方法論記事

培養細胞における官能化ナノボディを用いたエンドサイトーシス輸送の生細胞イメージング

DOI：

10.3791/69284

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2025年10月17日

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1Biozentrum, University of Basel

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原形質膜からトランスゴルジネットワークへのタンパク質のエンドサイトーシスおよび逆行性輸送は、膜恒常性を維持し、シグナル伝達を調節するために不可欠です。ここでは、HeLa細胞における誘導体化抗GFPナノボディを用いた生細胞顕微鏡による膜貫通カーゴタンパク質のエンドサイトーシス輸送を画像化し、定量する方法を記述します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞表面からエンドソーム、そしてそれ以降への受容体やその他の膜貫通タンパク質のエンドサイトーシスは、恒常性、生理学、および機能にとって重要です。エンドサイトーシスの取り込みと逆行性タンパク質輸送を調査するために、固定および生細胞イメージング、電子顕微鏡、およびオートラジオグラフィーと組み合わせたゲル電気泳動によって、細胞表面からトランスゴルジネットワーク(TGN)への輸送を監視するための機能化ナノボディで構成される汎用性の高いツールキットを確立しました。私たちは、グリーン蛍光タンパク質(GFP)またはmCherry(単量体、非架橋、高親和性タンパク質結合剤)を標的とする誘導体化ナノボディを開発し、対応する細胞外蛍光タグを持つ目的の膜タンパク質を発現する細胞株に添加できます。GFPまたはmCherryタグ付き膜貫通レポーターに結合すると、ナノボディは特異的に内在化され、レポーターの内因性選別経路と並行して輸送されます。これらのナノボディは、蛍光顕微鏡とライブイメージングによって逆行性輸送を追跡するために選択された蛍光色素で機能化され、電子顕微鏡によって超微細構造局在を解決するためにアスコルビン酸ペルオキシダーゼ2(APEX2)を使用して、TGN到着速度論を定量的に評価するためにチロシン硫酸化モチーフで機能化されました。この方法論的研究では、細菌の発現と官能化ナノボディの精製、および安定したGFPレポーター細胞株の生成のための一般的なプロトコルについて詳しく説明します。mCherry修飾抗GFPナノボディ(VHH-mCherry)を使用して、トランスフェリン受容体(TfR)と陽イオン依存性マンノース-6-リン酸受容体(CDMPR)のエンドサイトーシス取り込みを分析することにより、生細胞イメージングにおけるこのアプローチの有用性を例示します。

概要

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原形質膜からさまざまな細胞内コンパートメントへの受容体および他の膜貫通(TM)タンパク質のエンドサイトーシスは、膜恒常性の維持にとって重要です1,2。クラスリン依存性または非依存性エンドサイトーシスによる内在化に続いて、タンパク質カーゴは最初に初期エンドソームに寄り添い、そこからエンドリソソーム系に沿ってさらに選別され、原形質膜にリサイクルされるか、または逆行性にトランスゴルジネットワーク(TGN)に輸送されます3,4,5。エンドソームおよび/または細胞表面からTGNへのリサイクルは、陽イオン依存性および陽イオン非依存性マンノース-6-リン酸受容体(CDMPRおよびCIMPR)などの多くの膜貫通カーゴ受容体の機能サイクルの一部であり、新しく合成されたリソソーム加水分解酵素をTGNから後期エンドソームおよびリソソームに送達します6,7,8、Wntless(WLS)はWntリガンドを細胞表面に輸送します9、10、11、12、またはTGN46は、膵臓アップレギュレーション因子(PAUF)および他のCARTSカーゴを含む可溶性分泌カーゴタンパク質をTGN 13,14,15,16からエスコートします。これらのカーゴ受容体はすべて、新しいクライアントタンパク質の収集のためにTGNを介して通路しますが、鉄結合トランスフェリンを内在化するトランスフェリン受容体(TfR)は、ゴルジリターン17,18,19,20,21から除外されます。

エンドサイトーシスおよび逆行性トラフィックを調査するために、細胞表面から細胞内コンパートメントまでのカーゴタンパク質を標識および追跡するように設計されたナノボディベースのツールキットを以前に確立しました17。ナノボディは、ラクダ科動物や軟骨魚類に自然に見られるホモ二量体重鎖のみ抗体(hcAb)に由来する新しいクラスのタンパク質結合剤を構成します22,23。これらは、hcAbの可変重鎖ドメイン(VHH)を表し、従来の抗体(IgGなど)に比べて多くの利点を提供します:単量体、低量(~15 kDa)、溶解性が高く、ジスルフィド結合を欠いており、細菌的に発現でき、高親和性結合のために選択に適しています24。このナノボディツールキットの汎用性と幅広い適用性を高めるために、官能化抗GFPナノボディを採用して、細胞外または内腔ドメインにGFPタグでタグ付けされたタンパク質を表面標識および追跡しました。ナノボディとmCherry、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2(APEX2)、またはチロシン硫酸化配列との組換え結合により、正真正銘の膜貫通カーゴタンパク質の逆行性輸送は、固定および生細胞蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、またはオートラジオグラフィーを使用した生化学的アッセイによって分析できます。チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼTPST1およびTPST2によって触媒されるチロシン硫酸化は、トランスゴルジ体/TGNに限定された翻訳後修飾であることを考えると、この戦略は、細胞表面からゴルジコンパートメント25,26,27への輸送ダイナミクスと動態の直接評価を可能にします。最近では、この機能化タンパク質結合剤のレパートリーを拡大し、誘導体化抗mCherryナノボディを含めました。これらの試薬は、生化学的分析を通じて、MPR、特にCDMPR17,28のTGNへの機械依存性輸送経路を分析するのに役立つことが証明されています。

以前の研究は主に、オートラジオグラフィーによるTGNの到着を生化学的に評価するためのチロシン硫酸化配列で修飾されたナノボディの適用に焦点を当てていましたが19、この方法の記事では、エンドサイトーティック輸送の生細胞イメージングのための蛍光標識官能化ナノボディ(VHH-mCherry)およびレポーター細胞株の生成について説明します。追加のゴルジ体常在蛍光レポータータンパク質と組み合わせることで、このプロトコルは、選択されたカーゴタンパク質のエンドソームからTGNへの輸送の生細胞イメージングを定量的に分析するための堅牢なワークフローとして機能するようにさらに適応させることができます。

