固体表面蛍光によるミツバチ製品中の2,4-ジクロロフェノキシ酢酸のモニタリング

Summary

本研究は、アルゼンチン中部および北部のミツバチ製品サンプルにおける2,4-ジクロロフェノキシカルボン酸の制御およびモニタリングにおいて、従来の手法に代わる新たな方法論の開発を提案します。

Abstract

ミツバチの健康は蜂蜜の生産と作物の受粉に不可欠です。除草剤の使用は蜂蜜生産に悪影響を及ぼす可能性があり、ミツバチが処理された植物から蜜や花粉を集める際にこれらの化学物質に触れ、有害な残留物による蜂蜜汚染を引き起こす可能性があります。2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)は広葉雑草の制御を目的としていますが、花に届き、ミツバチの生産を汚染し、ミツバチの健康や生活の質に影響を与える可能性があります。これらの理由から、除草剤残留物の存在を検出し、必要に応じて是正措置を講じるために、定期的に蜂蜜を分析することが重要です。本研究は、アルゼンチン中部および北部の蜂製品サンプルにおける2,4-Dの制御とモニタリングにおいて、従来の技術に代わる新たな方法論の開発を提案しています。試料はpH=7.0で陰イオン界面活性剤ドーデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在下で調整され、固体支持として青帯フィルターペーパーで系をろ過した後、固体相蛍光による決定を行いました。最適な作業条件下では、検出および定量限界はそれぞれ0.33 ng/Lと0.90 ng/L、線形範囲は0.90 x 10³ ng/Lから1.13 x 10^{3 ng/} Lに達しました。この新しい方法の利点の一つは、安価な機器と環境に優しい溶剤の使用、低廃棄物発生、そして結果としてグリーンケミストリーのいくつかの原則を守ることです。

Introduction

ミツバチの健康は蜂蜜の生産と作物の受粉に不可欠です。健康なコロニーは、適切な栄養、衛生管理、病気の予防と治療を含む包括的な健康管理に依存しています。責任を持って行う蜂蜜生産はミツバチに害を及ぼさず、養蜂家は全体の蜂蜜のごく一部しか採取せず、コロニー用の備蓄を残します^1,2。

除草剤の使用は蜂蜜生産に悪影響を及ぼす可能性があり、ミツバチが処理された植物から蜜や花粉を集める際にこれらの化学物質に触れ、農薬残留物による蜂蜜汚染を引き起こす可能性があります。さらに、グリホサートのような一部の除草剤は、ミツバチの発達や行動に直接影響を与え、採餌能力や生理的発達を低下させることがあります(3,4,5,6)。2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)除草剤は広葉雑草の制御を目的と設計されていますが、花に届き蜂蜜を汚染し、ミツバチの健康や蜂蜜の品質に影響を与える可能性があります。^7,8,9。

近年、蜂蜜やその他の養蜂製品の国内外取引は著しく持続的な成長を示しており^、生産量の増加に反映^{されています。}国連食糧農業機関(FAO)のデータによると、世界には中国、アルゼンチン、トルコ、アメリカ合衆国、ウクライナの5つの主要な蜂蜜生産国があります。¹³か国です。養蜂生産はアルゼンチンで非常に重要であり、近年の輸出市場の機会が増えたことで絶えず成長しています。アルゼンチンの環境条件(気候、植物相など)と生産に投資された技術は、同国を世界的に重要な地位に位置づけることを可能にしました。一方で、異種生物質の存在は他国と同様に懸念される問題であり、その^{毒性の影響により}蜂蜜の販売や消費者の健康に影響を与えるため、監視^{が必要です。}

