マウス胚性幹細胞におけるエンハンサーRNA安定性の最適化された定量的評価

Summary

本プロトコルは、アクチノマイシンD処理、RT-qPCR、非線形回帰解析を用いて、マウス胚性幹細胞における遺伝子間および遺伝子内強化RNAの安定性と半減期を定量的に測定します。位置特異的な正規化戦略を組み込み、文脈依存的なeRNA崩壊動態を正確にモデル化します。

Abstract

エンハンサーRNA(eRNA)は、転写活性のエンハンサー領域から産生される非コード転写産物であり、遺伝子発現の主要な調節因子としてますます認識されています。機能的重要性にもかかわらず、eRNAの安定性および分解動態は依然として十分に解明されていません。特に胚性幹細胞(ESC)では、転写プログラムが非常に動的かつ文脈依存的です。本プロトコルは、マウスESCにおける遺伝子間および遺伝子内eRNAの崩壊速度論と半減期を評価する定量的手法を提示します。転写はアクチノマイシンDを用いて阻害され、複数の特定された時間点で総RNAが収集されます。cDNAはランダムヘキマープライマーとオリゴ(dT)プライマーの両方を用いて合成され、ポリアデニル化および非ポリアデニル化の両方の転写産物を検出できます。遺伝子間eRNAでは、ハウスキーピング遺伝子または時刻0分のCt値を用いて正規化が行われます。遺伝子内eRNAでは、重なり合うプレmRNAからの干渉を最小限に抑えるために二重正規化アプローチが用いられます。減衰曲線は一相指数減衰モデルを用いて解析され、半減期の正確な推定が可能となります。このプロトコルは、mESC中のeRNAが約2〜3分の半減期を持つ急速なターンオーバーを示すことを明らかにしました。この手法はeRNA安定性の研究に強固かつ再現性のある枠組みを提供し、多能性幹細胞の文脈におけるエンハンサー活性およびRNA動態に関する洞察を提供します。

Introduction

エンハンサーはシス調節要素(CRE)であり、転写因子および共調節因子1,2,3,4,5,6の結合プラットフォームとして組織および刺激特異的遺伝子発現を調節します。エンハンサーは線形ゲノムレベルで標的遺伝子から遠くに位置することもありますが、クロマチンループ機構によりプロモーターとの空間的近接性が可能となり、転写制御を促進します。アクティブエンハンサーはRNAポリメラーゼII(Pol II)によって双方向に転写され、エンハンサーRNA(eRNA)と呼ばれる長く非コードRNAを産生します。これらの中央値の長さは通常約1 kb 1,2,7,8,9です。eRNAの発現は近傍の標的遺伝子の活性化と強く相関しており^、機能的研究ではeRNAの枯渇が標的遺伝子の転写を減少させることが一貫して示されており、eRNAは転写副産物ではなく機能的調節因子として機能していることが示唆されています⁽13,14,15,16,17)。.機能的重要性にもかかわらず、eRNAを確実に検出・定量するための実験プロトコルは限られています。

幹細胞において、エンハンサー活性は多能性の維持と発生転移の促進に重要な役割を果たします。^18,19。エンハンサーは遺伝子間領域(遺伝子間または外遺伝子エンハンサー)に存在することも、遺伝子体内にイントジェニックエンハンサーとして埋め込まれることもあります^。遺伝子間増強子は様々な細胞型で広く研究されていますが、遺伝子内増強子は宿主遺伝子前mRNAとの転写重複や転写延長に伴うヒストン修飾の存在などの技術的課題により、依然として比較的十分に研究されていません^20,21。それにもかかわらず、最近の研究では、遺伝子間および遺伝子内増強子の両方がESCにおける多能能性^22,23および早期分化²⁴に関与する遺伝子調節ネットワークに寄与していることが示されています。特筆すべきは、全注釈強化因子のほぼ半数が遺伝子内であり^、その活性は発生段階によって変化し、分化組織^8,26,27,28で増加することが多いです。しかし、ESCにおける遺伝子内増強子の有病率および機能的役割は、まだ完全には解明されていません。特に、遺伝子間eRNAは遺伝子間で転写されますが、遺伝子内eRNAは遺伝子体内で転寫され、プレmRNA転写産物と重なり合うことがあります。この位置の違いにより、遺伝子間および遺伝子内eRNAの解釈と定量には異なる分析手法が必要です。

