方法論記事

K562細胞のエピジェネティック工学:dCas9-DNMT3Aおよび-HDAC1融合タンパク質を用いた安定な標的DNAメチル化のためのデュアルベクターエピソーム戦略

DOI：

10.3791/69328

⸱

2025年10月31日

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、K562細胞における標的エピジェネティック編集のための非統合型エピソームCRISPR/dCas9ベースのシステムを記述し、dCas9-DNMT3AおよびdCas9-HDAC1エフェクターを特定のsgRNAと組み合わせて、遺伝子座特異的DNAメチル化を正確に誘導し、オフターゲット効果を低減します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝子転写調節におけるDNAメチル化の正確な役割を調査し、特定の遺伝子メチル化パターンを標的とする治療法を開発することは、遺伝子発現を調節するための部位特異的で長期的なエピジェネティック修飾を誘導できる汎用性の高いツールが不足しているため、大きな課題を提示しています。この研究は、基礎的なエピジェネティック研究と治療応用の両方に役立つ可能性のある、標的遺伝子座での安定した DNA メチル化を促進する革新的なエピソームベースのシステムを開発および検証することを目的としていました。これを達成するために、K562細胞株を2つの異なるエピソームベクターで同時トランスフェクトしました。どちらのベクタータイプも、 ZBTB7A 遺伝子の上流に位置するCpGアイランド326内の367 bpの非メチル化領域を標的とするガイドRNA(gRNA)を発現するように操作されました。各ベクターは、DNAメチルトランスフェラーゼDNMT3A(dCas-DNMT3A-CD)または完全長ヒストン脱アセチル化酵素HDAC1(dCas-HDAC1)のいずれかの触媒ドメインに融合した不活性化型のエンドヌクレアーゼCas9(死んだかdCas9)をコードしました。dCas配列には、タンパク質の核輸入を確実にするための2つの核局在シグナル(NLS)が含まれていました。この二重系発現カセットは、長期的なエピジェネティックなサイレンシングを潜在的に助長するクロマチン状態を促進し、堅牢で耐久性のあるエピジェネティックな結果を約束します。自己複製エピソームベクターの利用による宿主エピゲノムへのこの介入アプローチには、宿主ゲノムに組み込むことなく、複数の細胞分裂を通じて低いコピー数でベクターを維持および発現できるため、オフターゲット効果を最小限に抑え、ゲノムの完全性を維持するといういくつかの利点があります。標的 ZBTB7A CpGアイランド326におけるDNAメチル化の正確かつ有意な増加を報告します。この発見は、改変されたエピソームCRISPR/dCasシステムが、持続的な部位特異的DNAメチル化を誘発できることを検証しました。したがって、このシステムは、標的メチル化変化の機能的効果を評価するための貴重な研究ツールであり、将来のエピジェネティックな治療法を開発するための有望なプラットフォームです。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA メチル化やヒストン修飾などのエピジェネティックな調節は、遺伝子発現、細胞分化、ゲノムの安定性を制御する上で極めて重要な役割を果たします。これらのメカニズムの調節不全は、原因または結果として、さまざまな病理学的状態、特に癌、神経障害、および刷り込み症候群に関与することがよくあります1,2,3。特に、エピゲノム編集CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技術を使用して、特定のゲノム遺伝子座のエピジェネティックな風景に正確に介入することにより、基礎となるDNA配列を変更することなく、遺伝子ノックアウトモデルで観察されたレベルに匹敵する遺伝子抑制レベルを達成できます4。その結果、標的エピジェネティック編集は、遺伝子調節メカニズムを分析し、精密治療薬を開発するための有望な戦略として浮上しています。

DNA メチルトランスフェラーゼ (DNMT) 阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤は、現在臨床使用が承認されているエピジェネティック療法です。しかし、これらの薬剤はゲノム全体のエピジェネティックマーカーを非選択的に標的とし、全体的なクロマチン状態を変化させ、患者にオフターゲット効果と毒性を引き起こします5。従来のエピジェネティックな変化剤の限界に対処するために、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT3Aなど)、デメチラーゼ(TET1など)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(p300など)、デアセチル化酵素(HDAC3など)などのエフェクタードメインに融合した触媒死死Cas9(dCas9)に基づくプログラム可能なエピジェネティックエディターが開発されました6,7,8,9 .dCas9エフェクターシステムは、標的配列に二本鎖切断を導入することなく、シングルガイドRNA(sgRNA)として知られる小さなRNA分子によって誘導される遺伝子座特異的エピゲノム修飾を可能にします。最近の研究では、遺伝子発現の修飾、クロマチンのアクセシビリティのリモデリング、さらには細胞表現型のリプログラミングにも使用することが実証されています10,11,12。

