自由に動くマウスにおける慢性マルチサイト脳波記録のための費用対効果が高く低侵襲なプロトコル

サマリー

このプロトコルは、自由に動くげっ歯類の脳波を記録するための信頼性が高く、簡単にアクセスできるシステムを作成するために開発されました。

要約

脳波検査 (EEG) は、脳内の電気的活動を追跡するための基本的なツールとして機能し、臨床診断と前臨床動物研究の両方においてますます重要になっています。げっ歯類の脳波は人間の神経障害をモデル化するための強力なプラットフォームを提供しますが、長期記録は、既存のシステムの高コスト、侵襲性、または技術的な複雑さによって制限されることがよくあります。ここでは、自由に動くマウスにおける慢性的なマルチサイト皮質EEG取得のための、信頼性が高く、アクセスしやすく、経済的に実行可能で、侵入が最小限に抑えられたプロトコルを提示します。この技術では、ユニバーサル シリアル バス (USB) タイプのインターフェイスに接続されたネジ電極を備えた白金イリジウム ワイヤを製造し、骨ネジを使用して硬膜外に固定し、接着剤と歯科用セメントで固定します。このシステムは、術後生存率が85%(n = 20)の野生型C57BL / 6Jマウスで実証されているように、数か月にわたって安定したシグナルキャプチャを可能にします。EEGは1,000Hzでサンプリングされ、差動アンプセットアップを使用して1Hzから500Hzの間でフィルタリングされました。システムを検証するために、ペンチレンテトラゾール (20 mg/kg) を投与して発作様活動を誘発し、発作間期放電がベースライン時の 2-5 回から注射後の 20-51 回まで著しく増加し、信号振幅の増加を伴いました。放電は、認識された電気生理学的基準に一致する波形形態と信号特性に基づいて特定されました。このセットアップは、行動ビデオ追跡およびオープンソース分析パイプラインと互換性があり、薬理学的、遺伝学的、または神経調節研究との統合をサポートします。この方法は、げっ歯類モデルにおける脳ネットワークのダイナミクスを調査するための安定した適応性のあるプラットフォームを提供し、てんかん研究やその他の分野に応用できます。

概要

脳波検査 (EEG) は、脳の電気活動を直接測定し、てんかんの診断に広く使用されています¹。近年、脳波技術は、神経障害、睡眠生理学、および脳ネットワークのダイナミクスを研究するための小動物モデルでの使用にますます適応されています^2,3,4。遺伝子組み換えマウスモデルの出現と記録技術の大幅な進歩により、げっ歯類脳波は前臨床研究に不可欠なツールとなり、人間の脳の健康に関連するトランスレーショナルメカニズムに関する貴重な洞察を提供します^5,6。

神経活動を同時に捕捉して操作することは、マクロ回路レベルとミクロ回路レベルの両方で脳のダイナミクスを研究するために重要です。この二重のアプローチにより、発作の開始と進行に関与するニューラル ネットワークのリアルタイム監視が可能になります。てんかんは、再発性でしばしば予測不可能な発作を特徴とし、複雑な脳回路の破壊から生じます⁴。広範な研究にもかかわらず、発作の広がりと発症を支配するメカニズムは、複数の脳領域にわたる同時記録を可能にする技術の使用が限られているため、まだ完全には理解されていません⁷。

ヒトの神経障害を再現する動物モデルからの脳波記録により、ヒ^ト患者に見られるものを厳密に反映した発作間期スパイク、スパイクアンドウェーブ放電、発作開始パターンが明らかになり、^8,9、それによって人間の脳で起こる電気生理学的変化の理解が進みました。同様に、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害、統合失調症のモデルで検出された脳波異常は、神経振動活動の中断に関する重要な洞察を提供し、潜在的な治療標的を強調します¹⁰。

脳の解剖学的構造とスケールの違いにもかかわらず、マウスとヒトの脳波は驚くべき類似点を示します^2,11。どちらも特徴的な振動周波数帯域(デルタ、シータ、アルファ、ベータ、ガンマ)を示し、パワースペクトルは一般に1/^{f分布に従い}ます^2,11。非急速眼球運動(NREM)睡眠中のデルタ活動の出現や、注意と記憶のタスク中のガンマ同期の増加など、脳状態間の移行は、種間で保存されています。さらに、高周波振動(HFO)および発作パターンを含むてんかん様活動は、マウスとヒトの両方で同等の時間的およびスペクトルプロファイル^{を示します7。}

