シロイナズナの単細胞解析のための組織特異的高品質プロトプラスト分離

サマリー

本研究は、 シロイナの根、葉、茎、花組織に対する強化された原形質分離プロトコルを提示します。この方法は、細胞損傷や残骸を最小限に抑えるために最適化された酵素の消化・精製ステップを用い、収率を高め、単一細胞RNAシーケンシングなどの単一細胞法で高品質なプロトプラストを得ることができます。

要約

単一細胞RNAシーケンシング(scRNAseq)は、細胞型特異的遺伝子発現、発生動態、組織特異的環境要因に対する応答に関する高解像度情報を得るために、植物生物学において不可欠なツールとなっています。scRNAseqを植物に応用する際の大きな技術的課題は、細胞壁を持たない生存可能な単一細胞を効率的かつ再現性的に分離することであり、これは植物組織の多様性を表しています。プロトップラスト分離は、細胞壁を酵素的に除去して単一の生きた植物細胞を生成する方法であり、この目的で広く用いられています。しかし、プロトトップストの成功した分離には、細胞の生存率を維持し、細胞型特異的なトランスクリプトームプロファイルを保存するために慎重な最適化が必要です。ここでは、地上(葉、茎、花)や根組織を含む複数の シロイナヌセプシス・タリアナ 組織から高品質なプロトプラストを分離するための、堅牢かつ再現性の高いプロトコルを提示します。このプロトコルは組織タイプの独自の生理的特性を考慮し、酵素による消化条件と精製工程を最適化し、多様な細胞タイプの高収量かつ広範な代表性を確保します。得られるプロトプラストは、scRNAseq、フローサイトメトリー(FACS)、一時的な遺伝子発現解析などの応用に適しています。複数の組織タイプから単細胞懸濁液を生成することが可能です。本手法は細胞の異質性の探求を支援し、植物研究における単一細胞アプローチの信頼性を高めます。

概要

単一細胞RNAシーケンシング(scRNAseq)は、遺伝子発現を前例のない解像度で解析できるようにすることで、植物生物学に革命をもたらしました。scRNAseqは細胞の異質性、発生軌跡、環境刺激に対する応答に関するトランスクリプトーム情報を提供し、細胞型特異的な解像度^1,2,3で提供します。

動物系とは異なり、植物の細胞壁は剛性があり、植物組織の構造的複雑さは、単一細胞を効率的に分離してトランスクリプトム解析を行う上で大きな障壁となっています。利用可能な方法の中で、細胞壁を酵素的に除去してプロトプラストを産生する方法が広く使われており、60年以上前に開発^{されました。}広く利用されているにもかかわらず、プロトプラスト分離は技術的に要求が高く、細胞収量、生存可能性、安定したトランスクリプトームのバランスを取るために組織特異的な最適化が必要です。単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)などの代替手法は、核⁷を単離することで細胞壁の消化を回避します。しかし、これは細胞質内に存在する成熟トランスクリプトに関する情報を失うことを伴います。機械的およびレーザー支援マイクロディサクションなどの他の物理的解離法は酵素細胞壁の消化を回避しますが、交差汚染を受けやすく、細胞の生存率が低下し、スループットが制限されることがあります^。

近年、特にシロイナズナの細胞アトラスが開発され、^{さまざまな組織の}トランスクリプトム的地形に関する重要な洞察を提供しています。.しかし、これらのアトラスは主に幼苗期や苗生期の植物を基にしており、主に根または葉の組織に焦点を当てています。これらの研究で用いられるプロトコルは、成熟した葉、花、茎などの古いシロイナズナ組織に対して最適化プロセスを必要とします。さらに、scRNAseqや蛍光活性化細胞選別(FACS)などの細胞型特異的シーケンシング研究とRNAシーケンシングを組み合わせて使用されるまでは、プロトプラスト分離によって引き起こされたトランスクリプトーム変化を完全には説明^{されていませんでした。}