このプロトコルを適用する前に、研究者は、標的タンパク質が、通常は標準的な分子クローニングアプローチによって生成されるGFPタグ付き融合コンストラクトとして発現していることを確認する必要があります。官能化ナノボディは、表面標識実験に十分な収率で細菌中で容易に生成でき、低ナノモル範囲の作業濃度は、ほとんどの生細胞イメージングアッセイに適しています。また、輸送動態はカーゴタンパク質によって異なる場合があり、エンドサイトーシスまたはエンドソームからTGNへの輸送を最適に視覚化するには、標識期間またはイメージング頻度の調整が必要であることも考慮する必要があります。

プロトコル

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1. VHH-mCherryによる細菌形質転換

注:このプロトコルは、前述のように官能化抗GFPナノボディの発現、精製、および分析用に最適化されています17。以下の手順はVHH-mCherryに適合しており、以前の方法論的レポート19と一致しています。

  1. タンパク質発現に適した化学コンピテント細菌(50-100 μL)を氷上に置いて解凍します(例: 大腸菌、ロ ゼッタBL21(DE3)細胞)。
    注:標準的な実験プロトコルに従って化学的コンピテント細菌細胞を調製します。これには、NEBの市販のBL21(DE3)セルを使用できます。
  2. 官能化VHH-mCherryコンストラクト(Addgene#109421)をコードするプラスミドを50 ng添加します。細菌発現中のナノボディレポーターの効率的な部位特異的ビオチン化を確実にするために、細菌ビオチンリガーゼBirA(Addgene#109424)をコードするプラスミドの3倍の過剰(150 ng)と共形質転換します。チューブを4x〜5xゆっくりとフリックして、細胞とプラスミドDNAを混合します。
    注:ビオチンアクセプターペプチド(BAP)によるビオチン化が必要ない場合、BirAをコードするプラスミドとの共形質転換は必要ありません。
  3. 混合物を氷上で30分間インキュベートします。このステップでは動揺を避けてください。
  4. 細菌細胞を42°Cで正確に20秒間ウォーターバスまたは加熱ブロックに置くことにより、熱ショックします。
  5. 1 mLの室温(RT)ルリアブロス(LB)培地を加え、形質転換した細菌をサーモシェーカー(250〜500 rpm)で37°Cで1時間インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子の表現型発現を可能にします。
    注:1 L LB培地を調製するには、酵母抽出物5 g、トリプトン10 g、NaCl 10 gを加え、水で体積を補い、オートクレーブ滅菌で滅菌します。
  6. 11,000 x g で1分間遠心分離して細菌をペレット化し、ペレットを100 μLの新鮮なLB培地に再懸濁します。ピペッティングで十分に混合します。
  7. 適切な抗生物質を含む予熱したLBプレートに浮遊細菌をプレートします(例えば、50 μg/mLのカナマイシン、BirAと共形質転換した場合は、50 μg/mLのカルベニシリンも含み、ステップ1.2を参照)。
  8. 抗生物質を添加したLBプレートを37°Cで逆さまにして13〜15時間インキュベートします。
    注:プロトコルはここで一時停止できます。コロニーが成長したプレートは4°Cで保存し、乾燥を防ぐために透過性フィルムで密封することができます。

2. 細菌液体培養とVHH-mCherry発現の誘導

  1. 形質転換プレートから単一の細菌コロニーを選択し、抗生物質を添加した20 mLのLB培地を含む三角フラスコに接種します。培養物を振とうインキュベーターで37°Cで13〜15時間インキュベートします(抗生物質の選択に関するステップ1.7も参照してください)。
  2. 翌日、一晩20 mLの細菌培養物を、対応する選択抗生物質を含む1 LのLB培地を含む新鮮なフラスコに希釈します。
  3. 培養物が600 nm(OD600)で0.6〜0.7の光学密度に達するまで、37°Cでインキュベートを続けます。
    注:タンパク質発現を誘導する前に、培養物をRTまたは16°Cまで冷却します。
  4. 1 mLの1 Mイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、1 mMの誘導剤の最終濃度(1:1000希釈)を達成することにより、VHH-mCherry(およびBirA、共発現の場合)の発現を誘導します。BirA発現プラスミドとの共形質転換が行われた場合は、培養物に10 mLの20 mMのD-ビオチンストック溶液を補充し、増殖培地中に200 μMのD-ビオチンの最終濃度をもたらします。これにより、VHH-mCherryコンストラクトに存在するビオチンアクセプター(BAP)エピトープの in vivo ビオチン化が促進されます。
    注:D-ビオチンストックをddH2Oで調製し、500 mM NaH2PO4を徐々に添加して可溶化します。
  5. IPTG誘導1L培養物を16°Cで13〜15時間インキュベートして、最適なタンパク質の折り畳みと収量を促進します。
    注:他の蛍光タグを備えた新しく設計されたナノボディ構築物の発現条件は、研究者による経験的最適化を必要とする場合があります。
  6. 培養物を1 L遠心分離ボトルに移し、4°Cで5,000 x g で45分間遠心分離して細胞を回収します。上清を適切な液体バイオ廃棄物に廃棄し、精製ステップに進みます。
    注:この時点で、細菌ペレットを-80°Cで保存することにより、プロトコルを一時停止できます。 VHH-mCherry ペレットは通常ピンク色に見え、蛍光融合タンパク質が適切に折りたたまれていることを示しています。