げっ歯類とヒト脳波の保存された特徴により、マウスモデルは脳障害を研究するための高度な翻訳性があります。マウスEEGは、侵襲的で高解像度の記録を可能にし、詳細な回路レベルの分析を可能にします¹²。また、薬理学的薬剤、光遺伝学的制御、閉ループ刺激^13,14などの神経調節戦略のテストもサポートしており、神経機能障害を正確に調査するための行動および分子ツールと組み合わせることができます。

それにもかかわらず、調査結果を外挿するときは注意が必要です。マウスの脳のサイズが小さく、皮質構造が単純であるため、信号の伝播に影響を与える可能性があり、認知イベント関連電位(ERP)はヒトに比べて目立たない可能性があります¹⁵。電極配置、シグナル参照、および分析パイプラインの一貫性を確保することは、再現性と実験室間の妥当性を向上させるために重要です¹⁶。

小動物の脳波記録には、機会と課題の両方があります。マウスEEGは、通常、頭蓋骨表面に硬膜外に配置された慢性的に埋め込まれた電極、または皮質下構造に挿入された深さ電極として取得されます^17,18。硬膜に配置されたネジ電極やワイヤー電極などの表面電極は侵襲性が低く、長期にわたる縦断的な記録に適しています。このような電極は骨の下にあり、記録に対する高いインピーダンス障壁を提供します。したがって、げっ歯類の硬膜電極は、EEG よりも皮質電図検査 (eCoG) に匹敵すると考えることができます。対照的に、深度電極はより高い空間分解能を提供し、海馬、視床、扁桃体などの脳深部領域へのアクセスを可能にし、発作ネットワークと^{領域分布間の}振動結合に関する研究を容易にします^2,11。

げっ歯類用の最新の脳波システムは、高い時間分解能でのマルチチャンネル記録をサポートし、多くの場合、行動相関のためのビデオモニタリングと組み合わされています¹⁸。さらに、ワイヤレス脳波システムは、自由に行動する動物のテザリングのないリアルタイム取得を可能にし、動きの制約とストレスを最小限に抑えます¹⁹。時間の経過とともに、これらの近代化は商業的に利用可能になりましたが、それらは非常に高価であるか、げっ歯類モデルを長期間にわたって研究するには侵襲的すぎます。

このギャップに対処するために、げっ歯類モデルにおけるマルチサイトEEG取得のための多用途で費用対効果の高いプロトコルを提示し、侵襲性を最小限に抑えた長期研究に適しています。この脳波記録アプローチは、制御された実験条件下でのマウスの皮質活動の高解像度評価を必要とする研究に特に適しています。これは、(i)動物が電極移植中の短時間の麻酔に耐えて完全に回復できる場合、(ii)記録中に安定した頭の位置または最小限の動きが保証される場合、(iii)神経活動の長期または反復モニタリングが望まれる場合、および(iv)実験計画は、増幅器の容量に応じて、単一または限定的な複数動物の記録に対応できる場合に最適です。研究者は、これらの制約を考慮して、この方法が実験目的と一致しているかどうかを判断する必要があります。

プロトコル

このプロトコルは、オーガスタ大学動物管理および使用委員会から承認を受けました。実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドは、実験の各ステップで行われました。この研究で使用される動物の数を最小限に抑えるために、可能なすべての対策が実施されました。この研究に使用したマウスは、生後2か月の野生型C57Bl6Jです。各ステップの実行に必要な時間は、それぞれのステップに含まれています。

1. 電極付きプラグピンの準備(5分)

1. 5ピンのUSBタイプBメスプラグピンを使用して、0.003インチのプラチナイリジウムワイヤーはんだ付けします。ピンはんだ付けする前に、ワイヤーからコートを取り除きます。5 つのピンのうち 4 番目のピンはグランド ピンです。電極への接続には使用しないでください(図1A)。他の4つのピンを使用して電極を接続します。
2. ピンを約45°曲げ、各ピンにワイヤを2回巻き付けて、ワイヤが正しく接続されたままで、外れないようにします(図1A)。
3. 各ピンにはんだロジンフラックスペーストを少し加えてピンの表面をきれいにし、効果的にはんだ付けできるようにします。
4. 各ピンにはんだ線の小片を追加し、はんだごてを使用してはんだ線を溶かし、ピンを白金イリジウム線に恒久的に取り付けます(図1B-D)。
   注意: 45°鉗子を使用してワイヤーを保持し、別の鉗子を使用してピンに巻き付けます。明視野顕微鏡下で手順全体を行います。ラッピングとはんだ付け後に残りのワイヤーを切断し、もう一方の端を電極に取り付けたままにします。

