2光子 in vivo 画像を用いた電気鍼治療中の体感覚皮質ニューロンの時空間動態の可視化

Summary

このプロトコルは、Thy1-GCaMP6f遺伝子移行マウスの頭蓋窓、標準化された電気鍼治療、2光子イメージングを統合し、刺激中のミリ秒スケールの皮質アンサンブル動態を可視化し、層特異的可塑性を明らかにします。

Abstract

このプロトコルは、EA(電気鍼)刺激時の皮質回路動態を調査するための包括的な実験的枠組みを確立します。この手法は、Thy1-GCaMP6fトランスジェニックマウスにおける慢性頭蓋窓移植、ST36経位での標準化されたEA刺激(2/100 Hzの二相パルスによる照射)、および高解像度の2光子カルシウムイメージングの3つの主要要素を統合しています。この統合的アプローチにより、一次体性感覚(S1)皮質における神経アンサンブル活動をリアルタイムで時間的に可視化し、これまでアクセスできなかった神経調節に対するネットワークレベルの応答の詳細を捉えることができます。この技術は、異なる層特異的な活性化パターンや縦方向の可塑性変化を明らかにし、EAの影響の背後にある皮質メカニズムについて重要な洞察を提供します。従来のfMRIや電気生理学的手法に内在する基本的な時空間的制約を克服することで、この高解像度プラットフォームは動的神経回路のマッピングにおいて前例のない解析能力を提供します。このプロトコルの堅牢な設計と再現性のある結果は、標的的神経調節療法の最適化や末梢刺激に対する回路レベルの可塑性の理解を深める上で特に価値があります。

Introduction

電気鍼治療は、特定の経位に針を通した制御された電流を注入する伝統的な鍼治療の現代的な応用であり、痛みの処理、運動制御、自律神経機能に関わる神経回路の調節で知られています。その効果は、末梢感覚神経(主にAδ線維およびC線維)の活性化によって引き起こされる複雑なシグナル伝達カスケードを伴い、神経伝達物質(例:オピオイド、セロトニン、GABA)の放出と、脊髄、脳幹、皮質レベルでの調節を引き起こすと考えられています。^1,2。関与する主要な構造には体性感覚皮質が含まれます。触覚および侵害受容情報を処理するS1皮質内では、EAは局所的な抑制・興奮バランスおよび長距離結合の両方に影響を与えると考えられています^3,4。しかし、異なる神経集団(例:錐体ニューロン、介在ニューロン)およびEA刺激中および直後のS1層における活性化/阻害の正確な時間的順序は^、前述の方法論的制約によりほとんど未解明のまま^です。これらのリアルタイムの動態を理解することは、EAパラメータの最適化と治療効果の予測に不可欠です。

行動研究や死後分析など、EA(電気鍼治療)が皮質回路に与える神経調節効果を調査する従来の方法は貴重な洞察を提供しますが、高時^{空間分解能}でリアルタイムの神経活動を捉える^{ことはできません。}これらの制約を克服するために、in vivo 2光子カルシウムイメージングが強力な代替手段として登場し、刺激中の神経アンサンブル動態を直接可視化すること^{を可能にします。}この技術は慢性的な縦断研究において比類なき利点を提供し、研究者が細胞分解能で覚醒中の行動動物の皮質層をまたぐ迅速かつ分散した活動を観察できるようにします。急性電気生理学は時間的解像度は高いものの空間的カバレッジは限られているのに対し、二光子イメージングは定義^{された視野内で}数百から数千のニューロンを同時に大規模にモニタリングすること^{を可能にします。}さらに、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)は全脳のカバーに優れているものの、時間的スケールが遅く細胞特異性に欠けますが、二光子カルシウムイメージングは、シナプスおよび回路レベルのプロセスに関連する時間スケールで特定の神経集団からの活動を細かく検出します^11,12.したがって、二光子イメージングは、末梢のEA刺激が特に一次体性感覚皮質(S1)のような領域において、時空的に正確な皮質活性化パターンに翻訳されるという理解における重要なギャップを埋める上で独自の位置にあります。体性感覚処理(経位からの信号を含む)の主要なハブとして、EAがその活動を強固に調節するため、S1は電気鍼治療によって誘導される皮質回路動態を研究する戦略的なゲートウェイです。