ここで紹介された方法は、これまでの取り組みを基盤としつつ、いくつかの重要な改良を加えています。根と地上組織(葉、茎、花)のバッファー濃度を最適化することで、植物組織ごとの生理学的・解剖学的多様性を考慮し、細胞損傷を最小限に抑え原形体の純度を向上させるための穏やかな精製ステップを取り入れています。核ベースのアプローチと比較して、この方法は細胞全体トランスクリプトームを保持し、細胞質内に存在する成熟mRNA分子の高解像度情報を可能にします。重要なのは、この手法により、花では約9.8 ׳ cells/mgから葉では2.2 ×^{10 2} cells/mgまで、組織全体で高いプロトップ質の生存率、異質性、再現性が高まっていることです。

本手法の全体的な目標は、シ ロイナズナの複数組織に特化した堅牢かつ再現性の高い原生質単離プロトコルを提示し、植物単細胞研究において多様な細胞タイプをカバーする高品質な入力の重要性に応えることです。

プロトコル

本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. バッファーの準備

1. 表1に従い、それぞれのプロトプラスト分離バッファ^ー17,18を15 mL遠心分離管で準備します。根組織用の根原形質分離バッファー、または地上組織用の花・茎・葉の原生質分離バッファー。
   注:収穫された5株の シロイナドプシス・タリアナ 開花植物(閉花芽の段階11〜12)に必要な推定プロトプラスト分離バッファーの量:根(~ 375 mg):7 mL、葉(~930 mg):5 mL、茎(~215 mg):3 mL、花(~10 mg):2 mL。
2. 根/葉のプロトプラスト分離バッファーを使用する前に、セルラーゼRS2%とマセロザイムR10を1%(w/v)を加えます。プロトプラスト分離バッファーをローテーターに置き、粉末が完全に溶けるまで(25°Cで約10分間)よく混ぜます。気泡を避け、バッファー内に粉の塊が残っていないか確認してください。

2. 組織の消化

1. 使用前に、それぞれのプロトプラスト分離バッファを0.2μmフィルターでフィルタリングしてください。葉や根には標準サイズのペトリ皿(100 mm x 15 mm)を使い、花などの少量の組織には小型サイズのペトリ皿(30 mm x 15 mm)を使いましょう。組織を移す前に、ペトリ皿に数滴のプロトップスト分離バッファーを加えます。
2. それぞれの組織をペトリ皿に移し、カミソリの刃で垂直に細かく速く小さく刻みます(図1A)。
   注意:交差汚染を避けるため、サンプルごとに必ず異なる刃とピンセットを使用してください。カミソリの刃を扱う際は保護用の手袋を着用してください。
3. 残った原形質分離緩衝剤をそれぞれのペトリ皿に加え、刻んだ組織を浸して25°Cで1時間培養します。地上の組織はベンチ上に置いて(揺らさず)、根組織は軌道シェーカープラットフォーム(60回転/分)に移します。

3. ろ過

1. 培養後の根サンプル:
   1. パスツールピペットを使い、ペトリ皿から40μmのセルストレーナーに移し、予備冷却された開放50mL遠心分離機チューブの上に置きます。
   2. 残りの原形体を収穫するには、同じ量のW5溶液(2 mM MES pH 5.7、154 mM NaCl、125 mM CaCl₂、5 mM KCl)を同じペトリ皿に加え、ペトリ皿の底部に付着した原形体を回収します。W5溶液中に再懸濁したプロトプラストを、予冷の開放50 mL遠心分離機チューブの上に置かれた同じ40μmセルストレーナーに移します。
   3. 新しい40μmセルストレーナーにもう一度通し、新しい予冷の50mL遠心分離機チューブに通します。これからはサンプルを氷に保管し、プロトプラストの扱いはとても優しくしてください。
2. インキュベーション後の地上サンプル:
   1. パスツールピペットを使い、ペトリ皿から70μmのセルストレーナーに移し、予備冷却された開放50mL遠心分離機チューブの上に置きます。
   2. 残りの原形体を収穫するには、同じ量のW5溶液(2 mM MES pH 5.7、154 mM NaCl、125 mM CaCl₂、5 mM KCl)を同じペトリ皿に加え、ペトリ皿の底部に付着した原形体を回収します。W5溶液中に再懸濁したプロトプラストを、予冷された開口50mL遠心分離機の上に置かれた同じ70μmセルストレーナーに移します。これからはサンプルを氷に保管し、プロトプラストにはとても優しく扱ってください。