急速な進歩にもかかわらず、dCas9ベースのエピゲノム工学システムは引き続きいくつかの制限に直面しています。最も一般的な課題は、エピジェネティックエフェクタードメインの非特異性によるオフターゲット効果であり、特にdCas9融合ツール13,14の強力または長期の発現を伴う。さらに、dCas9 融合体のサイズが大きいため、配送に大きな課題が生じます。化膿連鎖球菌Cas9(SpCas9)配列のサイズは約4.2 kb15であり、これはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの最大容量サイズに匹敵します。レンチウイルスベクターは比較的大きな容量(~12-1 kb)を持ち、エピジェネティックエフェクターと融合した全長SpCas9の送達を可能にしますが、ランダムゲノム統合の可能性を保持しており、挿入変異誘発のリスクがあり、臨床応用が制限されます16。一方、プラスミドトランスフェクションなどの非ウイルスアプローチは、分裂細胞での保持が不十分です。一過性または「ひき逃げ」デリバリーアプローチは、ゲノム統合の可能性を排除しますが、クロマチンリモデラーまたは協調エフェクターと組み合わせない限り、細胞分裂全体でメチル化変化を維持できないことがよくあります17,18,19。

これらの課題に対処するために、dCas9融合エピジェネティックエフェクターを送達するための非統合的自己複製エピソームベクターシステム(pEPI-S/MAR)を採用しました。このベクターは、低コピー数(細胞あたり~1〜2)で分裂細胞において染色体外に持続し、過剰発現に関連する望ましくない機能を最小限に抑えるために、持続的でありながら中程度の発現を可能にします20,21。エピソームの足場/マトリックス付着領域(S / MAR)要素は核マトリックスと相互作用し、細胞分裂中の細胞核におけるエピソームの安定した維持に寄与します22,23。さらに、pEPIベクターシステムは、ウイルスの取り込みに関連するリスクを回避し、パッケージング限界を超えることなくコンストラクトを送達することができます。

最近の研究では、活性ヒストン修飾、特にH3K27アセチル化(H3K27ac)によって特徴付けられるプロモーター領域は、操作されたDNAメチル化に耐性があることが多いことが示されています。ヒストン修飾のライターまたは消しゴムを使用してヒストンマークを除去または追加し、同時にDNMT3Aを介してDNAメチル化を導入する組み合わせアプローチは、一過性のアプローチでも、遺伝子抑制の安定性と持続性を高めることが示されています19,24。これらの洞察に基づいて、dCas9-HDAC1とdCas9-DNMT3Aを同時送達し、隣接する遺伝領域を標的とすることで、クロマチンのリモデリングが促進され、標的調節要素でのより効率的で持続的なメチル化が促進されるという仮説を立てました。

本研究では、K562細胞における内因性メチル化が低く、H3K27acマークが異常であることを特徴とする ZBTB7AのCpGアイランド326に、標的で安定したDNAメチル化を送達できるシステムを設計・構築することを目指しました。この研究の目的は、低発現、安定した非統合pEPIシステムを使用して、 ZBTB7A 遺伝子の上流にあるCpGに富む調節領域を標的とする、異なるエピジェネティックエフェクターのそれぞれに融合したdCas9をsgRNAとともにコードする2つのエピソームコンストラクトを送達することでした。 図1に示すように、K562細胞とこれらのエピソームを共トランスフェクションすると、HDAC1が局所的なヒストンアセチル化を除去してDNMT3Aによるその後のDNAメチル化を促進し、調整された部位特異的なエピジェネティック修飾をもたらします。

ここで説明するシステムは、構築サイズ、安全性への懸念、またはコストの制限によりウイルス送達が実行不可能なアプリケーションに適しています。さまざまなsgRNAのモジュールクローニングとエフェクター融合をサポートし、さまざまな標的遺伝子座に適応できます。現在、プラスミドトランスフェクションと抗生物質の選択に耐える細胞株での in vitro または前臨床研究に最適です。私たちの実装では、K562細胞におけるエピソーム送達は、リポフェクタミンベースの試薬を使用して達成され、G-418選択下で維持されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. sgRNAの設計