二光子レーザー走査顕微鏡(2PLSM)と、GCaMP6のような遺伝子コードカルシウム指標(GECI)の組み合わせは、神経科学における革命的なツールを示しています。細胞および細胞内特異性を特徴と、生体内での神経活動の慢性的かつ高解像度の画像化を可能にします¹³。GECIは細胞内のカルシウム過渡期に比例して蛍光し、神経細胞の発火の信頼できる代理指標となります¹⁴。特に、2PLSMは近赤外励起光の使用により、従来の顕微鏡よりも数百ミクロンもの深い深度貫通力を提供し、表層からさらに深い皮質層(例:L2/3、L4、L5)での活動を可視化できます。その光学的断面により、ピントの合わない蛍光や光損傷を最小限に抑え、^15、16、¹⁷の週または数か月にわたる縦断研究に最適です。この技術はEA研究における革命的な進歩を示しており、刺激時に定義された皮質体積内で同時に数百から数千の個々のニューロンのミリ秒スケールの動態を追跡する可能性を秘めています。

Protocol

すべての実験は8〜12週齢のトランスジェニックThy1-GCaMP6fマウス¹⁸を用いて行われました。すべての実験手順および動物ケアプロトコルは、国立衛生研究所(NIH)の実験動物ケア・利用ガイドラインに従って実施され、華中科技大学動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました。プロトコル承認番号:3603)。動物の数やその苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。実験装置の回路図は 図1に示されています。