2,4-Dは広く使われている選択的系統性除草剤で、合成オーキシンとして作用することで広葉雑草の制御不能な成長と死を効果的に防除します。農業、園芸、林業で使用され、特に小麦、トウモロコシ、米などの作物の雑草管理に有用で、草や穀物に害を及ぼさないため¹⁶。2,4-Dは植物成長調節剤としても使用可能で、アミン塩やエステル塩など様々な製剤で様々な用途に対応しています。2,4-Dの機能は投与される用量および特定の種や組織タイプの感受性によって影響を受けます(^17,18)。例えば、2,4-D接触はマウスにおける生殖不良や有意な遺伝的変異に関与しており、顕著な遺伝子毒性の影響を示しています¹⁹。

ミツバチは、真社会性、学習、記憶の研究における主要な受粉者およびモデル生物として^{、畑で使用される}農薬による直接的な中毒に非常に脆弱です。開花期に除草剤や殺虫剤を空中散布すると、ミツバチの死亡率が大きく、蜂蜜生産量が大幅に減少することがあります。致死量未満でも農薬混合物は、採餌中のミツバチを混乱させ、記憶を損ない、採餌効率を低下させることがあります。その結果、花粉や蜜の収集が減少し、コロニーが弱まり、栄養不足が生じます。さらに、2,4-Dは蜂蜜サンプルから検出されており、汚染された花粉や蜜が巣の配偶者間に広が^{る可能性があります。}

定期的に蜂蜜の除草剤残留物の有無を分析し、必要に応じて是正措置を講じることが重要です。除草剤などの食品汚染物質の検出および定量において、特に2,4-Dでは、最も一般的に用いられる計測手法はクロマトグラフィー、すなわち高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法(LC-MS/MS)、およびガスクロマトグラフィー・タンデム質量分析法(GC-MS/MS)^{22,23,24,25,26}です.しかし、研究者たちは定期的に、従来の定量法^27、28、29に比べて利点を持つ新しいモニタリング手法を提示しています。例えば、より安価な機器の使用、操作の簡便さ、溶媒の削減、より複雑な試料への適用などです。

固体相蛍光は、分子蛍光と固体相抽出法を組み合わせることで、すでに高い蛍光装置に固有の感度を高める多用途な技術です。また、マトリックス効果を減らしたり排除したりすることで、線形範囲と選択性を向上させます^30,31。

本研究では、2,4-Dを監視・定量化するための新しい分析手法を提案し、アルゼンチン中部および北部の蜂蜜やその他のミツバチサンプルに適用します。サンプルには不明な量の2,4-Dが含まれています。分かっているのは、サンプルから得られる濃度と追加した2,4-D濃度のスーパー添加濃度です。この後者の値は既知であり、回収率を計算する手助けとなります。新しい手法は、固体相蛍光を用いた分析対象物の直接決定に基づいており、計測機器の削減、運用コストの削減、環境保護の向上という複数の利点を示しています。

Protocol

この原稿には、著者のいずれかが行ったヒト参加者や動物を用いた研究は含まれていません。

使用装置
分光フルオリメット測定は、150Wキセノンランプを搭載したPCベースの分光フルオロメーターを用いて行われました。固体表面蛍光(SSF)測定にはサンプルホルダーが使用されました。2,4次元定量化に用いられたパラメータは以下の通りです:λ_em=580 nm、λ_ext=555 nm(スリット3-3)、固体サンプルホルダー使用。

サンプリングとサンプル処理
この研究は、2025年に生産された蜂蜜サンプルの生産量をアルゼンチン北中部のサンルイス、サンフアン、フフイ、サルタ各州で実施しました。分析されたサンプルは、4種類の多花蜂蜜、2種類のプロポリス蜂蜜、純粋な蜂蜜キャンディ、そして地域の養蜂家から購入した蜂蜜、コカ、プロポリスの混合物から作られたキャンディでした。調査対象の蜂蜜は新鮮で、生産から1週間以内に巣箱から抽出され、異なるメカニズムによる2,4-Dの劣化を防ぐためでした。すべてのサンプルは新しく無菌容器で採取され、直ちに研究所へ運ばれました。分析まで暗い場所で4〜8°Cの環境で保存されました。固形キャラメルは乳鉢と乳棒で均質化され、その内容物は超純水5mLに希釈され、その溶液から0.5μLが抽出されました。