  1. ゲノムブラウザ(UCSCゲノムブラウザなど)を使用して、目的の遺伝子のプロモーター領域内の目的のCpGアイランドまたは調節CpG部位を特定します。ここでは、 ZBTB7A 遺伝子のCpGアイランド326(GRCh38)にデザインを適用しました。
  2. オンラインCRISPR sgRNAデザインプラットフォーム[例:CHOPCHOP Webツール(バージョン3)]を使用してシングルガイドRNA(sgRNA)を設計します。sgRNAを設計するときは、以下の推奨事項に従って、高いオンターゲット活性とオフターゲット効果を最小限に抑えてください。
    1. エンドヌクレアーゼとして SpCas9タンパク質を選択し、3'末端のプロトスペーサー隣接モチーフとして5'-NGG-3'を使用します(PAM-3')。
    2. sgRNAの長さを20 bpに選択します(PAM配列を除く)。プロトスペーサー配列に3つのミスマッチのみがあるオフターゲットマッチを許可します。
    3. 遺伝子の特定の領域を標的とすることを選択する場合は、「プロモーター」オプションを選択し、上流範囲(例えば、CpGアイランド326の上流1500 bpから3000 bp)を定義して、sgRNAを調節領域内に配置します。
    4. Doenchらによって開発されたようなオンターゲット効率スコア25を使用して、sgRNA活性を評価します。
  3. 実験用にsgRNAを選択するときは、次の基準を考慮してください。
    1. すべての候補sgRNAをターゲット領域の効率でランク付けします。予測効率の上位10〜20%のsgRNAを選択します。選択するときは、潜在的なオフターゲット部位にミスマッチ(MM0、MM1、MM2、MM3)を持つsgRNAは避けてください。
    2. dCas9-DNMTを使用した転写抑制のために、元々メチル化されていない領域または弱メチル化領域を標的とするsgRNAを選択します。dCas9-HDACを使用した転写抑制では、効率を高めるために高度にアセチル化された領域を標的とします。オンラインデータベース(ChIP-Atlasなど)を使用して、標的遺伝子座のK562細胞のDNAメチル化およびヒストンアセチル化マークを確認します。
    3. 複数のsgRNAを使用して、100〜200 bpを超える標的領域をカバーします26。
      注:エピジェネティックな修飾(メチル化および脱アセチル化)は、sgRNA結合部位の上流および下流の領域に影響を与え、これらの影響は短いゲノムスパンに限定される可能性があります。
    4. GC含有量が40%から80%のsgRNAを選択します。
      注:GC含有量が高いほどRNAの安定性とdCas結合が向上するため、sgRNAのGC含有量は重要です。
    5. 4つ以上のチミジン(T)を含むsgRNAは避け、PAM部位の上流に4つの塩基にアデニンまたはチミンヌクレオチドが位置するsgRNAを選択します。
      注:4つ以上のTは、転写の早期終了につながる可能性があります。PAM部位の上流に4つの塩基にAまたはTが位置するsgRNAは、より強いdCas結合を示す可能性があります。
    6. 二次構造形成のリスクを最小限に抑えるために、自己相補性の高いsgRNAをチェックして避けてください。
    7. いくつかのsgRNA配列の選択を確定します。
      注:4つのsgRNAがCpGアイランド326にまたがるように設計されています。sgRNA1-4の標的配列およびCpGアイランド326にわたる標的位置を補 足表1に示す。
  4. 選択したsgRNA配列(PAMトリプレットを除く)をその逆補体に変換します。順方向配列の5'末端にGATCGを、その3'末端にGを追加し、逆相補配列の5'末端にAAAACを、その3'末端にCを追加します。各sgRNAの2つの最終オリゴを市販のオリゴプロバイダーに注文します。

2. クローン作成

注:このセクションでは、dCas-エピジェネティックエフェクター融合カセットとsgRNA発現カセットの両方を運ぶエピソームベクターを生成するためのプラスミドpEPI-1の調整について説明します。クローニングワークフローとベクターアーキテクチャの包括的な概要については、 図2 を参照してください。以下に説明するすべての制限消化およびライゲーション反応は、使用される各酵素および試薬について製造業者の推奨プロトコルに従って実施され、反応仕様は 補足表2に詳細にリストされています。