1. 慢性頭蓋窓移植

1. 麻酔誘導と立体安定性
   1. 麻酔を開始するには、生後8〜12週齢のThy1-GCaMP6fマウスを、100%医療用酸素に4〜5%イソフルラン(vol/vol)を100%医療用酸素で1L/minの流量で供給する誘導チャンバーに入れます。
   2. 復元反射が失われたら(通常2〜3分以内に)、動物をデジタル立体型フレームに統合されたサーモスタティック加熱パッド(37°Cで維持)に移します。
   3. 手術的メンテナンスのために、鼻のコーンで1.5〜2.0%のイソフルランを投与してマウスを固定します。角膜乾燥を防ぐために両目に眼用軟膏(例:Puralube Vet Ointment)を塗布してください。
   4. 外傷のない耳棒を外耳道に慎重に挿入し、組織損傷や鼓膜破裂の原因となる過度な圧力を避けて対称的な位置を確保し^{てください。}
   5. 鼻クランプで上顎口蓋を固定し、気道の閉塞を防ぎます。
   6. 足の引き込み反射がなく、しっかりとした足の指をつまむことや、安定的でゆっくりとした呼吸数(80-120回/分)を維持することで、深麻酔の確認をしてください。直腸プローブで体温を継続的に測定し、温熱パッドを調整してください。
   7. 皮下(s.c)予防的鎮痛(例:カルプロフェン、5 mg/kg)および輸液サポート(無菌生理食塩水、0.5-1 mL s.c.)を投与します。セットアップ中は生理的パラメータ(SpO₂>95%、呼吸が規則的)を安定させてください。
2. 頭蓋骨の外科的露出
   1. 電動クリッパーで背側の頭皮を丁寧に剃り、その後化学除毛クリームを塗布して完全な脱毛を行います。滅菌生理食塩水でしっかりすすいでください。
   2. 逐次除菌を行う:露出した皮膚を3回こすり、ポビドンヨウ素(10%)と70%イソプロピルアルコールの綿棒を交互に使い、最後にクロルヘキシジングルコン酸塩(2%)溶液で仕上げます。
   3. 無菌の微細解離ハサミと細かい鉗子(Dumont #5)を用いて、皮膚とその下の結合組織を貫く矢状面の正中切開(長さ約15〜20mm)を、目の後方~2mmから頭頂間・後頭接合部まで伸びます。
   4. 切開部の毛細血管出血をコントロールするために、マイクロ止血鉗子または低設定の双極性焼灼を用いてください。曲線のマイクロリトラクターや5-0シルク縫合糸を周囲のドレープに固定して、皮膚フラップを横方向に優しく引き戻します。
   5. 前頭骨、頭頂骨、頭頂骨を含む背側頭頂骨全体を露出させます。マイクロキュレット(#00)を使い、骨表面に付着する線維性血管膜である骨膜を高倍率(外科用顕微鏡)で慎重にこすり取ります。
   6. 頭蓋骨を傷つけたり損傷を与えないように、優しく接線方向のストローク(ブレグマ縫合糸、ラムダ縫合糸、矢状縫合糸、冠縫合線)を避けてください。正確な開頭術および接着接着に不可欠な、滑らかで無血管の骨表面を実現します。
   7. 骨粉を除去し組織の水分を保つために、無菌で温かい(37°C)0.9%の生理食塩水で頻繁に灌漑を行い、組織の水分補給を維持します。
3. S1後肢領域の立体的標的化
   1. 高精度の立体誘導マニピュレーターアームを使い、細い外科用マーカーペンやマイクロドリルビットの先端を、冠状縫合線と矢状線の交差点である解剖学的基準点ブレグマに直接位置させます。顕微鏡で座標を確認し(10倍)。
   2. マニピュレーターを調整して、マーカーを正中線に対して正確に前後(AP)-1.5 mm(ブレグマ後方)および中外側(ML)+2.0 mm(右半球)に移動させます(矢状縫合)。
      注:この位置は一次体性感覚野(S1)の後肢表象領域(S1HL)に対応します。
   3. この座標で露出した頭頂骨表面に小さな十字線(<0.5mm)を軽く刻み込み、骨を貫通せずに視認性を確保します。
   4. マークされた部位を通過する主要な表面血管の存在がないか確認すること;重要な血管がある場合は、硬膜血管が破損すると大量出血し光学的明瞭さを妨げるため、最小限(±0.1〜0.2 mm)のML座標を調整してください。
   5. 最終調整座標を記録してください。
4. 精密開頭切開術
   1. 無菌の使い捨て3mm径生検パンチを、マークされたS1HL座標の上に正確に合わせます。パンチを優しく回転させながら、外皮質骨層を円周に沿ってしっかりと下向きに刻み込みます。パンチを抜いて。