3. VHH-mCherryのIMACベースの精製

  1. 必要に応じて、凍結した細菌ペレットを氷上で解凍します(ステップ2.6も参照)。
  2. 30 mLの氷冷結合バッファー(1x PBS中の20 mMイミダゾール)を細菌細胞ペレットに加え、上下にピペッティングして完全に再懸濁します。懸濁液を標識された50 mL遠心分離管に移します。
  3. 再懸濁した細胞に、200 μg/mLのリゾチーム、20 μg/mLのDNase I、1 mM MgCl2、 および1 mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を補充します。混合物をRTで10分間インキュベートし、続いてエンドオーバーエンドローテーターで4°Cで1時間インキュベートします。
    注:PMSFは有毒です。手袋、白衣、保護眼鏡を着用して、化学ヒュームフードでストック溶液を準備して取り扱います。PMSF含有廃棄物は、ハロゲン有機廃棄物容器に処分します。実験には、0.1 Mの原液を使用し、さらに希釈しました。
  4. 懸濁液に直接挿入されたチップソニケーターを使用して、細菌細胞を機械的に破壊します。一定の3つの1分間の超音波処理パルスを適用し、指定された超音波処理器設定で各パルスの間に1分間の冷却間隔を可能にします(プローブチップサイズ:6 mm、ソリッドチップ;振幅40%;デューティサイクル(パルスモード):1秒オン/1秒オフ)
  5. 溶解物を4°Cで15,000 x g で45分間遠心分離して清澄化し、細菌の細胞破片と無傷の細菌をペレット化します。
    注:ライセートは遠心分離ボトルに移すか、ベンチトップ遠心分離のために5 mLチューブに分注することができます。
  6. 得られた上清を新しい50 mLチューブに慎重に移し、ペレットを適切なバイオ廃棄物に廃棄します。
  7. 固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)の準備をしている間、透明化したライセートを氷上に保持します。ヒスチジンタグ付きナノボディの単離には、重力流操作に最適化されたプレパック済みのシングルユースHisタグ精製カラムを使用します。
  8. Ni-NTA(ニッケル-ニトリロ三酢酸)カラムを金属製のスタンドまたは適切なカラムホルダーに固定します。
    1. カラムから保存バッファーを排出し、10 mLの結合バッファー(1x PBS中の20 mMイミダゾール)で平衡化します。
    2. バッファーが重力によって通過できるようにします。フロースルーをバイオ廃棄物として廃棄します。
  9. 透明化した細菌ライセート(~30 mL)をカラムに徐々に塗布します。重力によって流れさせ、流れを捨てます。
  10. カラムを2回連続して10 mL容量の結合バッファー(1x PBS中の20 mMイミダゾール)で洗浄します。
  11. 結合したナノボディを2 mLの溶出バッファー(1x PBS中の500 mMイミダゾール)で2 mL微量遠心チューブに溶出します。
  12. バッファ交換を実行します。
    1. 50 mLチューブアダプターに入れた脱塩カラムを、5 mLの1x PBSで5回すすぎ、平衡化します。
    2. バッファーが充填された樹脂に完全に入るまで待ちます。フロースルーを破棄します。最終PBS洗浄後、カラムを1,000 x g で2分間遠心分離します。
    3. フロースルーを破棄します。アダプター付きのカラムを新しい50 mLチューブに置きます。溶出した官能化ナノボディ2 mL(ステップ3.11から)をPBS平衡脱塩カラムにロードし、1,000 x g で2分間スピンして溶出液を回収します。
      注:透析は、バッファー交換に使用することもできます。
  13. ビシンコニン酸(BCA)またはブラッドフォードアッセイを使用して、メーカーのプロトコルに従って精製されたVHH-mCherryタンパク質の濃度を定量します。
    注:生細胞イメージングアプリケーションにおける効率的なナノボディ取り込みのために、5〜10 mg / mLの最終ストック濃度が推奨されます。

4. VHH-mCherryの発現と純度の検証(クマシー染色)

  1. 確立された実験プロトコルに従って、10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)を調製します。
    注:代わりに、利便性と再現性のために、Bio-Radの市販のプレキャストグラジエントゲルを使用できます。
  2. 精製したVHH-mCherry20 μgを1.5 mL微量遠心チューブに分注し、サンプルバッファー中で95°Cで5分間沸騰させて変性させます。
  3. 変性したナノボディサンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、追跡色素(ブロモフェノールブルーなど)が分離ゲルの底に到達するまで、標準的なPAGE手順に従って電気泳動を実行します。
  4. クマシー染色とゲルの脱色を進めます。
    1. カセットからゲルを慎重に取り出し、クマシー染色液(10%酢酸および45%メタノール中の10 g / Lクマシーブリリアントブルーストックの5%をddH2Oで)に20〜30分間、穏やかに振とうプラットフォーム上でRTで20〜30分間浸漬します。ゲルが染色液に完全に浸されていることを確認してください。
    2. 脱色液(7.5%酢酸および15%メタノールをddH2O中)を使用してゲルを脱色し、RTでそれぞれ1時間の連続洗浄を2〜3回行います。最適なバックグラウンド低減のために、ゲルを新鮮な脱色液に13〜15時間放置します。
      注: 余分な染料は、脱色プロセス中にゲルの周りに家庭用ペーパータオルを置くことで効果的に吸収されます。染色/脱色溶液には、可燃性メタノールと刺激性酢酸が含まれています。ドラフトで使用し、手袋とゴーグルを着用し、使用済み溶液を指定された可燃性液体廃棄物容器に回収してください。
  5. ゲルドキュメンテーションシステムまたは選択したカメラを使用してゲルを視覚化します。
    注:ナノボディ発現のさらなる確認のために、エピトープ特異的抗体を使用したイムノブロッティングを実行できます( 図1Cも参照)。

5. レトロウイルス形質導入を用いたGFPタグ付きレポーターHeLa細胞株の作製

注:京都細胞株αさまざまなGFPレポーターHeLa(ここでは単にHeLaまたはHeLa αと呼ばれる)が以前に生成されています17。生細胞イメージングアッセイを実証する目的で、代表的なカーゴタンパク質としてGFPタグ付きCDMPRまたはTfRが採用されています。I型トポロジーを持つTMタンパク質は、N末端の極端でGFPタグが付けられていますが、II型トポロジーを持つTMタンパク質は、C末端GFP融合を必要とします。

