%のコンフルエントに達すると、細胞をトリプシン処理(0.25%トリプシン-EDTA)し、ウェルあたり5×104 細胞の密度で、コラーゲンで事前にコーティングされたガラス底培養プレートに播種しました。

培地には、0.004% DMSO(v/v;シスプラチン溶媒量に一致)を添加したDMF-12に最終濃度μMのシスプラチンが含まれていました。細胞をウェルあたり2mLで24時間処理にさらしました。処理後、培地を新しい化合物フリー培地に置き換えました。細胞形態は位相差顕微鏡 によって 評価されました。この記事では、化学療法後のミトコンドリアの分裂および融合イベントを決定するために、共焦点顕微鏡とImageJを使用してDendra2光スイッチング蛍光のミトコンドリア動態を測定する適応法を提供しました。

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ディスカッション

ミトコンドリアの分裂/融合は、ミトコンドリアの恒常性と細胞生存率を維持する重要な動的プロセスです26。これらのプロセスを適切に評価するには、ミトコンドリアの形態、ダイナミクス、および機能を視覚化および定量化するための高度なイメージング技術が必要です27,28。ミトコンドリアの分裂/融合を測定するために、さまざまな技術が使用されてきました。洗練されたツールには、生細胞におけるミトコンドリアのクリステダイナミクスの視覚化を可能にする誘導放出枯渇(STED)ナノスコピーが含まれます29。構造化照明顕微鏡(SIM)は、サブミトコンドリア構造のマルチカラーイメージングに使用されています30。拡張顕微鏡は、ミトコンドリアクリスタ31の形態を視覚化し、特徴付けるために使用されます...

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開示事項

著者らは、開示するものは何もないと宣言している。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所の助成金番号 5R01DK135470-03、ISAC-NIH 助成金 5U24DK128851-03、および米国心臓協会のポスドク フェローシップからの研究助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<強力>細胞培養 
DMEM/F12 基礎培地 (ギブコ/キャット。番号11320033)およびnbsp;近位管細胞培養 
胎児用牛血清(FBS) 5〜10%のサプリメント (Biowest/Cat.No.S181B)およびnbsp;培養培地の濃縮 
ペニシリン・ストレプトマイシン 100X (ギブコ/キャット。番号15140122)およびnbsp;抗生物質による保護効果 
コラーゲンIV コーティング (シグマ-C5533-5M) イビディプレートコーティング 
トリプシン-EDTA 0.25%の解決策 (ギブコ/キャット。No.25200056)およびnbsp;セルの分離 
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) (ギブコ/キャット。番号10010023)およびnbsp;細胞洗浄 
Treatments 
シスプラチン 2 & micro;作業集中度 (セレック・ケミカルズ/Cat.No.S1166)とnbsp;ストレス誘導  
ジメチル硫酸(DMSO) 車両制御 (フィッシャー・サイエンティフィック/Cat.番号D1391)とnbsp;シスプラチン溶媒制御 
Imaging 
フェノール赤フリーメディウム ライブイメージング (ギブコ/キャット。番号21041025)およびnbsp;背景蛍光低下 
分子生物学 
トリゾル&レグ; RNA抽出 (ギブコ/キャット。番号15596018)およびnbsp;総RNA単離量およびnbsp;
SYBR グリーンマスターミックス qPCR化学 (サーモサイエンティフィック/Cat.No.K0221) ミトコンドリア動態遺伝子発現(DNM1L、FIS1、MFN1、MFN2、OPA1)およびnbsp;
蛍光道具 
Dendra2 ミトコンドリアマトリックスタグ ジャクソン研究所(PhAM切除)およびnbsp;フォトスイッチ可能なリポーター(405nm変換、488/561nmイメージング) 
Microscopes 
コンフォーカル顕微鏡 ライカ DMi8 ライブセルイメージングおよびFRAP 405nm/488nm/561nmレーザー 
画像 j https://imagej.net/software/fiji/downloads 
RGBプロファイラープラグイン https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. 融合事象解析(赤/緑信号の重複) 

参考文献

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