  1. eGFP(増強緑色蛍光タンパク質)コード配列に隣接するAgeIおよびBspEIを使用してpEPI-1プラスミドを消化します。制限消化後、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを使用して結果として生じるオーバーハングを鈍らせます。T4 DNAリガーゼを使用して鈍い末端プラスミド骨格をライゲートし、eGFP欠失ベクターを生成します。
    注: eGFP 遺伝子の欠失は、ベクター全体のサイズを小さくするために行われます。ベクターサイズが大きいと、下流のクローニングおよびトランスフェクションステップが制限される可能性があります。
  2. DNMT3A遺伝子の触媒ドメイン(CD)とHDAC1遺伝子の全長のコード配列を取得します。各コーディングシーケンスの3'(下流)端に終止コドンを追加します。配列に隣接する制限部位BglII(5')とAseI(3')を追加します。
  3. eGFP欠失pEPI-1ベクターをBglIIおよびAseIで消化します。別に、調製したDNMT3A(CD)およびHDAC1コード配列を同じ酵素で消化します。2つの独立したライゲーション反応を実行します。
    1. DNMT3A(CD)フラグメントを消化したベクターにライゲートして、pEPI-1-DNMT3Aコンストラクトを生成します。
    2. HDAC1フラグメントを消化したベクターにライゲゲートして、pEPI-1-HDAC1コンストラクトを生成します。
      注:BglIIおよびAseI部位は、最適な発現のために、pCMVプロモーターの下流およびS / MAR要素の上流にインサートを配置します。
  4. 化学的にコンピテントな大腸菌(NEB 5-αコンピテント大腸菌、高効率など)を各ベクターからのライゲーション産物で個別に形質転換します。形質転換した細胞をカナマイシン(50 μg/mL)を含むLB寒天培地にプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。 陽性コロニーを選択し、急速沸騰ミニプレップ法27,28を使用してプラスミドDNAを単離します。
  5. 触媒的に死んだ SpCas9(dCas9)をコードする配列を取得します。次の要素を指定された順序で導入します。
    1. 5'末端:AscI制限部位、Kozakコンセンサス配列、および開始コドン(ATG)。
    2. 3' 末端: NLS、オプションで HA タグ、その後に BamHI 制限サイトが続きます。
  6. pEPI-1-DNMT3AとpEPI-1-HDAC1ベクターの両方をAscIとBamHIで消化します。dCas9インサートで同じ分解を行います。dCas9フラグメントをそれぞれのベクターにライゲートします。
    注:AscI/BamHI部位は、dCas9がDNMT3AまたはHDAC1の上流、pCMVプロモーターの真下流に挿入されることを保証します。正しい読み取りフレームを維持するために、dCas9とエピジェネティックエフェクターの間に短いリンカーまたはいくつかのヌクレオチドが存在することを確認してください。
  7. 最終ライゲーション産物を、プラスミド発現を厳密に制御した高効率のコンピテント大 腸菌 株に変換します(例:NEB 5-α F'Iq Competent E. coli、High Efficiency)。カナマイシンプレート上の形質転換体を選択します。急速沸騰ミニプレップ法を使用して、ポジティブクローンから高品質のプラスミドDNAを調製します。
  8. ナノポアシーケンシングを使用して最終的なプラスミドコンストラクト(pEPI-1-dCas9-DNMT3AおよびpEPI-1-dCas9-HDAC1)を配列決定し、すべてのコンポーネントの正しいアセンブリを確認し、オンライン翻訳ツール(Expasy翻訳ツール3.0など)を使用して読み取りフレームを検証し、オンラインアライメントツール(BLASTアライメントツールなど)を使用して潜在的な変異または組換えイベントをチェックします。
    注:大きなベクターは組換えを起こしやすく、変異を蓄積する可能性があります。したがって、徹底した配列検証が不可欠です。
  9. T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて順方向および逆方向sgRNAオリゴヌクレオチドの5'ヒドロキシル基をホスホリル化する混合物を90°Cに数分間加熱して二次構造を変性させることにより、2本の相補鎖をハイブリダイズし、一晩室温まで徐々に冷却して二本鎖DNAに完全にアニーリングします。
  10. 選択したpGuide sgRNA発現ベクターをBamHIおよびEsp3Iで消化します。T4 DNAリガーゼを使用して、アニールされた二本鎖sgRNAフラグメントを線形化ベクターにライゲートします。
  11. 特異的PCRプライマー(補足表3)を使用して、(1)U6プロモーター、(2)クローニングされたsgRNA配列、および(3)sgRNA足場を含む完全なgRNA発現カセットを増幅します。3'オーバーハングを生成しない忠実度の高いDNAポリメラーゼ(つまり、校正ポリメラーゼ)を使用して、下流のクローニングに適したクリーンでブラントエンドのPCR産物を確保します。
  12. セクション1で設計された個々のgRNAごとに、手順2.9〜2.11を繰り返します。標的特異性を維持するために、各gRNAカセットが個別に調製および増幅されていることを確認してください。
  13. ベクターpEPI-1-dCas9-DNMT3AおよびpEPI-1-dCas9-HDAC1をSacIIで消化します。DNAポリメラーゼI.のKlenowフラグメントを使用して粘着性のある末端を鈍くします。T4リガーゼを使用して、以前に増幅されたU6プロモーター-sgRNA-足場カセットをこれらのベクターにクローンします。
    注:いくつかのgRNA-エピジェネティックエフェクターの組み合わせ(例えば、sgRNA1-dCas9-DNMT3A、sgRNA2-dCas9-HDAC1など)は、実験段階で構築されました。ただし、後続のセクションで紹介する実験では、選択された2つの組み合わせのみが引き継がれました。
  14. 最終的なライゲーション産物を、プラスミド発現を厳密に制御した高効率のコンピテント大 腸菌 株に変換します。カナマイシンプレート上の形質転換体を選択します。急速沸騰ミニプレップ法を使用して、ポジティブクローンから高品質のプラスミドDNAを調製します。
  15. ナノポアシーケンシングを使用して最終的なプラスミド構築物を配列決定し、リーディングフレームを検証し、潜在的な突然変異または組換えイベントをチェックします。