mRNAとは異なり、eRNAは通常3′のポリ(A)テールを持たず、安定性が低く、^分解が速い1,2,7,8,9となります。この本質的な不安定性は、特に時間経過実験においてeRNA発現の解析を困難にしています。ニューロンでは、eRNAの半減期が7.5分¹⁷秒と短くなると報告されています。しかし、この不安定性が異なる細胞タイプ間で一貫しているかは依然として不明であり、特にエンハンサー活性とeRNA転写が細胞型^特異的であるため7,17,29,30です。ESCは多能性を維持したり分化を開始したりするために動的な遺伝子調節プログラムに依存しており、eRNAターンオーバーを検査する独自のシステムです^31,32。ESCの急速な転写シフトを踏まえ、この文脈でのeRNA崩壊を理解することで、エンハンサー活性がどのように時間的に調節されているかが明らかになるかもしれません¹⁷。さらに、遺伝子間および遺伝子内eRNAの違い、例えば宿主遺伝子転写産物との重複は、異なる分析的アプローチを必要とし^ます。これらの問題の重要性にもかかわらず、ESCにおけるeRNA半減期を測定したり、異なるeRNAタイプの崩壊ダイナミクスを比較したりするための標準化された方法はほとんど存在しません。

本研究は、mESCsにおける遺伝子間および遺伝子内増容子から転写されたeRNAの安定性と半減期を評価する定量的プロトコルを提示します。転写阻害は、定められた時間間隔でアクチノマイシンD(ActD)を用いて達成され、その後リアルタイムの定量PCR(RT-qPCR)および非線形回帰解析でeRNA崩壊を定量します。遺伝子間エンハンサーと遺伝子内エンハンサーの位置の違いに対処するため、この手法は異なる正規化戦略を取り入れ、eRNA分解動態の体系的かつ正確な比較を可能にします。この構造化された分析フレームワークは、多能性幹細胞におけるeRNAターンオーバーに関する貴重な洞察を提供します。

Protocol

本研究のすべての実験はマウス胚性幹細胞(mESC;E14Tg2A)は、当研究所で直接生成されたものではなく、確立された細胞株から得られ、この細胞株はATCC(CRL-1821)でも商業的に入手可能です。したがって、本記事で述べた研究は忠南国立大学の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)による審査を必要としません。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. mESCの細胞培養

1. 6ウェル培養プレートに0.1%ゼラチン(1ウェルあたり2 mL)でプレコートします。プレートを37°Cで10分間孵化します。
2. ゼラチンを吸引し、それぞれの井戸を1mLのPBSで1回洗います。プレートは少なくとも15分間紫外線照射で滅菌してください。
3. 完全な2 mLの細胞培養培地を用いてゼラチン被覆プレートにmESCを種子化します(表1)。
   注意:実験に必要な培地の総体積に基づいて、使用直前に必要な濃度でLIFを新鮮に培養培地に加えてください。

コンポーネント	最終集中	使用量
グラスゴーの最低限必須ミディウム(GMEM)	-	500 mL
ノックアウト™血清置換(KOSR)	10%	50 mL
ペニシリン・ストレプトマイシン	0.50%	2.5 mL
胎児用牛血清(FBS)	1%	5 mL
ピルビン酸ナトリウム	0.1 mM / 1%	5 mL
MEM非必須アミノ酸溶液(MnEA)	0.1 mM/1%	5 mL
2-メルカプトエタノール	0.1 mM	910 uL
白血病阻害因子(LIF)	1000 U/mL	-