  1. EGFP-CDMPR(Addgene#182642)またはTfR-EGFP(#243763)をコードする遺伝子は、標準的な制限酵素クローニング技術を使用して、レトロウイルスベクターpQCXIPにサブクローニングされています17。化学的コンピテント大 腸菌への形質転換後、MIDI調製キット(Macherey-Nagel製など)を使用して高純度プラスミドDNAを調製します。
    注:化学的適合性細菌細胞は、標準的な実験プロトコルに従って調製する必要があります。NEB 5-α NEB由来のコンピテント 大腸菌 は、クローニングおよびプラスミド精製に使用できます。
  2. 安定したGFPレポーターHeLa細胞株を生成するために、パッケージング細胞株Phoenixアンフォのトランスフェクションによってレトロウイルス粒子が生成されます。すべての細胞培養作業は、BSL2層流条件下で行われます。
    1. トランスフェクションの前日に、2.0〜3.0 x 106 個のフェニックスアンフォ細胞を10 mLの培地中の10 cm皿に播種し、翌日までに60%〜80%のコンフルエントを達成します。フェニックスアンフォは、10% ウシ胎児血清 (FBS)、100 単位/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、および 1 mM ピルビン酸ナトリウムを含む DMEM 高グルコース GlutaMAX-I で維持されます。
    2. トランスフェクション当日に、培地を10 mLの新鮮な完全培地と交換します。
    3. 1.5 mLの微量遠心チューブで、1 mLの血清およびサプリメントを含まないDMEM高グルコースGlutaMAX-Iを10 μgのpQCXIP-EGFP-CDMPRまたはpQCXIP-TfR-EGFPおよび30 μLのFuGENE HDトランスフェクション試薬と混ぜ合わせます。ピペッティングで十分に混合します。
    4. 混合物を室温で15分間インキュベートして、DNA-試薬複合体を形成できるようにします。
    5. トランスフェクション混合物全体をフェニックスアンフォ培養物に滴下します。プレートを軽く回転させて、複合体を均等に分散させます。
    6. トランスフェクトしたフェニックスアンフォ細胞を37°Cで5%CO2で13〜15時間インキュベートします。
      注:Retro-X Qベクターシステムと互換性がある場合、代替パッケージング細胞株を使用できます。
  3. 翌日、トランスフェクション培地を廃棄し、ウイルス産生を促進するために7 mLの新鮮な完全培地と交換します。
  4. トランスフェクション後48時間およびオプションで72時間後に、ピペットエイドを使用してウイルス粒子を含む培養上清(~7 mL)を収集します。蛍光顕微鏡またはイメージングシステム(Bio-Rad ZOEなど)を使用して、トランスフェクトされたフェニックスアンフォ細胞におけるGFP発現をモニタリングします。
    注:繰り返しになりますが、レトロウイルス操作にはBSL-2封じ込めが必要です。すべての作業は、認定されたバイオセーフティキャビネットで行い、手袋、白衣、目の保護具を着用し、オートクレーブで廃棄物を処分する前に、1%ヘキサクォートと70%エタノールで表面を除染します。
  5. 採取したウイルス上清を0.45μmサイズのフィルターでろ過します。ろ過された上清は、すぐに使用するか(ステップ5.7を参照)、短期使用の場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで保存できます。凍結するとウイルス力価が低下する可能性があることに注意してください。
  6. 安定したGFPレポーターHeLa細胞を確立するには、ろ過されたウイルス上清を使用してレトロウイルス形質導入を進めます。すべての手順は、BSL2 条件下で実行する必要があります。
    1. 形質導入の1日前に、約2.0〜3.0 x 106 HeLa α細胞を10 mLの培地で10 cmの皿に播種し、翌日までに60%〜80%のコンフルエントに達します。培養 HeLa α 細胞を、10% FBS と 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した DMEM 高グルコース GlutaMAX-I で培養します。
    2. ろ過したウイルス上清を15 μg/mLのポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)と混合して、感染効率を高めます。
      注:ポリブレンは刺激物です-ストックの準備中は、手袋と目の保護具で取り扱い、エアロゾルの形成を避け、ポリブレン含有溶液を有害な化学廃棄物として処分してください。
    3. 翌日、標準的な増殖培地をポリブレンを含む原液のウイルス上清と交換し、皿の表面全体が覆われていることを確認します。
    4. 形質導入下のHeLa α細胞を5%CO2で37°Cで13〜15時間インキュベートします。
      注:ウイルス力価を決定するために、HeLa α細胞の連続希釈および感染アッセイを実行できます。この場合の力価は任意であり、レトロウイルスは分裂細胞のみに感染します。
  7. 形質導入の翌日、ウイルス培地をBSL2廃棄物に廃棄し、10 mLの新鮮な完全HeLa α培地と交換します。5%CO2で37°Cで13〜15時間インキュベートします。
  8. 翌日、培地を1.5 μg/mLのピューロマイシンを含む完全培地に交換して選択を開始します。
  9. 選択圧力を2〜3週間維持し、必要に応じて細胞を継代します。遺伝子組み換え細胞をBSL1環境に移す前に、複製能力のあるウイルス粒子がないことを確認してください。
  10. 均質な集団を得るには、クローニングリングまたはシリンダーを使用したクローン単離、または蛍光活性化細胞選別(FACS)のいずれかを使用します。FACSは、FACSAria IIIまたはFusion(BD Biosciences)を使用して形質導入されたHeLa α細胞に対して実行し、蛍光強度に基づいて均一なGFP発現を持つ集団を濃縮することができます。
    注:HeLa α細胞におけるGFPレポーターの発現は、固定細胞蛍光顕微鏡または抗GFP抗体によるイムノブロッティングによってさらに検証できます( 図2Cも参照)。

6. 生細胞イメージングのための培養細胞によるVHH-mCherryの取り込み

注:すべての細胞培養手順は、生細胞顕微鏡検査の前に、層流フード内の無菌条件下で実行されます。


    6. figure-protocol-1

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結果

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さまざまな細胞内コンパートメントへの逆行性タンパク質輸送を調査するために、我々は最近、細胞表面から組換え融合タンパク質を標識および追跡するための抗GFPナノボディベースのツールを確立しました17。ここでは、このような誘導体化ナノボディの細菌産生について説明し、生細胞イメージングによるエンドサイトーシス取り込みのモニタリングにおけるそれらの有用性を実証します。このプロトコルは、ゴルジ体に常在する蛍光レポーターと組み合わせることで、選択されたカーゴタンパク質のトランスゴルジネットワーク(TGN)への逆行性輸送をリアルタイムで定量的に研究するための堅牢なプラットフォームを提供します。

標準的な分子クローニング技術を使用して、共通のモジュラーアーキテクチャを共有する異なる官能化抗GFPナノボディのコレクションを生成しました17。現在の研究は蛍光変異体であるVHH-mCherryに焦点を当てていますが、このツールセットの汎用性を説明し、将来の応用の可能性を強調するために、追加の誘導体化ナノボディも含まれています。当社の最も基本的なコンストラクトであるVHH-std(標準のstd)は、VHHドメイン、抗体ベースの検出用のT7およびHAエピトープ、精製用のC末端ヘキサヒスチジン(His6)タグ、および酵素的ビオチン化および高親和性ストレプトアビジンベースのプルダウンアッセイを可能にするビオチンアクセプターペプチド(BAP)配列で構成されています(図1A)。このコア設計から、生化学分析、固定細胞および生細胞イメージング、および電子顕微鏡によるエンドサイトーシスおよび逆行性輸送の研究を促進するために、さまざまなナノボディ誘導体が開発されました。