3. 細胞培養とトランスフェクション

  1. K562細胞をT-75培養フラスコで37°C、5%CO2 、湿度条件下で維持します。10% ウシ胎児血清 (FBS)、1× ペニシリン/ストレプトマイシン溶液 (Pen/Strep) を添加したダルベッコの修飾イーグル培地 (DMEM) を使用します。
  2. トランスフェクション用のプラスミドを準備します。
    1. トランスフェクションごとに8 μgの総プラスミドDNAを使用するため、2つのプラスミドの共トランスフェクションには各プラスミド4 μgを使用します。260 nmの吸光度を使用してDNAを定量し、必要な量を90 μLの超純水で希釈します。
    2. 10 μLの3 M酢酸ナトリウム溶液と2.5容量の100%エタノールを希釈したDNAに加えます。
    3. 完全に混合し、-20°Cで一晩インキュベートしてDNAを沈殿させます。
      注:異なるgRNAエピジェネティックエフェクターの組み合わせ(例えば、gRNA1-dCas9-DNMT3AおよびgRNA2-dCas9-HDAC1)を持つ2つのプラスミドを共トランスフェクトする場合、下流の手順の取り扱いを簡素化するために、両方のプラスミドを同じ沈殿チューブに組み合わせることが推奨されます。
    4. 翌日、DNA沈殿チューブを11,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
      注:この段階では生細胞の取り扱いも含まれるため、バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で後続のすべてのステップを実行します。
    5. 上清を慎重に捨てます。500 μLの70%エタノールを加えてペレットを洗浄します。11,000 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
    6. エタノール上清を完全に除去します。目に見えるエタノールが残らなくなるまでペレットを自然乾燥させます。
    7. 乾燥したDNAペレットを50 μLのDMEMに完全に再懸濁します。プラスミド-DMEM溶液は、使用するまで4°Cに保ちます。
    8. 調製したエピソームDNA(再懸濁溶液約2.5 μL)を1%アガロースゲル上に400 ng流し、トランスフェクション前にDNA精製の成功と完全性を検証します。
  3. セルを準備します。
    1. トランスフェクション効率を確保するために、培養物が50〜60%のコンフルエントに達したら、T-75フラスコからK562細胞を回収します。
    2. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。2細胞×10細胞5細胞を含む容量を、FBSまたは抗生物質を含まない900 μLのDMEMを含む35 mm培養皿に移します。
      注:トランスフェクション手順のすべてのステップに無血清DMEMを使用してください。トランスフェクションのインキュベーション期間が完了した後にのみ、完全な培地培養条件を再開します。
    3. 皿をインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れて、細胞をトランスフェクションの準備が整った状態に保ちます。
  4. プラスミド送達には、リポフェクタミンベースのトランスフェクションキットを使用します。使用する特定のキットの製造元の指示に従い、必要に応じて容量を調整してください。
    1. 調製したプラスミド-DMEM溶液に3 μLのP3000試薬(トランスフェクションキットに付属)を加えます。穏やかに混合し、プラスミド-P3000試薬混合物を室温で5分間インキュベートします。
    2. 5 μLのLipofectamine 3000試薬(トランスフェクションキットに付属)を十分なDMEMとともに加え、総反応量100 μLに達します。室温で15分間インキュベートします。
    3. 100 μLのトランスフェクション混合物全体を、細胞を含む35 mmディッシュに加えます。プレートを軽く振って混合物を分散させ、皿をインキュベーターに戻します。
  5. トランスフェクション後24時間で、3 mLのフル培地(10%FBSおよび1× Pen/Strepを添加したDMEM)を各35 mmディッシュに加え、トランスフェクトされた細胞の増殖を開始します。トランスフェクション後72時間で、G-418抗生物質を最終濃度1 mg/mLまで添加して選択手順を開始します。
  6. 選択が適切に確立され、総細胞数が1×106を超えたら、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)を使用して単一クローン(図3A)を単離します。
    1. 300 × g で 25 °C で 6 分間遠心分離して細胞を回収します。 1×滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH~7.4)で1回洗浄し、同じ条件下で再度遠心分離します。
    2. 細胞ペレットを1× PBSに再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞濃度を測定します。懸濁液を1×106 細胞/mLに希釈し、完全な再懸濁を確実にします。
    3. 96ウェル組織培養処理プレートを収集デバイスとして使用して、FCSを単一細胞モード(液滴あたり1細胞を確保)に短縮してセットアップします。使用する機器に応じて、必要に応じてソフトウェア設定を調整します(図3B)。
    4. 予想されるサイズ (FSC) と粒度 (SSC) に基づいて主要な母集団をゲートします。破片(低FSC/SSC)や粒状または死んだ物質(高SSC)を排除します。FSC-A 対 FSC-H または SSC-A 対 SSC-H のドット プロットを使用して、一重項をゲートします。
    5. 96ウェルプレートに、ウェルあたり1 mg/mLのG-418を含む100 μLのフル培地を事前に充填します。選別する前に、インキュベーターでプレートを温めます。
    6. ソート精度を高めるために、ソート速度を300イベント/秒未満に維持し、シングルセルモードでソートを実行します。
    7. 選別後、ウェルを顕微鏡で検査し、ウェルごとに1つのセルを確認します。プレートを5%CO2で37°Cのインキュベーターに入れます。
  7. シングルセルクローンを96ウェルプレート内で個別に増殖させます。クローン増殖が確立されたら、G-418濃度を400μg/mLに減らして選択を維持します。
  8. 各クローンが~1 ×10 6 細胞に達するまで、順次、必要に応じてT-25、最後にT-75フラスコに順次移します。
  9. ダブルセルペレットを一定の間隔で収集します。ゲノムDNA抽出のためにペレットを-20°Cで保存します。さらに、RNA抽出とcDNA合成のために、500 μLのTrizol試薬に均質化されたペレットを-20°Cで保存します。
    注意: Trizol 試薬は、個人用保護具を着用した状態で化学ヒューム フード内で毒性と腐食性があるため、取り扱いに注意する必要があり、汚染された物質には有害廃棄物処理のラベルを付ける必要があります。
  10. 従来のフェノールクロロホルム抽出を使用して、選択されたクローンからゲノムDNAを抽出し、続いてエタノール沈殿を行います。
    注意: フェノール:クロロホルムは有毒で腐食性があるため、個人用保護具を着用したまま化学ヒュームフードで取り扱う必要があります。フェノールおよびクロロホルムを含む廃棄物は、有害化学廃棄物として処理します。
  11. DNAがヌクレアーゼフリーの水またはTEバッファーに完全に再懸濁されていることを確認します。下流のアプリケーションに進む前に、分光光度計を使用してDNA濃度と純度を測定します。
    注:このDNAは、エピジェネティックな編集効率を評価するために、PCRやパイロシーケンシングなどの下流実験で使用されます。
  12. Trizol試薬を使用して細胞ペレットからトータルRNAを抽出し、続いてイソプロパノール沈殿させます29。RNAサンプルは、RNaseフリーの試薬と使い捨て製品を使用し、手順中はサンプルを4°Cに維持することにより、慎重に取り扱ってください。
    注:トータルRNAは、逆転写キットを使用したcDNA合成に使用されます。