2. 電極の埋め込み(30分)

1. 密閉チャンバー内で0.5 mLのイソフルランを浸した脱脂綿でマウスを麻酔し、マウスを定位固定ステージに取り付けます。マウスをステージに取り付ける前に、後ろ足をつまんでピンチに反応しなくなるまで待って、マウスの投与量が不足していないことを確認してください。鼻のイソフルラン/酸素人工呼吸器を1.5%v / vの速度ですばやく起動します。
2. 炎症反応と痛みを軽減するためにカルプロフェン(5 mg / kg)を、炎症と脳の腫れを軽減するためにデキサメタゾン(0.1 mg / kg IM)をマウスに注射します。麻酔薬に長時間さらされると目が乾燥して損傷する可能性があるため、目を湿らせておくために眼軟膏を使用してください。
3. 脱毛剤を使用するか、頭蓋骨の上部を剃って皮膚を露出させます。無菌技術に従って、70% エタノールとヨウ素パッドを使用して切開部を洗浄します。
4. メスで頭の真ん中に明確な一筆切開を行います。切開部の周りを切り取り、電極移植部位を露出させます。筋肉が露出していないことを確認してください(図2A)。
5. 0.9%NaCl溶液で洗浄し、表面を乾燥させます。過酸化水素に浸すか浸した綿棒で表面をこすります。骨の結合組織が持続している場合は、メスで除去できます。こすり洗い後、少なくとも1分間待ちます。
6. 穴あけを開始する前に、0.9% NaCl 溶液で洗浄し、表面を乾燥させます。
7. 歯科用ドリルを使用して頭蓋骨の表面を粗くし、アクリルの接着を促進します。
8. 電極移植の位置を測定してポイントします(AP:+2、-4、ML:±1.5)²⁰ (図2B)。
9. 1.4 mmのドリルを使用して表面にドリルで穴を開け、精密ドライバーを使用して4本の骨ネジ(1.5 mm)を穴に入れます。穴あけで骨に穴が開かないようにしてください。ネジは脳に穴を開けるのではなく、表面に触れる必要があります(図2C)。
10. 血液がある場合は0.9%NaCl溶液で洗浄し、乾くのを待ちます。必要に応じて掃除機を使用してください。
11. USBコネクタに接続されているワイヤーを各ネジに2〜4回巻き付け、残りのワイヤーを切断します(図2D)。
12. 各ネジの上部に瞬間接着剤 (ロックタイト) を少量垂らし、乾燥させて接続を強くします。コネクタが頭蓋骨の中央に配置され、頭蓋骨や電極に触れていないことを確認してください(図2E)。
13. シアノアクリレートを使用して、ヘッドキャップを少しずつゆっくりと構築します。厚すぎる層は骨を熱くする可能性があるため、塗布しないでください。骨や動物に接触しないコネクタの平らな面に、歯科用セメントを使用して USB ケーブルの差し込みを補助する大きなネジを取り付けます (図 2F)。
14. マウスを定位固定ステージから外す前に、ヘッドキャップを少なくとも2分間乾かします。ヒートパッドで次の24時間マウスを観察します。
15. マウスをカルプロフェンで次の7日間、12時間ごとに5 mg / kgの用量で治療します。マウスは、アクリル界面での骨の成長を促進するために 2 週間待機した後、脳波記録の準備が整います。
    メモ: コネクタを頭蓋骨にできるだけ近づけるようにしてください。頭蓋骨や骨ネジに触れないように注意してください。ワイヤーの両端が互いに接続されていないことを確認してください。シアノアクリレートがUSBコネクタや目に入らないように注意してください。

3. 脳波記録(65分)