方法論
0.5 μLまたは1 μLの2,4-D(1.23 ng/L および 3.49 ng/L)、100 μLのサンプル、250 μLのSDS(1 x ^10-4 mol/L)、100 μLのリン酸塩緩衝液(1 x ^10-4 mol/L、pH=7)を加え、混合液の容積は二重蒸留水を加えて3 mLにしました。混合物は固体支持体(紙フィルター;詳細は 材料表 を参照)を通してろ過されました。固体支持体は室温で乾燥させ、その後λ_em=580 nmで固体表面蛍光(SSF)を測定しました。これはλ_ext=555 nm(スリット3-3)で固体サンプルホルダーを用いて行われました。

上記は、各パラメータを研究・最適化した方法論の一般的な手順を説明しており、結果セクションに示されています。

pHとバッファーの影響
pH最適化は、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて研究対象のpHに合わせてシステムを調整し、必要な値(測定範囲pH 5〜7)に調整することで行われました。その後、適切な解析信号を得るための最適なpH範囲が得られた後、使用するバッファーが選ばれました。

試験されたバッファーはリン酸塩、トリス、ホウ砂で、それぞれ1 x ^10-4 mol/Lの濃度で調製されました。最良の蛍光強度信号を得るために、その体積を調整しました。蛍光強度を向上させた唯一の緩衝リン酸塩の結果と、それぞれの最適濃度を示しています。ここで選ばれたバッファーはリン酸塩で、pH=7でした。

界面活性剤濃度
分子蛍光における異なる界面活性剤の使用は、研究対象の分析物の決定を向上させる利点を提供します。ミセラー媒体は、分析物と試料マトリックスの成分間の分子間相互作用を最小限に抑えるために用いられます。さらに、蛍光溶質の光物理的性質はミセラー培地で修飾できるため、蛍光感度が向上します。固体表面蛍光(SSF)を用いた2,4-Dの定量に対する異なる界面活性剤(SDSおよびHTAB)の影響が研究されました。陰イオン界面活性剤SDSは、8.3 x 10^⁻6 mol/Lの濃度で、研究対象の除草剤の蛍光強度を増加させることが判明しました。

しっかりとしたサポート
励起蛍光状態で平面配置がエネルギー的に好まれることから、除草剤を固体支持体に保持する方法が検討されました。システムはナイロン、セルロースアセテート、混合エステル、ブルーリボンフィルターペーパーなど様々な膜でろ過されました。ろ過された溶液は別々の清潔な容器に集められ、膜は室温で乾燥させられました。その後、膜を固体サンプルホルダーに入れ、固体相蛍光(SSF)を記録しました。フィルターペーパーには適量かつ選択的な保持が認められたため、この支持が固体相蛍光決定に選ばれました。ろ過された溶液は分子蛍光法でも分析されました。2,4-D複合体の不在が明らかで、除草剤がフィルターペーパーに残っていることが示されました。

回復研究
2,4-Dは各サンプルの適切な体積に加えられ(蜂蜜サンプルは0.5 μL、他のサンプルは1 μL)、濃度は徐々に1.23 ng/Lおよび3.49 ng/Lに増加しました。分析物濃度はこの方法論を用いて、6回の複製の平均(n = 6)として算出されました。

精密研究
方法の再現性と日中の精度は、2,4-Dの1.23 ng/Lおよび3.49 ng/Lを含むサンプル(n=6)を繰り返しテストし、分析成分を測定することで研究されました。さらに、同じシステムに対して7日間の重複性も評価されました。