4. クローンにおける両方のエピソームの存在を確認するためのPCR

  1. 細胞を完全に再懸濁した後、各培養クローンから約5×105 個の細胞を回収します。7,000 x g で25°Cで3分間遠心分離します。 上清培地を廃棄します。
  2. 1× PBSに再懸濁して細胞を洗浄します。同じ条件下で再度遠心分離します。
  3. 上清を捨て、ペレットレベルのすぐ上に少量を残します。1 μLの細胞懸濁液をPCRのテンプレートとして直接使用します。
  4. または、トランスフェクトされたクローンから抽出した200 ngの精製ゲノムDNAを使用します。
    注:洗浄された細胞からの直接PCRは、迅速なスクリーニング方法を提供しますが、結果が異なる場合があります。特異性と感度を高めるには、精製されたゲノムDNAをテンプレートとして使用します。
  5. 表1に従ってPCRマスターミックスを調製します。
  6. dCas9配列を標的とする共通のフォワードプライマーと、各エピジェネティックエフェクターベクターに特異的な個別のリバースプライマーを備えた2セットのプライマーを使用します(補足表3)。
  7. 表2に示すサイクル条件に従ってください。
  8. アガロースゲル上でPCR産物を実行させるか、キャピラリー電気泳動で分析して、製品サイズを確認します:DNMT3A含有ベクターで230 bp、HDAC1含有ベクターで205 bp(図3C)。ポジティブコントロール(10〜20 ngの濃度で両方のプラスミドを混合)を含めて、予想されるバンドサイズを確認し、PCR効率を検証します。テンプレートなしコントロール (NTC) を含めます。
試薬最終濃度/量
10× バッファ1×
フォワードプライマー1 μΜ
リバースプライマー0.5 μM
デオキシリボ核酸200 ng
ポリメラーゼ1.25 U
dNTP各200μM
水、ヌクレアーゼフリー50 μLまで

表1:エピソーム検証用のPCR反応混合物。

歩温度、°C時間サイクル数
初期変性953分1
変性9530秒30
アニーリング5830秒
延長721分
最終延長725分1

表2:エピソーム検証のためのPCRサイクル条件。

5. ターゲットパイロシーケンシング解析

  1. トランスフェクトされたクローンから抽出したgDNA(1.5 μg)を、製造元の指示に従って亜硫酸水素塩変換キットで処理します。
  2. 構築物の標的となる調節領域内のCpG部位に隣接するプライマーを設計します。専用の亜硫酸水素プライマー設計ツールを使用してください。次の設計ガイドラインに従ってください。
    1. CpGアイランドまたはCpG部位の調節領域を亜硫酸水素塩変換バージョンに変換します。
    2. 亜硫酸水素塩変換DNAのPCR増幅のための順方向および逆方向のプライマーを設計します。ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに固定化するために、1つのプライマー(通常は逆)にビオチン標識を含めます。
    3. 目的の最初のCpGの上流にあるPCR産物の内部にシーケンシングプライマー(18〜25 bp)を設計します。標的領域として、sgRNA結合部位の上流または下流の100 bpウィンドウを選択して、潜在的な局所エピジェネティック修飾を評価します。
    4. バイアスのない増幅を確保するために、プライマー配列内のCpG部位は避けてください。
    5. Assay Designソフトウェアスコアが75%を超え、品質評価が「高」(青)で、ソフトウェア分析で問題や懸念が特定されなかったことを示すプライマーペアを選択します。
      注:CpGアイランド326を標的とするように設計されたプライマー配列については、 補足表3を参照してください。プライマーは、sgRNA1およびsgRNA2結合部位に隣接する領域に結合するように設計されており、標的遺伝子座を取り巻くCpG部位の配列決定が可能です。
  3. 亜硫酸水素塩テンプレートに最適化された忠実度の高いホットスタートDNAポリメラーゼを使用してPCR反応を設定します。
  4. パイロシーケンシング手順:
    1. ビオチン化PCR産物をストレプトアビジンでコーティングされたセファロースビーズに結合し、パイロシーケンシングワークステーションを使用して一本鎖DNAを単離します。
    2. シーケンシングプライマーをアニーリングバッファー内の一本鎖DNAに加えます。混合物を80°Cに2分間加熱し、室温まで徐々に冷却します。
    3. パイロシーケンシング装置とプライマー設計時に定義された分注順序を使用してシーケンス反応を実行します。
  5. データ分析:
    1. 専用のパイロシーケンシングソフトウェアを使用して、各CpG部位のメチル化率を定量化します。
    2. トランスフェクトされたクローンとトランスフェクトされていないクローンのメチル化レベルを比較します。編集効率を評価します(図3D)。両側対応のないt検定を実行して、未処理の対照と個々のCpG部位のトランスフェクトされた各クローンのメチル化レベルを比較することを検討してください。