エンドサイトーシス輸送の生細胞イメージングのために、GFPとは異なる励起スペクトルと発光スペクトルを持つ蛍光色素を組み込んだ蛍光抗GFPナノボディを設計し、それによって蛍光顕微鏡中の最適なスペクトル分離を確保しました。IPTG誘発性 大腸菌 における優れた折り畳み特性と、十分に特徴付けられた光物理特性に基づいて、蛍光タグとしてmCherryを選択しました。単量体赤色蛍光タンパク質(mRFP)などの他の赤方偏移蛍光色素も、原則として適切な代替品ですが、mCherryはこのシステムで特に堅牢で効果的であることが証明されました。

VHH-mCherry以外の官能化ナノボディの可能性は?原形質膜からトランスゴルジネットワーク(TGN)へのタンパク質輸送を調査するために、TGNおよびトランスゴルジ槽にのみ存在するTPSTのコンパートメント特異的局在を活用しました。この目的のために、ラットプロコレシストキニン29に由来するタンデムチロシン硫酸化モチーフ(2xTS)でVHH-stdを修飾し、それによってこれらのコンパートメントへの貨物到着の生化学的読み出しを可能にしました。VHH-stdとmCherryの融合により、固定細胞または生細胞イメージングによる逆行性輸送の直接視覚化が可能になりますが、APEX230 などのペルオキシダーゼによる官能化により、電子顕微鏡、標的細胞化学的アブレーション、または近接ベースのビオチン化アッセイによる超微細構造の局在化が可能になります。さらに、タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位をナノボディ足場に取り込むことで、内在化ナノボディと表面結合ナノボディを区別するための生化学的手段が提供されます(図1A)。以前、VHH-tev コンストラクトを使用して、ナノボディ結合 EGFP-CDMPR および TfR-EGFP17 のリサイクル速度論を監視しました。細胞表面でのナノボディタグ付き受容体の再出現は、組換えTEVプロテアーゼを細胞外に適用することで容易に検出でき、その結果、ナノボディのC末端エピトープカセットが特異的に失われます。同様に、ここで提示されたmCherry官能化ナノボディVHH-mCherry内にTEV切断部位を含めることで、生細胞イメージングによるEGFPレポーターリサイクルの動的評価が可能になります。追加の蛍光色素、酵素タグ、翻訳後修飾用の配列モチーフなどの代替タンパク質ドメインによる機能化は、SpeIおよびEcoRI制限部位によって目的のインサートをVHH-stdバックボーンにサブクローニングすることで容易に達成できます。元の研究17 で使用されたすべての機能化された抗GFPナノボディコンストラクトは、一般配布のためにAddgeneに寄託されています。

上記のプロトコルを使用して、ここに示すすべてのナノボディバリアントを高収率および高純度に精製しました(図1B)。mCherry融合のみが精製後にタンパク質ドメインのわずかなタンパク質分解クリッピングを示しました(図1B、レーン5)。観察された2つの分解生成物は、見かけの分子量から推測され、エピトープ特異的免疫ブロット検出によって検証されたように、個々のVHHおよびmCherryドメインに対応する可能性が最も高いです(図1C)。共発現BirAがない場合、VHH-mCherryは通常、製剤あたり約20mgの収量で回収されました。私たちの経験に基づくと、BirAの共発現は一貫してナノボディ収量を約1/3から1 /2に減少させます。BSAとの1:1混合物からのナノボディがストレプトアビジン-アガロースによって完全に回収されたため、ビオチン化はかなり完全でした(図1D)。

エンドサイトーシス輸送の研究に対するこのナノボディツールキットの適合性を評価するために、異なる細胞内輸送経路を持つEGFPタグ付き表面受容体タンパク質を発現する安定したHeLa細胞株を作製しました。これらには、原形質膜と初期の(選別とリサイクルの)エンドソームの間を循環するTfRが含まれていました。TGN46は、初期のエンドソームによって原形質膜とTGNの間を移動します。TGN、原形質膜、および初期エンドソームと後期エンドソームの両方の間を行き来する両方のMPR17。EGFPは、各受容体の細胞外ドメイン(具体的には、CDMPR、CIMPR、およびTGN46のシグナルペプチドと受容体配列の間に挿入され)、およびTfRのC末端に融合されました。この設計により、天然の細胞質ドメインが保存され、既知のすべての選別シグナルが無傷のままであり、細胞外抗GFPナノボディによる結合のためにEGFPタグがアクセス可能であることを保証しました(図1E)。細胞外ドメインが異常に大きいCIMPRの場合、そのような切断が正常な輸送行動を維持することを示す以前の研究と一致して、切り捨てられたバージョンが使用されました31,32。

レトロウイルス形質導入によって安定した細胞株を確立し、続いて蛍光活性化細胞選別(FACS)を行い、中程度および同等の発現レベルの均質な細胞集団を単離しました。注目すべきは、EGFP-CDMPRは、その内因性対応物33と同様に、免疫ブロットにおいて一貫して二重バンドとして現れ、不均一なグリコシル化を示していることです。EGFP融合タンパク質が内因性タンパク質の定常状態の局在と発現パターンを再現するかどうかを評価するために、安定に発現する細胞を親HeLa細胞と共培養し、共焦点蛍光顕微鏡で分析しました(図2B)。EGFPシグナルは、対応する内因性タンパク質の分布を忠実に反映していました。予想通り、CDMPR、CIMPR、およびそれらのEGFPタグ付きバージョンは、TGNと後期エンドソームコンパートメントを反映して、主に核周囲領域に局在し、末梢エンドソームに追加の標識が加えられました。内因性TGN46とEGFPタグ付きTGN46はどちらもほぼ独占的に核周囲TGNに見られましたが、TfRとTfR-EGFPは特徴的な初期エンドソーム分布を示し、顕著な末梢選別と核周囲リサイクルエンドソームを示しました。使用した抗体は、内因性型とEGFPタグ型の両方を検出しましたが(CIMPRを除く)、融合タンパク質を発現する細胞では全体的な染色強度が著しく増加しておらず、EGFPコンストラクトが実質的に過剰発現していないことが示唆されました。EGFP-CDMPRおよびTfR-EGFPと直接比較するために、図2BにEGFP-TGN46およびEGFP-CIMPRを含めました。細胞固定および蛍光顕微鏡イメージングに使用されるプロトコルは、以前の研究で概説されています17,19。