4. 洗浄とフィコル浄化

1. 遠心分離機を4°Cまで予冷し、遠心分離機のブレーキ設定をゼロにして500× g で5分間プロトプラストを採取(ペレット)します。
2. 遠心分離後の根サンプル:
   1. プロトプラストのペレットを乱さずに上清液を捨てます。
   2. プロトプラストを、パスツールピペットまたは切断先端付き1mLギルソンピペットを用いて、事前に冷却した600〜700μLの根再懸濁バッファー(酵素なしの根プロトプラスト分離バッファーとW5溶液を同量)で非常に優しく再懸濁させ、剪断を防ぎます。
   3. 懸濁液を1.5 mLの予冷(4°C)チューブに移します。
3. 遠心分離後の地上サンプル:
   1. ペレットを乱さずに上澄液を捨てます。
   2. ペレットを、パスツールピペットまたは切断先端付きの1mLギルソンピペットを使い、4°Cの600〜700μLの花・茎・葉の再懸濁バッファー(花・茎・葉のプロトプラスト分離バッファー(酵素なし)とW5溶液を同量)で非常に優しく再懸浮させて、せん断を防ぎます。
   3. 懸濁液を1.5 mLの予冷(4°C)チューブに移します。
   4. 1.5 mLのチューブ内に13.3%(w/v)のFicoll PM 400溶液300 μLを準備します。混ぜて冷やしておきます。
   5. 再懸濁したプロトプラストサンプル(600〜700 μL)を、フィコル層に触れたり混ぜたりせずに、準備済みのフィコル溶液の上にゆっくりと加えます。
   6. 遠心分離機は4°Cで5分間、700 ×g で、ブレイク設定はゼロにします。
   7. 中間層(界面)に存在する原形体と上部相(第一層)を収集します(図1B)。フィコルや分離された破片を含む下部の3層目を回収しないように注意してください。使用後は4°Cで保存してください。

5. カウントと品質チェック

1. ノイバウアー血液サイトメーターで分離された原生体細胞の数を数えるために、10μLの原形質溶液を使用します。
   オプション:原形体の生存可能性を評価するために1%(含量)エバンスブルー染料を追加できます(図1C)。
2. 各組織のプロトプラスト溶液を、予備冷却(4°C)の再懸濁バッファー(根部の場合はステップ4.2.2、地上組織についてはステップ4.3.2で説明)を用いて、必要なプロトプラスト濃度/mLに希釈します。
3. 予定された実験をできるだけ早く進めてください。例:単細胞RNAシーケンシングやFACS^15,19。

結果

地上および根部組織に対する実装されたプロトッププラスト分離プロトコルは、細胞壁の効率的な消化と、すべてのシロイナ・タリアナ組織から完全な単一細胞の放出を成功裏に可能にしています。花、茎、葉、根を含む試験組織タイプ全体で、酵素的消化過程により、未消化細胞群の数が最小限のよく分離された原形体が生成されました(図2A-D)。エバンスブルー染料アッセイにより、円形形態を持ち滑らかな円形膜境界を持つ原形体が生存可能な細胞であることが確認されました(図1C)。各組織タイプごとに球状の原形体が数えられました。花は平均97,875個±7,531個(9,788個/mg、n=3)、茎は119,025個±22,508個(550個/mg、n=4)、葉は210,483個±、15,572個(225個/mg、n=3)、根は225,363個±52,561個(599細胞/mg、n=4)でした。