表1:mESC培養培地の組成。 mESC培養培地の調製に使用された成分および最終濃度。典型的な体積は、総培地500 mLあたりの量を示します。

4. 細胞は標準培養条件下で37°Cの加湿インキュベーターで_CO2濃度5%を保ちます(図1A)。

図1:eRNA安定性解析の実験設計。 (A) 転写停止実験の概説。細胞は0.1%ゼラチン被覆の6ウェルプレートにプレートされ、収穫後指定された時刻(0分、5分、10分、15分、20分、30分)にactD(最終濃度:5μg/mL)で処理されました。(B) RT-qPCRアッセイのレイアウト。全RNAはランダムヘキマーまたはオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写されました。各時点のcDNAサンプルは、 Tbp_mRNA、遺伝子間eRNA、遺伝子内eRNAに対してRT-qPCRを用いて分析しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. アクチノマイシンD(ActD)治療

1. actDをDMSOに溶解させ、1 mg/mL濃度のストック溶液を準備^します。
   注:ここではアクチノマイシンDが短期的な転写阻害に用いられますが、今後の研究ではトリプトリドなどの代替阻害剤が転写開始を阻害するために用いられる可能性があります。アクチノマイシンDとDMSOはどちらも光に敏感なので、ストック溶液を琥珀マイクロチューブで準備し、光から守って-20°Cで保存して使用してください。
2. 細胞シードから2日後(または収穫日)に、actDストック溶液を培養培地に最終濃度5 μg/mL³³に加えます。処理後0分、5分、10分、15分、20分、30分にサンプルを採取してください(図1A)。
   注:ほとんどのeRNAは0〜30分の間に急速な崩壊を示しますが、一部のeRNAは半減期が長い場合があります。ターゲット遺伝子座の特徴に応じて、崩壊速度論をより正確に捉えるために、1時間、3時間、6時間などの延長された時間点での追加のサンプリングを含めることができます。本研究では、アクチノマイシンDを5 μg/mLの濃度で短期(≤30分)の転写遮断に用い、しかし、より長時間の潜伏(>1時間)では、細胞のストレス反応を最小限に抑えるために濃度を1〜2 μg/mLに減らすことが推奨されます。DMSO自体が転写活性に影響を与える可能性があるため、DMSOのみの対照群も含めるべきです。

3. RNA抽出とcDNA合成

1. 吸引で培地を除去し、各ウェルに1mLのトリゾル試薬を加えます。プレートをシェーカーで室温(RT)^34,35で10分間培養し、その後新しい1.5mLチューブに溶解液を移します。
   注:TRIzol処理後、サンプルはRNA抽出の1週間前まで-80°Cで保存されることがあります。TRIzol試薬にはフェノールやグアニジニウム・イソチオシアネートが含まれており、これらは非常に有毒かつ腐食性があるため、慎重に取り扱ってください。すべてのTRIzol廃棄物は、適切な処分のために指定された有機溶剤廃棄物容器に集めてください。
2. 各サンプルにクロロホルム500μLを加えます。チューブを強く振ってRTで3分間孵育します。
3. サンプルを13,500× g で4°Cで10分間遠心分離します。
4. 水相を新しい1.5mLチューブに慎重に移し、同量のイソプロパノールを含みます。RNA沈殿を促進するためにRTで10分間培養します。
   注意:間相との汚染を避けるため、透明な上部水相のみを慎重に移してください。RNA収率を高めるために、イソプロパノールを加えた後、-20°Cで1時間から一晩(O/N)を培養します。低入力サンプルの場合は、イソプロパノールを加える直前にグリコーゲン(最終10〜20 μg/mL)またはグリコブルーを加え、RNAペレットの可視性と回収効率を向上させます。イソプロパノールは非常に可燃性が高く、人間の健康に有害である可能性があります。蒸気の吸入や皮膚・目への接触は、刺激、頭痛、めまい、または中枢神経系の抑制を引き起こすことがあります。慎重に取り扱い、残った溶液はすべて認可された有機溶剤廃棄物容器に集めて適切に処分してください。
5. サンプルを13,500 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
6. 得られたRNAペレットを75%エタノール1mLで洗浄します。遠心分離機で6,800 × g 、4°Cで5分間。
   注意:エタノールを加えた後はチューブを優しく反転させてペレットを持ち上げます。
7. 上澄液を慎重に除去し、42°Cで10分間自然乾燥させます。 乾燥ペレットをRNaseフリーの水に再懸浮させ、55°Cで10分間培養します。
   注意:RNA純度が高い場合、白いペレットは自然乾燥の過程で半透明になることがあります。ペレットを10分以上乾燥させすぎないように注意してください。過度の乾燥は再懸濁効率を低下させます。
8. ナノドロップ分光光度計を用いてRNA濃度と純度を測定します。
9. 製造元の指示に従い、M-MLV cDNA合成キットを用いてμgのRNAからcDNAを合成します(表2)。