VHH-mCherryを使用すると、EGFPタグ付きレポータータンパク質のエンドサイトーシス輸送を生細胞イメージングで監視できます。このために、EGFP-CDMPRとTfR-EGFPを発現する細胞を例として使用しました。細胞は、VHH-mCherryを培地に添加した後、倒立広視野蛍光顕微鏡で経時的に画像化されました(ビデオ1およびビデオ2)。さまざまな時点での静止画像を図3に示します。取り込みは、mCherryチャネルのシグナルを測定し、自家蛍光バックグラウンドを差し引き、EGFPシグナルに正規化して、標識コンパートメントの移動または焦点面の潜在的な小さなシフトによる変動を排除することによって定量化されました。25 nMの培地中のVHH-mCherryの蛍光は無視でき、測定を妨げませんでした。細胞表面から細胞内コンパートメント、定常状態分布へのレポーターの輸送の分析は、以前の出版物17の図2に示す生化学実験と同じ速度論的結果をもたらし、取り込みの見かけの半減期はEGFP-CDMPRで~9分、TfR-EGFPで~4分、および~43分および~20分後の飽和、 それぞれ。これらの値は、イムノブロッティングアッセイを使用した生化学的取り込み実験から得られた値と同等でした17。原則として、MPRの最高濃度の核周囲領域など、関心のある細胞内領域への逆行性輸送の動態も分析できます。しかし、核周囲領域にはゴルジ体/TGNだけでなく、後期エンドソームやリサイクルエンドソームも豊富に含まれています。核周囲領域へのナノボディ取り込みの動態は、定義された細胞小器官への逆行性輸送を分析するのに十分な特異性を持っていません。原形質膜からTGNへの輸送をより確実に評価するには、別の蛍光タンパク質であるTGN常在膜貫通タンパク質を、蛍光色素特性のスペクトルの重複がない方法で、GFPレポータータンパク質とともに安定して共発現する必要があります。この追加のマーカーを使用すると、以前に文書化されたように、TPSTによって媒介されるチロシン硫酸化に類似した、レポーター輸入VHH-mCherryの検出が可能になります19。

figure-results-1
図1:EGFPタグ付き細胞表面タンパク質を追跡するための誘導体化ナノボディの設計と製造。(A)誘導体化ナノボディの概略図。標準的なナノボディ構築物は、GFP特異的VHHドメイン、T7およびHAエピトープタグ、ビオチンアクセプターペプチド(BAP)、および精製用のC末端ヘキサヒスチジン(His6)タグで構成されています。その他のナノボディバリアントには、タンデムチロシン硫酸化部位(2xTS)、改変ペルオキシダーゼAPEX2、または蛍光タンパク質mCherryによる修飾が含まれます。スケールバーはアミノ酸(aa)の長さを示します。(B)細菌発現およびアフィニティー精製ナノボディ(20〜50μg)をグラジエントSDS-PAGEで分析し、クマシー染色で可視化した。分子量標準(kDa)を左側に示します。軽度のタンパク質分解クリッピングは、VHH-mCherryでのみ観察され、VHHドメインとmCherryドメインの間で発生する可能性があります。(C)T7、HA、またはHis6エピトープに対する抗体を使用した、またはビオチン化評価のためにストレプトアビジン-HRP(SA-HRP)によって検出された抗体を使用したナノボディ製剤(10 ng)のイムノブロット分析。(D)ナノボディのビオチン化の程度は、ナノボディをBSAと1:1の比率でインキュベートし、続いてストレプトアビジン-アガロースプルダウン、ペレット化、およびビーズの洗浄を行うことによって評価されました。その後、等量の上清(S)とビーズ結合材料(B)をSDS-PAGEおよびクマシー染色によって分析しました。ビーズ結合画分中のナノボディの定量的回収は、完全なビオチン化を示しています。結合画分にVHHフラグメントとmCherryフラグメントの両方が存在することは、SDS-PAGE分析のためのサンプル調製中に発生する可能性が高い部分的な分解を示唆しています。車線 2 と 3 の間の白い線は、無関係な 2 つの車線が削除されたことを示します。この数値は17から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:蛍光標識EGFPタグ付きカーゴ受容体の発現と細胞内局在。(A)EGFP融合コンストラクトの概略図。分泌膜貫通タンパク質に由来する配列は黒で示され、N末端シグナルペプチドと内部膜貫通ドメインは黄色で強調表示されています。EGFP部分は緑色で示されています。CDMPR、TfR、およびTGN46の完全長コンストラクトが生成され、正常な輸送行動を維持するためにCIMPRには十分に特徴付けられた切断されたバリアントが使用されました。スケールバーはアミノ酸(aa)の長さを示します。EGFP-CDMPRおよびTfR-EGFPは以前に説明されています17。(B)細胞内局在を評価するために、EGFP融合タンパク質を安定的に発現するHeLa細胞を親HeLa細胞と共培養し、蛍光顕微鏡で分析した。スケールバーは10μmを表します。(C)EGFPタグ付きレポータータンパク質を安定的に発現するHeLa細胞を溶解し、タンパク質抽出物をSDS-PAGEにかけ、GFPおよびアクチンに対する抗体を使用してイムノブロッティングを行いました。分子量マーカー(kDa単位)は右側に示されています。この数値は17から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:EGFP-CDMPRおよびTfR-EGFPによって媒介されるナノボディエンドサイトーティック取り込み動態の生細胞イメージング。 生細胞イメージングは、37°Cのフェノールレッドフリー完全培地中で(A)EGFP-CDMPRまたは(B)TfR-EGFPを安定的に発現するHeLa細胞に25 nM VHH-mCherryを添加した後に実施しました。 細胞は、半自動広視野蛍光顕微鏡を使用して、GFPおよびmCherryチャネルで36秒間隔で画像化されました。代表的なマージされた静止画を、以下の個々のチャンネルで核周囲領域の拡大ビュー(倍率:2.2倍)とともに示します。(スケールバー、10 μm。 ビデオ 1 および ビデオ 2 も参照してください。(C)EGFP-CDMPRおよび(D)TfR-EGFPにおけるナノボディ取り込み動態の定量分析は、それぞれ約40個の個々の細胞を捕捉した3つの独立した実験のデータを使用して実行されました。細胞小器官の動きと焦点面の変動性を説明するために、mCherry蛍光強度をGFPシグナルに正規化(ノルム)し、3つの実験のすべての細胞の平均±SDとしてプロットしました。平均最大取り込みシグナルは1に正規化されました。各細胞の取り込み速度論は、一次速度論モデルを使用して個別に適合しました。プロットされた線は、対応する速度定数の平均から導き出された平均曲線を表します。この数値は17から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:EGFP-CDMPRによるmCherryナノボディ取り込みの生細胞イメージング。 EGFP-CDMPRを安定的に発現するHeLa細胞を、25 nM VHH-mCherryを含む完全培地で37°Cでインキュベートし、EGFPとmCherryの両方の蛍光チャネルで36秒間隔でイメージングしました。ムービーは5フレーム/秒の再生速度でレンダリングされ、リアルタイム圧縮は3分/秒に相当します。このムービーは17から修正されています。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:TfR-EGFPによるmCherryナノボディ取り込みの生細胞イメージング。TfR-EGFPを安定的に発現するHeLa細胞を、25 nM VHH-mCherryを添加した完全培地中で37°Cでインキュベートし、36秒間隔でEGFPおよびmCherry蛍光をイメージングしました。ムービーは 5 フレーム/秒でレンダリングされ、タイムラプス レートは 3 分/秒でした。このムービーは17から修正されています。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ナノボディは、従来の抗体に比べて多くの利点を提供する、急速に出現しているタンパク質結合足場のクラスです:それらは、小さく、非常に安定で、単量体で、非架橋であり、ジスルフィド結合を欠いており、高親和性結合のために選択できます24。以前の研究では、細菌の発現によって産生された官能化ナノボディを開発し、適用して、表面に露出したタンパク質を標識し、トランスゴルジネットワーク(TGN)17への逆行性輸送に焦点を当てて、さまざまなコンパートメントへの細胞内輸送を監視しました。汎用性を確保するために抗GFPナノボディを利用し、細胞外GFP、YFP、またはmCeruleanでタグ付けされた融合タンパク質の標的化を可能にしました。mCherry、APEX2、またはチロシン硫酸化モチーフによる抗GFPナノボディの官能化により、固定細胞イメージングおよび生細胞イメージングによる貨物の取り込みを視覚化し、超微細構造レベルで逆行性輸送コンパートメントを局在化し、標的コンパートメントアブレーションを実行し、TGNへの輸送動態を定量的に評価することができました。このアプローチの1つの制限は、機能化された抗GFPナノボディを効果的に使用する前に、安定した過剰発現または内因性タグ付けのいずれかによる標的細胞株の遺伝子改変の前提条件です。しかしながら、この戦略は、動物免疫またはリボソームまたはファージ表示技術を用いた合成VHHライブラリーからのin vitro選択を通じて生成されたタグなしの内因性標的タンパク質に対するナノボディのレパートリーの増加に容易に適応することができる34。さらに、mCherry、V5、またはALFAなどの一般的に使用されるエピトープタグを標的とするナノボディが近年開発されています35,36,37。特に、最近、硫酸化に配慮した抗mCherryナノボディを利用して、急速な機能不活性化によるGGA2枯渇HeLa細胞におけるCDMPRの逆行性輸送を調査しました28。小さなエピトープタグは、重要な構造ドメインに干渉する可能性が低いため、標的タンパク質の天然のコンフォメーションと機能を維持するという利点があります。これらのコンパクトなエピトープを認識するナノボディ(ALFA、V5など)は、機能性ナノボディツールキットにシームレスに統合して、エンドサイトーシスおよび逆行性輸送メカニズムの研究におけるその有用性を拡張できます。