プロトップスト懸濁液は細胞サイズの広範な分布と緑色または淡色の質体の存在を示し、各採取組織の細胞組成の不均一さを反映しています(図3A-D)。これを確認するために、トランスジェニックな伴随細胞特異的YFPレポーター系統を用いた原形質体単離が行われ、懸濁液にはYFPシグナルが伴随細胞を表す生存可能な小型原形質体が含まれていました(図3E)。これは、使用されているプロトプラスト分離プロトコルが、硬質細胞壁を持つ分離が困難な血管細胞に適したことを示しています。

提示された最適化された方法により、成植物のさまざまな組織から最小限の残骸で多数の生存可能なプロトプラストを分離できます。地上サンプルの精製を改善するため、消化サンプルから放出された細胞小器官やその他の細胞残骸を除去しつつ、トランスクリプトームの品質を保つためにFicollクッションクリーニング工程を導入しました(図4)。

原生体から生成されたscRNAseq cDNAライブラリーでは、ACTIN2のような高発現のハウスキーピング転写産物や、抗菌細胞および分子組織細胞に特異的な標識であるホメオドメイン転写因子 KNAT1のような希少・低発現転写産物、さらに伴随細胞 マーカーSUC2 および PARCL1 が、特異的なcDNA PCR^アッセ イ15によって検出されました(図5).これは得られた原生体集団の広範な細胞型表現と異質性を示しており、この手法で得られたscRNAseqデータの解析でもさらに確認されました¹⁵。

図1:原形質体分離ステップのワークフロー。 主な6つのステップが示されています:(1)バッファーの準備、(2)組織消化、(3)ろ過、(4)洗浄およびフィコル精製、(5)計数と品質管理、(6)下流実験の継続。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:原形質体調製の画像。 (A) 葉サンプルの切断段階の代表的な画像(ステップ2.1)。上の画像は、採取した組織と数滴のバッファーを標準サイズのペトリ皿に置き、カミソリの刃で刻むための様子を示しています。下の左の画像は、カミソリの刃で数回縦にストロークした後の組織を表しています(矢印参照)。右の画像は、次のステップに進む準備ができた刻みサンプルを表しています。(B) 遠心分離後のフィコルクッションの画像(ステップ4.3.7)。白い矢印は中間層を示しており、そこには原生体が含まれています。(C) エバンスブルー染料で培養された葉のプロトプラストの代表的な顕微鏡画像。スケールバー:250μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3:生成された原生体の顕微鏡画像。 各組織タイプの原形体画像が表示されます。(a)花、(b)茎、(c)葉、(d)根。スケールバー:250μm。(E) 伴随細胞特異的YFPレポーターラインの共焦点顕微鏡画像。 最初の画像(左)は葉の血管におけるYFP伴随細胞報告者の発現を示しています(緑色)。2枚目の画像(右)はYFPレポーター(緑色のシグナル)を発現する細胞からの原形体を表しています。紫/青色は葉緑体自己蛍光を表します。スケールバー10μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図4:(A)および(B)フィコルクッションクリーニング前後の葉のプロトプラストの顕微鏡画像。 スケールバー:250μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図5:scRNAseqライブラリの品質管理PCR。 根および地上組織の単一細胞RNAseqライブラリの品質管理PCRの代表的なゲル画像。検査された遺伝子はSUC2、 PARCL、 KNAT1、 ACT2 (それぞれAからDまで)、および各組織(花、茎、葉、根)を左から右へそれぞれ行いました。cDNA(+)は陽性対照として、水は陰性対照として使用されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

根原形質保存バッファー	花・茎・葉のプロトプラスティングバッファー
600 mM マンニトール	400 mM マンニトール
2 mM MgCl2	-
0.1% BSA	0.1% BSA
2 mM CaCl2	10 mM CaCl2
2 mM MES pH 5.7	20 mM MES pH 5.7
10 mM KCl	20 mM KCl
必要に応じて1MのTris Baseを使ってpHを5.5に調整してください	必要に応じて1MのTris Baseを使ってpHを5.5に調整してください