コンポーネント	使用量
10X M-MLV RTバッファ	2 uL
dNTP	2 uL
プライマー(ランダム/オリドdT)	1uL
M-MLV RT	1uL
RNASE阻害剤	0.5 uL
RNAサンプル	2μg(RNAサンプル濃度に基づく体積調整)
DW	RNAサンプル濃度に応じて体積を調整し(最終体積を補う)
総体量	20 uL

表2:cDNA合成反応(M-MLV逆転写酵素)の組成。 M-MLV cDNA合成キットを用いた2μgの全RNA逆転写に使用された詳細な体積と試薬。RNAサンプルの体積は濃度に応じて調整され、ヌクレアーゼフリーDWを加えて最終反応容積を20μLにしました。

10. cDNA反応を37°Cで2時間インキュベートし、その後85°Cで5分間熱不活化します。
    注意:合成されたcDNAは-20°Cで保存してください。 典型的なcDNA濃度は約100 ng/μLです。遺伝子内eRNAを検出するために、同じRNAサンプルからランダムヘキマープライマーとオリゴ(dT)プライマーの両方を用いてcDNAを合成します。

4. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)

1. 10μL反応混合物を準備し、15 ngのcDNA、5μLのPower SYBR Green PCRマスターミックス、各プライマー5 pmol、蒸留水(DW)を含みます。
   注意:eRNA遺伝子座はしばしば繰り返し配列を含むか隣接しているため、慎重なプライマー設計が必要です。BLASTを用いてリピートマスク配列を用いて候補領域を制限し、ゲノム全体でのプライマーペア特異性を検証します。可能であれば、非特異的増幅を排除するために近隣のコントロール領域を含めること³⁶。
2. リアルタイムPCRシステムを用いて増幅を行います。熱サイクル条件は以下の通りです:50°Cで2分間、95°Cで10分の初期活性化と変性ステップ、その後95°Cで15秒間40回の変性、60°Cでのアニーリング、伸長、蛍光測定を1分³⁴秒行^{います。37}(表3)。

舞台	歩	温度(°C)	時間	サイクル
ホールドステージ	逆転写	50	2分	1
	初期変性	95	10分	1
PCRステージ	変性	95	15秒	40
	アニーリング/エクステンション	60	1分	40
溶融曲線ステージ	変性	95	15秒	1
	アニーリング	60	1分	1
	解離(融解曲線)	95	15秒	1

表3:RT-qPCRの熱循環条件。 逆転写、40サイクルqPCR(10μL反応)、標準溶融曲線解析のための温度、時間、サイクル条件の要約。

3. 遺伝子内eRNA定量では、オリゴ(dT)プライマーで合成されたcDNAを用いて 、Tbp (または他のハウスキーピング/コントロール遺伝子)と遺伝子内エンハンサー領域の両方を解析します。遺伝子間eRNAについては、ランダムなヘキマープライマーで合成されたcDNAのみを使用します(表4 および 図1B)。
   注意:各サンプルは技術的な重複(2つの井戸)で運用し、データ解析時に平均化できるようにしてください。