6. dCas発現解析のためのcDNA合成とデジタルPCR

  1. トランスフェクトしたクローンから抽出したトータルRNA(反応あたり1,100 ng)を12 μLのRNaseフリー水で調製します。サンプルを氷の上に保管してください。
  2. ゲノムDNA除去ミックスを氷上で組み立てる:2 μLのgDNAワイプアウトバッファー、1,100 ngの総RNAを含むRNAサンプル、およびRNaseフリーの水を14 μLの最終容量に混合します。42°Cで2分間インキュベートし、氷の上に置きます。
  3. 逆転写マスターミックスを氷上で調製する:4 μLのRTバッファーと1 μLのRTプライマーを混合し、1 μLの逆転写酵素を加えます。
  4. 14 μLのゲノムDNA除去ミックスと6 μLの逆転写マスターミックスを組み合わせて、総反応量を20 μLにします。穏やかに混合し、42°Cで15分間インキュベートします。95°Cで3分間加熱することにより、逆転写酵素を不活性化します。
    注:cDNAは、さらに使用するまで-20°Cで保存してください。
  5. すべてのサンプルからヌクレアーゼフリーの水で1:1でcDNAを希釈します。dCas特異的プライマーを備えたデジタルPCRシステムを使用して、希釈したcDNAをダウンストリームのデジタルPCR分析に使用します(補足表3):
    1. 表 3に従って、4×マスターミックスと反応ミックスを調製します。希釈した cDNA を混合物に加え、ピペットでそっとピペットを打って完全に混合します。
      注:すべてのクローンに対して、少なくとも重複して反応を設定します。ネガティブコントロール(未処理のK562細胞由来のcDNA)とNTCを含めます。
    2. 9 μLの反応ミックスをPCRプレートの各ウェルにロードします。 表4に示すサイクル条件を使用してPCRシステムをセットアップします。
    3. 検出するFAM色素チャネルを選択し、実行を開始します。
    4. 完了したら、サンプルを取得し、データを分析します。
      注:デジタルPCRは、反応のμLあたりのコピーとして結果を報告します。
    5. 報告値(コピー/μL)に反応量(10 μL)を掛けて、反応あたりの総コピー数を求めます。この値を反応中のcDNAの量で割って、ng cDNAあたりのコピー数(ng RNA入力に相当)を取得します。
      注:正確なプロトコルに従えば、各サンプルは20 μLのRT反応(55 ng / μL)で1,100 ngのRNAから開始されます。1:1希釈後の作業濃度は27.5 ng/μLで、各PCR反応に1 μLを添加するため、1回の反応あたり27.5 ngのcDNA(RNA相当)に相当します。
マスターミックス (4×)
試薬最終濃度/量
25× SYBRグリーン染料2×
5× デジタルPCRミックス4×
水、ヌクレアーゼフリー100 μLまで
反応ミックス
試薬最終濃度/量
4× マスターミックス1×
フォワードプライマー1 μΜ
リバースプライマー1 μΜ
cDNA(希釈)1 μL
水、ヌクレアーゼフリー10 μLまで

表3:4×dCas発現のデジタルPCR分析用のマスターミックスと反応ミックス。

歩温度、°C時間サイクル数
初期変性9610分1
変性965秒40
アニーリング/エクステンション6015秒

表4:デジタルPCRのサイクル条件。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ターゲットエピジェネティック編集ツールが ZBTB7A CpGアイランド326で部位特異的なDNAメチル化変化を誘導できるかどうかを調査するために、まず、DNMT3A(CD)またはHDAC1のいずれかに融合したdCas9をコードするエピソームベクターと、CpGアイランド326内のターゲット部位で設計されたさまざまなsgRNAを生成しました。最初にK562細胞をこれらのプラスミドの組み合わせで同時トランスフェクトし、sgRNAとエフェクターモジュールの同時送達が再現性のあるエピジェネティック修飾につながるかどうかを評価しました。