表1:原生質体分離バッファー組成。 根組織および地上組織(花、茎、葉)のプロトップラスト分離バッファーレシピも提供されています。

ディスカッション

この最適化されたプロトコルは、シ ロイヌズナ のさまざまな組織からプロトプラストを単離するために、scRNAseqアプリケーション向けに最適化され、細胞質および核に存在する全トランスクリプトームを解析しました。バッファーの組織特異的最適化と消化・精製の追加工程により、異なる組織間で堅牢かつ再現性の高い収量が得られました。具体的には、花原形体はサンプルあたり平均約98,000細胞(約9,788細胞/mg組織)、幹原形質体は119,000細胞(~550細胞/mg)、葉原形質体は約210,500細胞(~225細胞/mg)、根原形質体は約225,000細胞(~599細胞/mg)であり、これらの組織の構造的および生理学的多様性を反映しています。

このプロトコルの重要な改良点は、より一般的に使われているショ糖ベースのグラデーションやクッションの代わりに、フィコルベースのクッションを使用したことです。ショ糖は細胞に取り込まれ、転写源13,20,21に大きな影響を与えるが、フィコルは浸透圧的に不活性かつ膜を通過しないため、分離²²の際にRNAの完全性を保つ。この工程により、懸濁液中の破損した細胞や細胞残骸から葉緑体などの遊離小器官の数も減少しました。このような破片の存在は、マイクロ流体装置のチャネルを詰まらせたり、形成された液滴中に複数の細胞が存在したりして、周囲のRNA汚染に寄与するなど、液滴形成を妨げることがあります。これらすべての要因が、scRNA-seqデータの解析において誤った結論やバイアスにつながる可能性があります。

プロトプラストの単離が^{植物細胞の}転写組を変化させることが示^{されました。}このプロトコルにおける重要な戦略として、酵素消化後にプロトプラストを氷上で4°Cに保つことが挙げられます。これにより代謝および転写活動が遅くなり、プロトプラスト分離に関連する転写変化が軽減されます。さらに、組織採取時間を複製間で一貫させ、研究目的に整合させることが重要であり、タイミングの変動はscRNA-seqデータセットで検出されるプロトプラスト誘導遺伝子および概日リズム調節転写本の両方に影響を与えることが示されています¹⁵。

この方法では、最小限の破片で単一細胞を生成することに加え、組織の異質性を保ち、すべての細胞タイプを代表する可能性を保つことも非常に重要でした。プロトプラスト懸濁液の多様性は、異なるサイズや得られた集団内で細胞型特異的なレポーターラインからのシグナルの存在など、異なる形態の検出によって確認されました(図2)。さらに、プロトプラスト集団はPCRを用いてscRNA-seqのcDNAライブラリー内の希少かつ細胞型特異的かつハウスキーピング転写を検出することで評価されました(図4)。これには、梢分生組織の希少なマーカー遺伝子や、伴侶細胞^のマーカーが含まれていました。これらの転写本の成功した捕捉は、提示された方法が多様な細胞タイプの高整合性を保有して分離可能であることを裏付けており、植物における単一細胞研究の進展に貴重なツールとなっています。scRNAseqに加えて、この方法はフローサイトメトリー、一時的な遺伝子発現解析、植物再生アッセイにも使用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セルラーゼRS	デュシェファ生化学	C8003
遠心分離機5810Rモデル	エッペンドルフ	5810000010
フィコル PM 400	シグマ・オルドリッチ	26873-85-8
マセロザイムR10	デュシェファ生化学	M8002
マイクロ遠心分離機5417Rモデル	エッペンドルフ	廃止
Puradisc 30 滅菌シリンジフィルター、0.2 & micro;m	シチバ	10462200	0.2 & microと呼ばれ、プロトコル内のmフィルター
滅菌セルストレーナー40 &マイクロ;m ナイロンメッシュ	フィッシャーブランド	22363547
滅菌セルストレーナー70 &マイクロ;m ナイロンメッシュ	フィッシャーブランド	22363548