遺伝子名	プライマープローブ	シーケンス(5'-3')	アンプリコンサイズ
簡章	フォワード	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122年前
	逆	TTGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTT
Nsun2_mRNA	フォワード	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93年前
	逆	ATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNA	フォワード	TCCCTACAGCAGAGATCACTCAC	80 bp
	逆	CGCCGGTTACAGAGAACCATAC
Sox2_mRNA	フォワード	アカガトカッカッガッカッ	105 bp
	逆	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	フォワード	CCTGAGGTGTGTGTGTGT	110 bp
	逆	AGGTTAACACATCACCCCCA
Pou5f1_eRNA	フォワード	カッタッカッカッカクッ	107年前
	逆	CCAGGACAAGACACCCATTG
Sox2_eRNA	フォワード	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119年前
	逆	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative制御	フォワード	CCCCGTGTTTTTAAGAGGAATGA	88年前
	逆	ACTGAGAACACACCCACTAGCA

表4:RT-qPCR解析用のプライマー配列。 RT-qPCR実験における各標的遺伝子の特異的増幅に用いられる順方向および逆プライマー配列。これらのプライマーはmRNAおよびeRNA発現の正確な定量を確保するために最適化されました。

5. eRNA安定性データ解析 ²²

1. すべてのデータをΔCt法で解析し、相対的なeRNAレベルを Tbpに正規化します_mRNA(補足ファイル1 および 図2A)。
   注:2つの技術的重複間のCt値差が0.5を超える場合は、そのデータを解析から除外してください。ΔCt法を用いて、対照遺伝子のCt値を標的遺伝子の値を差し引いて相対的な遺伝子発現レベル(例: Tbp_mRNA)を差し引い(ΔCt = Control_Ct - Target_Ct)計算します。相対式は2^-ΔCt(補足ファイル2B)として計算できます。
2. 遺伝子内eRNA定量では、ランダムヘキマーで合成されたcDNAの値を、オリゴ(dT)プライマーで合成されたcDNAの値を割って発現値を正規化します。
   注意:すべてのqPCR反応は3つの独立した生物学的複製(n=3)を用いて実施してください。
3. 各時刻点の表現レベル(ΔCt 法で得られた)を0ミニット値に正規化し、減衰曲線をプロットします。
   注:このプロトコルは短期間のアクチノマイシンD処理を用いていますが、転写阻害剤(例:ActD)への長期曝露はハウスキーピング遺伝子発現を低下させる可能性があります。高精度定量のためには、細胞溶解段階に外因性スパイクインRNA(例:ERCC)を追加し、RNA抽出効率、逆転写効率、ピペッティング精度の変動を補正し、サンプル間でより一貫した正規化を可能にすることを推奨します。^38,39。
4. GraphPad Prism(補足ファイル3)で、時間経過によるeRNAレベルを正規化し、非線形回帰モデル(一相指数関数的崩壊)を用いて適合させます。
5. 個々の生物学的複製からeRNAの半減期を推定する。
   1. GraphPad Prismを開き、「 XY>作成 」を選択します(オプション:X = 数字;Y = 入力し、各点に対して単一のY値をプロットします。
   2. 時間ポイント(0、5、10、15、20、30分)をX軸の数値として入力します。
   3. Y軸(グループ)にサンプル名を記載し、各時刻点に対応する単一データ値を入力します。
   4. 「 >回帰分析および非線形回帰(曲線適合)>曲線解析」を選択してください。
   5. 指数 関数 タブで「 一相減衰 モデル」を選択してください。
   6. 「 結果表 」シートで、各サンプルの半減期値の平均および標準偏差をExcelなどソフトで計算します。その結果得られる値をプロットします。
6. 95%信頼区間を用いた適合減衰曲線
   1. GraphPad Prismを開き、「 XY>作成 」を選択します(オプション:X = 数字;Y = 3つの重複値を並べて並べたサブカラムに入力)。
   2. 時間ポイント(0、5、10、15、20、30分)をX軸の数値として入力します。
   3. Y軸(グループ)にサンプル名を記載し、各eRNAサンプルの3つの複製値を対応するデータシートに入力してください。
   4. 「 >回帰分析および非線形回帰(曲線適合)>曲線解析」を選択してください。
   5. 指数タブで解析のために一相減衰モデルを選択してください。
   6. 結果表で、三重サンプルの解析から得られた95%信頼区間(CI)値を抽出します。
      注意:以下の崩壊方程式を用いてください:Y = (Y₀ - プラトー) • ^e-kt + プラトー。ここでYは時刻t時点の相対eRNAレベル、Y₀は初期eRNAレベル、kは崩壊定数です。eRNA曲線フィッティング中にプラトーをゼロに固定しないでください。過去の研究ではeRNAが持続し、時間とともに完全に劣化しない可能性があることが示されています^(17,40)。ただし、mRNA崩壊を解析する際は、従来のmRNAプロトコル^41,42に従いプラトーをゼロに固定します。GraphPad PrismでeRNAの半減期(t₁/₂)を自動的に計算できるようにします:t_1/2 = In(2)/ k。時間をminで入力します。得られた半減期値を最小単位で報告してください。