干渉研究
3.49 ng/Lの2,4-Dを含む様々な量の一般的なイオンが試験溶液に加えられ、この方法論が適用されました。以下の潜在的な干渉物がテストされました。

干渉物濃度/2,4-Dモル比=1000:1:00:Na⁺、K⁺、Cl^-、Fe³⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Sb³⁺、Mn²⁺、As³⁺、CO₃^-、SO^{4 2-}、Ca²⁺、Mg²⁺、NO^3-、Ni²⁺、フルクトース、グルコース、ショ糖、マルトス、2,4,5-T、スルフォメツロンメチル、グリホサート、アトラジン。

Zn²⁺、Co²⁺、^Al3+、クロルスルフロン、ベンスルフロン-メチル、トリアスルフロンの干渉物/2,4-Dモル比 = 500:1:00。

分析品質パラメータの計算
解析品質パラメータは検出限界(LOD)と定量限界(LOQ)です。これらは以下の手順を適用して計算されました。背景雑音は、分析対象を含まない15個のブランクサンプルの応答を測定して背景雑音のデータセットを得て測定しました。ノイズの標準偏差が計算されました。これはLOD値として受け入れられています。検出限界はブランクの標準偏差の3.3倍(N=15)に基づいています。量化限界はブランクの標準偏差の10倍(N=15)に基づいています。

Results

以下に示す結果は、一般的な手続きに影響を与える各変数、最適化、そして到達した最適な作業条件の研究が段階的にどのように進められたかを示しています。

2,4次元スペクトルの特徴付け
2,4次元特性評価はUV-Vis分光法と分子蛍光法によって行われ、λ_em=580 nmで蛍光強度の最大値を観測し、λ_ext=55 nm(スリット3-3; 図1)。蛍光信号の濃度を上げることで、直接的な定量化が可能になることで、蛍光信号の高揚効果が示されました(図2)。直接分析物定量は、分析物が他の蛍光物質の蛍光信号をどのように変化するかを評価する間接方法と比較して、運用的および計算的な簡易性、解析信頼性、堅牢性という複数の利点を持つことを踏まえることが重要です。この場合、蛍光信号は2,4-Dの濃度に直接関連しており、運用計算を容易にし、運用...

Discussion

アルゼンチンおよび世界の他の地域では、増加する人口の食料需要を満たす必要性から除草剤の使用が飛躍的に増加しています。これらの製品の使用が適切かつ合理的かつ定期的に監視されれば、期待される利益を損なうことなく、環境全体に悪影響を及ぼすこともありません。2,4-Dは世界中で広く使用されており、多くの研究でこの除草剤が標的生物に変化を引き起こすことが示されています。したがって、除草剤がミツバチなどの異なる生態系や生物に及ぼすリスクを継続的に評価することは極め^{て重要である。}

1964年にAlmer-Jonesが行った研究では、

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	49083
酢酸/酢酸塩	マリンクロート化学工場
ブルーリボンフィルターペーパー	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	WHA1001929	2-5 & mu;孔径m、直径12.5cm、nbsp;
セルロース酢酸膜	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国		0.45 & mu;mの孔径と47mm
六サデチルトリメチルアンモニウム臭化物(HTAB)	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	H5882
塩酸	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	1.09063
イモビロン(+)膜	ブラジル、サンパウロ州ミリポール	HATF04700	0.45 & mu;mの孔径と47mm
混合エステル膜	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国		0.45 & mu;mの孔径と47mm
ナイロン膜とnbsp;	ブラジル、サンパウロ州ミリポール	Z290793	0.45 & mu;mの孔径と直径47mmです
pHメーター(オリオン膨張イオン分析器)およびnbsp;	オリオンリサーチ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、アメリカ合衆国	モデルEA 94。
二水素リン酸カリウム	Biopack、ブエノスアイレス、アルゼンチンなど;	2000168900
フタル酸カリウム	マーク&カンパニー株式会社
ドデシル硫酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	11667289001
水酸化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	S2770
テトラボウ酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	221732
分光フルオリメトリメトリー	島津	RF-5301	150Wキセノンランプと1.00cmの水晶セルを装備しています
トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン	シグマ・オルドリッチ、セントルイス、アメリカ合衆国	77-86-1