本研究では、生細胞イメージング実験におけるVHH-mCherryの応用を実証します。EGFP-CDMPRとTfR-EGFPをレポータータンパク質として使用することで、受容体特異的エンドサイトーティック取り込みと定常状態分布への進行を視覚化することができました。原形質膜からそれぞれの細胞内コンパートメントへのこれらのレポーターの輸送の定量分析により、以前の研究17の図2に示されている生化学的アッセイによって得られたものと一致する動態が明らかになりました。見かけの半減期は、TfR-EGFP(~4分)よりもEGFP-CDMPR(~9分)の方がかなり長く、シグナルはそれぞれ約43分と20分後に飽和していることがわかりました。これらの定量的発見は、MPRおよびTfRの人身売買ダイナミクスに関する以前に発表されたデータとよく一致しています38,39,40。特に、VHH-mCherryコンストラクトは、多数のAddgene配布リクエストによって証明されているように、研究コミュニティから大きな注目を集めており、すでにいくつかの独立した研究28,41,42,43,44で成功裏に実装されています。

顕微鏡の構成や実験要件によっては、mCherryタグ付き抗GFPナノボディが常に最適であるとは限りません。そのような場合、代替蛍光色素または蛍光タンパク質変異体は、GFPレポーター細胞株と組み合わせて使用した場合、より適切なスペクトル特性を提供する可能性があります。これに対処するために、mTagBFP2、mNeptune2.5、mCardinal2、TagRFP657、iRFP670 (243764-68) など、さまざまな蛍光タンパク質を組み込んだ機能化ナノボディのライブラリーを確立しました。これらの追加のナノボディ構築物は、Addgeneを通じて利用可能になります。スペクトル的に異なる蛍光色素を使用することで、励起信号と発光信号を明確に分離できるため、スペクトルのオーバーラップを最小限に抑えながら、最大3つの蛍光チャンネルの最適なライブリアルタイムイメージングが容易になります。

定常状態へのエンドサイトーシス取り込みのモニタリングは簡単そうに見えるかもしれませんが、TGNへのタンパク質の逆行性輸送を追跡することは、より大きな実験上の課題を提示します。VHH-mCherryとGFPタグ付きレポータータンパク質に加えて、視覚化と定量には、追加の蛍光または色素結合可能なTGN常在マーカーが必要です。しかし、特定のゴルジ体常在タンパク質は細胞表面への部分的な漏れを示し、輸送機構コンポーネントの実験的操作によって導入されるような細胞内輸送経路の摂動によってさらに悪化する可能性があります。たとえば、TGN46は、特定の分泌カーゴのTGNから細胞表面への輸送を媒介する貨物受容体としての機能的役割にもかかわらず、ゴルジ体常在マーカーとして一般的に使用されています16,45。同様に、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼも原形質膜41で検出されている。これらのタンパク質は表面に循環することができますが、その主な定常状態の局在はTGN内にとどまります。このようなマーカーをスペクトル的に異なる蛍光タンパク質または色素適合タグ(SNAP、Haloなど)でタグ付けし、GFPタグ付き膜貫通レポーターと安定して共発現させることで、TGN到着の定量的な生細胞イメージングが可能になります。これは、ゴルジ体常在融合タンパク質に対応する蛍光チャネル内のmCherryシグナルの蓄積に基づく定量化を使用して、上記のワークフローと同様に測定できます。固定細胞または生細胞における逆行性輸送を調査するための現在の戦略は、多くの場合、IgG抗体(例えば、CD8)と組み合わせたキメラ受容体構築物に依存しています46,47。しかし、表面標識中の従来のIgGの二価性による架橋の固有のリスクは、標識タンパク質の細胞内運命を有意に変化させる可能性があり、エンドサイトーシス後のリソソーム分解にリダイレクトされることがよくあります48,49。対照的に、ナノボディは、その一価の性質と1:1結合の化学量論により、架橋を誘導しないため、標的タンパク質の生理学的輸送経路が維持されます。このため、ナノボディベースのアプローチは、人工的なルーティングアーティファクトを導入することなく、本物の逆行輸送ダイナミクスを研究するために特に価値があります。