Results

転写停止後のRNA安定性を評価するために、mESCにactDを投与し、定義された時刻(0分、5分、10分、15分、20分、30分)に総RNAを採取しました。cDNA合成後、RT-qPCRを用いて Nsun2 および Sox2の遺伝子内eRNA、 Pou5f1の遺伝子間eRNAおよびそれらに対応するmRNAを定量しました。これらのデータは時間依存の劣化曲線を生成するために用いられました(図2)。成功した実験では、mESC中のeRNAは通常、actD処理から5分以内に急激な発現低下を示した一方で、mRNAはより安定しており、減少度合いが小さく、30分以上比較的安定したレベルを維持していました。

Discussion

このプロトコルは、mESCにおけるeRNA安定性を測定するための信頼性が高く再現性のある方法を示しています。細胞培養、アクチノマイシンD処理、RNA抽出、RT-qPCR定量などの重要な実験ステップが図や補助ファイルに明確に示されており、ユーザーがワークフローを案内します。さらに、非線形回帰モデリングや信頼区間の解釈などの詳細な解析手順も補 足ファイル4 で提供されており、正確な半減期推定を支援しています。これらのステップの中で、正確なタイミングとactD治療の一貫した取り扱いが不可欠です。なぜなら、eRNAのような不安定な転写体の検出に直接影響を与えるからです。サンプル採取の遅延や不整合は崩壊速度論を大きく歪め、結果の再現性を低下させる可能性があります。このため、指定されたタイミング戦略に厳密に従うことが、意味のある解釈可能なデータを生成するために不可欠です。

このプロトコルは半減期30分未満の短寿命eRNA解析に最適化されていますが、サンプリングタイムラインを延長したり、ハウスキ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-メルカプトエタノール	ギブコ	21985023
アクチノマイシンD	シグマ・オルドリッチ	A9415
クロロホルム	大中化学	2548-4105
DMSO	ジェンデポ	D2680
胎児用牛血清(FBS)	シグマ・オルドリッチ	F0392
ゼラチン	シグマ・オルドリッチ	G1890-100G
グラスゴー」最低限の必須媒体(GMEM)	ギブコ	11710035
GraphPad プリズム(バージョン9)	GraphPadソフトウェア
イソプロパノール	大中化学	5035-4105
ノックアウト血清置換(KOSR)	Gibco、およびnbsp;	10828028
白血病阻害因子(LIF)	メルク	ESG1106
MEM非必須アミノ酸溶液(MnEA)	ウェルゲネ	LS005
M-MLV cDNA合成キット	酵素学	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
ペニシリン・ストレプトマイシン	ウェルゲネ	LS202-02
パワーSYBR-グリーンPCRマスターミックス	応用バイオシステム	4368708
QuanStudio1 リアルタイムPCRシステム	応用バイオシステム	A40425
ピルビン酸ナトリウム	ウェルゲネ	LS013
トリゾール	インビトロジェン	15596018