   2. 0.5〜0.8mmのカーバイドバリを用いた高速マイクロサージカルドリルを立体アームに取り付け、0.9%の生理食塩水灌漑(冷却およびゴミ除去)を経て、傷ついた円内の骨を慎重に薄くします。
   3. 軽やかで接線的なミリング動作を使い、周囲から中心に向かって体系的に進行させながら、短いバーストでドリルを続けます。拡大鏡で骨の透視度を注意深く監視してください。
   4. 下の硬膜に微かな「赤み」が現れ、骨の厚さが最小であることを示す(<50μm)を観察したらすぐにドリルをやめてください。細かいマイクロピンセット(Dumont #5/45)とマイクロハサミに切り替えて、残った薄い骨片を中心から放射状に丁寧に持ち上げて剥がします。
   5. 硬膜をそのまま保存し、破れや大きな出血がないように透き通って光沢のある状態にしてください。軽度の硬膜出血は、0.9%の生理食塩水またはトロンビンに浸した滅菌圧縮フォームプレジェットで優しく圧迫して直ちに抑えてください。
   6. 露出した硬膜を温かく無菌の人工脳脊髄液(aCSF)または0.9%生理食塩水でたっぷり洗浄し、骨の残骸をすべて除去します。乾燥を避ける^17,20。
5. 慢性的な頭蓋窓埋め込みとヘッドバー固定
   1. 直径3mm、厚さ#1(約150μm)の無菌ガラスカバースリップを準備します。光学的クリアさと接着性の低下のために、内側表面に薄いシリコーンエラストマー層を塗ることも可能です。
   2. 細かい鉗子を使ってカバースリップを開頭切開部の上に正確に位置付けます。メーカーの指示に従って、速硬化・光硬化の歯科用セメント(例:メタボンドやカリズマ)を準備してください。
   3. 素早く作業(<90秒)に、カバースリップの周囲に薄いセメントのビーズを直接乾燥した清潔な頭蓋骨表面に塗布します。セメントがカバースリップの縁を完全に密閉しつつ、下からデュラに吸い込まないようにしてください。
   4. すぐに歯科用硬化ライト(青色光、450nm)で各区画ごとに20〜30秒硬化させます。硬化の遅い5mLの自己硬化アクリル用歯科用セメント(例:Jet Repair AcrylicやPaladur)を複数層補強し、頭蓋切除の端から数ミリメートル外に伸びる頑丈で低プロファイル(< mm)のセメントキャップを作ります。
   5. 初期硬化段階で、軽量でカスタムメイドのステンレススチールまたはチタン製ヘッドバー(例:長さ15〜20mm、中央開口部)をセメントキャップに埋め込みます。
   6. ヘッドバーは矢状縫合と平行に位置し、窓の中央に置くことで、将来の顕微鏡下でのヘッドレストに固定できる剛性のあるバランスの取れた固定点を提供しつつ、光学アクセスを妨げないようにしてください。
   7. セメントが完全に硬化するまで待ってください(≥15分)。完全な止血と窓の透明度を確認する²¹.
6. 術後の回復と経過観察
   1. セメント硬化後は、ネズミを耳棒と鼻クランプから慎重に離します。イソフルランを中止し、自然呼吸が完全に再開するまで100%酸素を投与してください。
   2. 術後直ちにブプレノルフィンHCl(0.05-0.1 mg/kg)を鎮痛のために投与します。動物を、事前に温められた(30〜32°C)酸素補給の回復室に移し、清潔な紙の寝床で覆われます。
   3. 胸骨横たわりと完全な歩行が回復するまで(通常30〜60分)継続観察してください。術後24時間にカルプロフェン(5 mg/kg)を2回目の投与。必要に応じて、温めた乳酸リンガー液(1mL s.c.)を水分補給として提供してください。
   4. ネズミは単独で、巣材で強化された標準的なケージに入れて飼い、ケージメイトが頭部インプラントを傷つけないようにします。環境条件(22〜24°C、湿度40〜60%、明暗サイクル12:12)を維持し、食事やハイドロゲルは自由に入手してください。
   5. 手術後7日間、マウスの痛みや苦痛の兆候(前かがみ姿勢、陰毛の勃起、活動減少、体重減少>15%)、感染(膿性分泌物、腫れ、赤み)、神経学的欠損、ヘッドバーの緩みなど)を観察してください。
   6. 急性外科的炎症の解消、正常な挙動の回復、グリパクリアランスの回復、基線皮質活動の安定化を確保するために、検査(画像診断やEA)を開始する前に最低≥7日間の回復期間を確保してください。^回復を追跡するために毎日体重を測ってください。