1. ペンチレンテトラゾール(PTZ)治療の30分前、および20 mg / Kg PTZ治療の30分後に、各マウスの脳波を1時間記録します。
2. USBケーブルをコネクタに差し込みます。ゲインを10kに設定し、0.1Hzから250Hzの間でフィルタリングされたワニ口クリップを使用して、USBケーブルを差動交流(AC)アンプに接続します²¹。1000 Hzでの脳波信号のサンプル(図3)。
3. アンプからの出力をコンピュータに同時に記録し、オシロスコープに表示してリアルタイム監視します。アンプ出力を、コンピュータに接続されたデータ収集および信号調整(NIDAQなど)USBデバイスに接続します(図3)。
4. Python コードを使用して EEG 信号を記録します (https://github.com/schrodi159/blakelabeeg で入手可能)。このコードは、0.1 Hz と 250 Hz で信号をデジタル フィルタリングします。
   注:電気的干渉のない部屋でEEGを記録すると、データと記録の品質が向上します。

4. データの解釈

1. Python コードを使用してデータを視覚化します (https://github.com/schrodi159/blakelabeeg で入手可能)。各記録から発作間期の分泌物を特定します(図4A)。
   注: 波形がベースラインの 2 倍で、持続時間が 200 ミリ秒未満²² で、次の 5 つの基準のうち少なくとも 4 つに従う場合、発作間放電が考慮されました - 尖ったピークを持つ二相波または三相波、バックグラウンドとは異なる持続時間、波形の非対称性、バックグラウンド活動の存在によって中断され、その後に徐波⁸ が続く^、20,22。

結果

5匹の野生型C57Bl6Jマウスを含むC57Bl6Jバックグラウンド上の20匹のマウスに電極を移植し、術後85%の術後生存率は手術後6か月まで維持されました(図4B)。6か月後、ヘッドキャップが剥がれ始め、すべてのマウスは生後8か月で安楽死させました。コネクタとネジを含むヘッドキャップアセンブリの平均重量は 1.13 g (n = 20) でした。マウスは手術後30分以内に意識を取り戻し、12時間以内に通常の動きと視線を再開した。

20 mg/kg のペンチレンテトラゾール (PTZ) の投与前後に EEG 記録を取得し、埋め込まれた電極が化学的に誘発されたけいれんに関連する電気生理学的変化を検出できることを確認しました。データを分析するために、各マウスの発作間期の分泌回数をカウントしました。このシステムは、 図4Cに示すように、C57BL/6JマウスのPTZ誘発性変化を確実に捉えました。PTZ治...

ディスカッション

この研究では、自由に動くマウスにおける慢性的なマルチサイト脳波記録のための、堅牢で費用対効果の高い低侵襲プロトコルを開発し、検証しました。USB コネクタにはんだ付けされたスクリュー電極と特注の白金イリジウム電極の埋め込みの成功は、観察された生存率と記録品質とともに、慢性記録におけるこの技術の実現可能性と信頼性を示しています。特に、このプロトコルにより、大規模な外科的介入や法外に高価なハードウェアを必要とせずに正確な電気生理学的データを収集できるため、幅広い研究室や実験デザインで利用できるようになります。

重要なイノベーションは、シンプルさ、耐久性、費用対効果の組み合わせにあります。高^コスト8または技術的な複雑さによって制限されることが多い市販のシステムと比較して^23,24、このアプローチは、動物福祉と実験の再現性を維持しながら、複数の皮質領域にわたる...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.003インチプラチナイリジウムワイヤー	AMシステム	777000
1.5mmのボーンスクリュー	アントラン・ミニチュアの専門分野		000-120X1/16 SL バインド MS SST
ACアンプ	AMシステム
カープロフェン	コヴェトルス	11695-6935-1
Coldpac 入れ歯アクリルベース	イェーツ・モトロイド・カンパニー	https://www.yates-motloid.com/collections/coldpac/denture-base
歯科用ドリル 1.4mm	ボルヴェールGX	該当なし
デキサメタゾン	VEDCO	50989-437-12
眼の潤滑剤	オプティックスケア	https://theoptixcare.com/
過酸化水素	シグマ・オルドリッチ	7722-84-1
NIDAQ USB	ナショナル・インストゥルメンツ	https://www.ni.com/en/shop/data-acquisition/entry-level-usb-daq.html	データ取得および信号調整のUSB
ペンチレンテトラゾール	ケイメン・ケミカルズ	18682
はんだロジンフラックスペースト	ウェラー	https://www.weller-tools.com/us/en/consumer/products/soldering-accessories/
はんだ配線 0.32インチ	ラジオシャック	該当なし
瞬間接着剤	ロックタイト	該当なし
USBタイプBのメスプラグ	QMセラー	X00292ABU9