生細胞イメージングのためのこのプロトコルの最適な性能は、過剰な量が培地中の非結合ナノボディからのバックグラウンド蛍光の上昇につながるため、ナノボディ濃度の慎重な滴定を必要とする。さらに、正確な定量的比較を確実にするために、滴定中にGFPレポーター細胞株の発現レベルの違いを考慮する必要があります。ナノボディ生産では、大 腸菌 の低温誘導がmCherryドメインの適切な折り畳みを促進するために重要です。誘導温度が高いと、通常、タンパク質が誤って折りたたまれたり分解されたりするため、推奨されません。

このプロトコルの成功は、3つの重要な側面に大きく依存します:第一に、一貫した標識と最小限のバックグラウンドを確保するための機能性ナノボディ構築物の高収率発現と純度。第二に、生理学的輸送経路を再現するために、細胞表面局在化を伴うGFPタグ付きレポータータンパク質を安定的に発現する十分に特徴付けられた細胞株の使用。第三に、貨物輸送ダイナミクスの正確な定量的および定性的分析を可能にするために、イメージングパラメータやスペクトル分離を含む蛍光顕微鏡セットアップの最適な取り扱いと構成です。

ここで紹介する方法とプロトコルは、mCherryタグ付き抗GFPナノボディの使用を中心としており、培養哺乳類細胞の細胞表面からエンドサイトーシスコンパートメントまでのカーゴタンパク質の定量的および定性的追跡を可能にします。蛍光標識ゴルジ常在マーカーと共発現すると、このアプローチにより逆行性輸送経路の分析がさらに可能になります。そのため、このツールは、特定のリガンドや互換性のあるモノマー結合試薬がないために標識にアクセスできなかった細胞表面膜貫通タンパク質および受容体の細胞内輸送を監視するための強力な戦略を提供します。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究はバーゼル大学の支援を受けました。em教授に感謝します。図の作成とレイアウトはマーティン・スピース博士、サポートはバイオゼントルムのイメージング・コア・ファシリティ(IMCF)、転載許可はPNASに依頼されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗GFP抗体およびnbsp;シグマ・オルドリッチ118144600001製品はシグマ・オルドリッチが流通していますが、製造はロッシュが担当しています
100mm細胞培養皿TPPTPP93100
抗アクチン抗体EMDミリポア MAB1501
抗HA抗体研究室より12CA5ハイブリドーマから作られる
抗His6抗体ベチル研究所 A190-114A
抗T7抗体およびnbsp;ベチル研究所 A190-117A
BL21(DE3) 有能 大腸菌NEBC2527H
二水和カルシウム塩化物メルク・ミリポール102382滅菌水に溶解し、ストックは1Mです
カルベニシリン二ナトリウム塩アプリケムA1491滅菌水に溶解し、ストックは100 mg/mLです
クーマッシー-R(ブリリアントブルー)シグマ・オルドリッチB-0149
D-ビオチンシグマ・オルドリッチB4501滅菌500 mM NaH2PO4 またはDMSOに溶解
使い捨てPD10脱塩カラムGEヘルスケアGE17-0851-01
DMEM グルタMAX-Iサーモフィッシャー・サイエンティフィック61965026
DMEM、高グルコース、グルタミンなし、フェノールレッドなしサーモフィッシャー・サイエンティフィック31053028
DNase IアプリケムA3778無菌水に溶解
ダルベッコ硫酸塩緩衝塩水(DPBS)はCa2+/Mg2+シグマ・オルドリッチD8537
胎児用牛血清(FBS)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA5256701
フィルトロプルS、PES、ポレングル&ドゥム;ße: 0.45 & micro;mサーステット83.1826
FuGENE HDトランスフェクション試薬プロメガ E2311
ガラスカバースリップ(No. 1.5H)VWR631-0153
ヤギ対マウスHRPシグマ・オルドリッチA-0168
ヤギ防兎HRPシグマ・オルドリッチA-0545
彼のバッファーキットサイトヴィア11003400
彼のGraviTrapコラムサイトヴィア11003399
ibidi µ-スライド4 well, ibiTreat80426-IBIイビディ
イソプロピル&β;-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)アプリケムA1008滅菌水に溶解し、ストックは1Mです
カナマイシン硫酸塩アプリケムA1493滅菌水に溶解し、ストックは100 mg/mLです
L-グルタミンアプリケムA3704
リソザイム シグマ・オルドリッチ18037059001製品はシグマ・オルドリッチが流通していますが、製造はロッシュが担当しています
塩化マグネシウム六水和物メルク・ミリポール105833滅菌水に溶解し、ストックは1Mです
ミニプロテアンTGXゲル、4-20%、15ウェルバイオ・ラッド4561096
改造ヘラ京都研究室より
NEB5-α コンピテント 大腸菌NEBC2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus、10 プレップマッシェリー・ナゲル 740412.1
ペニシリン/ストレプトマイシンバイオコンセプト 4-01F00-H
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)アプリケムA0999.002540% DMSO、60% イソプロパノールに溶解、500 mM にストック
フェニックスアンフォ細胞株ノーラン研究所
ポリブレン(六ジメトリン臭化物)シグマ・オルドリッチH9268
プロマイシンインビボジェンアント-PR-1
塩化ナトリウム メルク・ミリポール106404無菌水に溶けて、ストックは5 M
ピルビン酸ナトリウム サーモフィッシャー・サイエンティフィック11360039
トランスブロットターボパック、ミニバイオ・ラッド1704158
トリプトンアプリケムA1553
酵母抽出物 アプリケムA1552

参考文献

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