2. 電気鍼刺激

1. ST36経穴の正確な解剖学的定位
   1. マウスの後肢の確立された解剖学的ランドマークに基づき、ST36(「祖山里」)経穴を狙います。針を刺す前に、近位前脛骨を触診して脛骨結節(膝関節のすぐ先端、膝蓋靭帯が付着する位置に位置する顕著な骨突起)を特定します。
   2. 細かいキャリパーや無菌マーカーを使い、脛骨結節の中心に対して外側2mm(腓骨側)と尾側(後方)2mmを測定します。この位置は脛骨前筋腹部に対応し、深腓骨神経枝の浅層部、前脛骨動脈の分岐部の近位部に位置します。
   3. 必要に応じて透光照射で主要な浅い血管が存在しないことを確認します。
      注意:精度が非常に重要であり、わずかな偏差(>0.5 mm)が刺激される神経構造やその後の皮質反応に大きな変化をもたらす可能性があります。ランドマークの識別は、オペレーター間の変動を最小限に抑えるために、訓練を受けた人員によって一貫して実施されるべき^です。
      注:針の安定性を確保する方法は以下の通りです:(i) 針の挿入と固定後、マウスが順応し初期の苦労を減らすための適応期間を設けます。(ii) 電気鍼刺激器によって生成される振動周波数(例:2 Hz)は本質的に振幅が低い。さらに、使用される細い針(例:Φ0.16 mm)は、この最小限の振動に効果的に耐える十分な剛性を持っています。(iii) 実験中、オペレーターは針先の位置を継続的に監視します。動物の移動による有意な置換が観察された場合、試験データは除外します。
2. 無菌針挿入技術
   1. 皮膚消毒(70%エタノールとクロルヘキシジンの洗剤を交互に行う)後、無菌の使い捨てステンレス鍼(名目直径:0.18 mm、36ゲージ相当、長さ:13 mm)を標示されたST36座標の皮膚に垂直に挿入します。
   2. 針を皮膚、皮下組織、そして前脛骨筋に滑らかな回転動作で徐々に進め、組織の損傷を最小限に抑えます。
      注:ターゲットの挿入深さは皮膚表面から3mmです。この深さにより、タイプII/III筋の求心性(Aδ線維)および潜在的に体細胞性の小径線維が最適に結合し、下の脛骨や深部神経血管束との接触リスクを負いません。
   3. 針ハブを小さな滅菌接着パッドやカスタムクリップでしっかりと固定し、その後の電気刺激や微細な手足の動きを防ぐ。
   4. 挿入時にわずかで一時的な局所的な筋肉痙攣を観察することで、針の位置が安定しているか確認しましょう。これは筋肉内の適切な位置を示す生理学的指標です。
   5. 感染を防ぐために、特に慢性刺激パラ^{ダイムでは}厳格な無菌技術を全期間維持してください。
3. 電気鍼刺激のパラメータ化と投与
   1. 挿入された針の絶縁ハンドルを、プログラム可能な電気鍼刺激装置(例:HANS穴位神経刺激器、モデルLH202)の陽極(+)出力チャネルに接続します。
   2. 参照カソード(-)電極(通常は導電性ゲルでコーティングされた小型のステンレス鋼板またはクリップ電極)を同側の後足(例:かかと近くの足底面)に置きます。
   3. 両サイトで安全な接触と低インピーダンス(<5 kΩ)を確保してください。刺激装置を二相方形波(正負相のバランス)を送るようプログラムし、電極の偏極と組織損傷を最小限に抑えます。
   4. 刺激パラダイムを 高密度分散モードに設定します。2 Hz(低周波)のバーストを3秒間交互に行い、その後3秒間100 Hz(高周波)を交互に行う。
      注:この複合周波数パターン(しばしば2/100 Hzと表記される)は、単一周波数単独よりも中枢神経系における内因性オピオイド(例:βエンドルフィン、エンケファリン)およびモノアミン(例:セロトニン、ノルエピネフリン)の放出をより効果的に促進することが実証されています。
   5. 現在の強度を0.1 mAから段階的に調整し、軽度でリズミカルな足の痙攣(指や足首の屈曲)が視覚的に観察されるまで続けます。成マウスでは軽麻酔下で通常1.0 mAの範囲に達します。この痙攣閾値は、運動遠心性およびそれに伴う大口径求心性(Aβ線維)が十分に動員されていることを示し、苦痛や激しい抵抗を引き起こすことなく生理的活性化を確認させます。この調整された強度を20分間の^{刺激セッション中}ずっと維持^{してください。}
4. 重要な手続き的管理と生理学的モニタリング
   1. 刺激アーティファクトの軽減
      1. EAケーブルはイメージング機器やヘッドステージから物理的に分離してください。
      2. 強固な接地を実施する:刺激装置の接地端子を専用のアース接地に接続し、顕微鏡のフレームと動物用加熱パッドが共通の接地点を共有していることを確認しましょう。
      3. 可能であれば、刺激パルスを露出鏡のブランキング信号と時間的に同期させるか、ポストホック信号処理を用いてカルシウム痕跡から残留する電気的アーティファクトを除去します。
   2. 生理学的安定性
      1. 20分間のEAセッション中、体温(フィードバック制御式温熱パッドで37.0±0.5°Cに維持)、呼吸数(80〜120回/分)、SpO₂(>95%)を継続的にモニタリングします。
      2. 画像検査と刺激を組み合わせた状態の不動については、軽度のイソフルラン麻酔(1.0〜1.5%)を維持してください。誘発された足の痙攣を継続的に観察してください。もし減弱または停止した場合は、針の接触とインピーダンスを確認し、強度をわずかに(≤0.1 mAずつ)調整して、一貫した軽度の運動活性化を維持します。
      3. 苦痛の兆候(例:頻呼吸、激しいもがき)が見られた場合は、直ちに刺激を中止してください。
   3. 再現性
      1. すべての動物とセッションで、針の種類、挿入深さ、刺激モデル、キャリブレーション方法(足のピクピク閾値)を使いましょう。各被験者に使用された最終刺激強度を記録してください。
      2. 麻酔終了や追加処置を行う前に、刺激後最低5分の回復期間を確保すること^27,28。