初期エピソーム共トランスフェクション戦略と限界
まず、4つのエピソームプラスミドを同時に共トランスフェクションすることを試みました。dCas9融合エピジェネティックエフェクター(pEPI-1-dCas9-DNMT3AおよびpEPI-1-dCas9-HDAC1)を発現するΤwoベクターと、CpGアイランド326を標的とするsgRNA発現...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの最も重要なステップの1つは、高度に特異的なsgRNAの設計です。オフターゲット効果は、CRISPRベースのエピジェネティック編集システムの既知の制限であり、多くの場合、dCas9結合の不忠実さ、およびエフェクタードメインの非特異的活性から生じる可能性があります。これを最小限に抑えるために、sgRNAは、高いオンターゲット活性と最小限のオフターゲット結合に最適化されたバイオインフォマティクスツールを使用して設計する必要があります30。デザインツールを採用し、予測されたオフターゲット部位を検証することが推奨されますが、異なるsgRNAを保有するクローンを比較することで、真のオンターゲット効果を識別するのに役立ちます。別の重要なステップは、完全長酵素31の保持機能による内因性相互作用を防ぐために、使用されるエピジェネティック修飾因子の触媒ドメインのみを使用することです。dCas融合システムの有効性は、クロマチン状態、核内の3D構造コンテキスト内の標的領域を取り巻く遺...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する金銭的または非金銭的利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アイリーン・デレキとヴァシリキ・チョンドロウは、ギリシャ公開大学の研究資金特別会計(ELKE)からの3年間のフェローシップ(助成金番号80706)によって支援されています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Absolute Q DNA デジタルPCRマスターミックス(5回)応用バイオシステムA52490
年齢-HF NEBR3552
ASCINEBR0558
AseINEBR0526
バンヒ-HFNEBR3136
BD FACS メロディセルソーターBD
ブグルNEBR0144
BSPEEINEBR0540
デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液ミックス(10 mM)NEBN0447
DMEM高グルコース(安定グルタミン、ピルビン酸ナトリウム配合)を含んでいましたバイオウエストL0103
DNAポリメラーゼI、大型(クレノウ)断片NEBM0210
DNMT3A(CD)、HDAC1配列IDT
DreamTaq DNAポリメラーゼ サーモ・サイエンティフィックEP0712
エピテクトキアゲン59104ビスアルファイト変換キット 
エピテクトビアルファイトキットキアゲン59104
ESP3INEBR0734
胎児用牛血清ギブコA5256701
ジェネティシン選択抗生物質(G418硫酸塩)ギブコ11811031
リポフェクタミン3000型トランスフェクションキットインビトロジェンL3000015
NEB® 5-α 有能 大腸菌 (高効率)NEBC2987I
NEB® 5-α F'Iq 大腸菌、(高効率)NEBC2992H
ヌクレオスピン組織およびnbsp;マッシェレイ・ナーゲル740952.50
PBS、10倍溶液pH 7.4ロンザBE17-517Q
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液100倍バイオウエストL0022
pGuideベクトルオリジーン・テクノロジーズGE100042
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール 25:24:1 10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTAシグマ・オルドリッチP2069
プライマー、sgRNAsおよびnbsp;ユーロフィン
パイロマークアッセイデザイン キアゲンバージョン2.0ビアナルファイトプライマー設計ツール 
パイロマークゴールドQ24試薬キアゲン970802
PyroMark PCRキット キアゲン978703
パイロマーク Q24 MDxキアゲンパイロシーケンシングワークステーション 
PyroMark Q24 ソフトウェア キアゲンv2.0.8パイロシーケンシングソフトウェア 
Q5®高精度DNAポリメラーゼNEBM0491
QuantiTect逆転写キットキアゲン205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 プレートキット応用バイオシステムA52865デジタルPCRシステムおよびnbsp;
SYBR Green I 核酸ゲル染色、DMSO濃度10,000倍インビトロジェンS7563
T4 DNAリガーゼNEBM0202
T4ポリヌクレオチドキナーゼNEBM0201
トリゾル試薬インビトロジェン15596026

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).
  3. Wang, S. E., Jiang, Y. -H. Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders. Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).
  4. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  5. Ptak, C., Petronis, A. Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).
  6. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  7. Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9. Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).
  8. Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).
  9. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  10. Giehrl-Schwab, J., et al. Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons. EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).
  11. Moreno, A. M., et al. In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation. Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).
  12. Sokka, J., et al. CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).
  13. Galonska, C., et al. Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).
  14. Lin, L., et al. Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases. GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).
  15. Kennedy, M. E., Cullen, R. B. Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).
  16. Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).
  17. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  18. Hanzawa, N., et al. Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).
  19. O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing. Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).
  20. Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors. J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).
  21. Lazaris, V. M., et al. Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells. Genes. 14 (9), 1774(2023).
  22. Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).
  23. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).
  24. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  25. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  26. Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).
  27. Holmes, D. S., Quigley, M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).
  28. Harwood, A. J. The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA. Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).
  29. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  30. Labuhn, M., et al. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).
  31. Hofacker, D., et al. Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects. Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).
  32. Yang, Q., et al. EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning. Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).
  33. Mu, W., et al. Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments. bioRxiv. , (2024).
  34. Batra, S. S., et al. Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing. bioRxiv. , (2025).
  35. Stavrou, E. F., et al. Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells. Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).
  36. Stavrou, E. F., et al. The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells. Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).
  37. Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).
  38. Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell Biol. 8, 33(2007).
  39. Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency. Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).
  40. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  41. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  42. Ewaisha, R., Anderson, K. S. Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).
  43. Raghavan, R., et al. Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy. Nat Commun. 16 (1), 105(2025).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

dCas9 HDAC1 CRISPR

関連記事