3. EA中の二光子イメージング

1. 動物の準備、頭部固定、生理的維持
   1. 術後≥7日間の回復後、モーター駆動のXYステージに搭載されたカスタム設計の振動減衰固定装置内に埋め込みされたヘッドバーを用いてThy1-GCaMP6fマウスをヘッドフィックスします。
   2. 動物を低摩擦の空気潤滑円筒形トレッドミルに快適に乗せ、後肢の自由な動きを可能にします。100%酸素に0.5〜0.8%イソフルランを鼻錐で投与し、軽度の外科的麻酔を維持します。このイソフルランレベルの低下により、神経活動の抑制を最小限に抑えつつ、高解像度画像撮影に十分な不動性を確保します。
   3. 体温(フィードバック制御式加熱パッドで37.0±0.2°Cに維持)、呼吸数(100〜140回/分)、末梢酸素飽和度(SpO₂>95%)を継続的にモニタリング・記録します。
   4. 長時間の画像撮影中に角膜乾燥を防ぐために眼用ジェルを塗布してください。ST36でEA針挿入のために、S1HL頭蓋窓の同側の後肢がアクセス可能であることを確認しましょう。
   5. 頭部固定後は生理的安定化のために15〜20分間隔を空けて^{から画像診断}を開始する。
2. レイヤーII/IIIイメージングのための光学的ターゲティングと最適化
   1. 高品質な神経信号を取得するための焦点面を正確に特定すること。この認証手順に従ってください。
      1. レーザー出力を低レベル(通常はイメージング出力の10〜20%、例:5〜10 mW)に下げて、平面位置特定時の不必要な光漂白や光損傷を防ぎます。
      2. 二光子顕微鏡のZ軸駆動装置を使い、対物レンズをゆっくりとミクロンステップ単位で動かします。頭蓋の窓の表面から始めて、脳組織の奥へと進みます。
      3. ライブプレビューモードでは、ステップ3.2.1.4および3.2.1.5で説明されている視覚的インジケーターを使って焦点面を特定します。
      4. ニューロン体体層の正しい焦点面については、画像に明確で明るい点状構造(神経体面)が円形または楕円形で背景コントラストが良いか確認してください。細胞の境界が鋭く、独特の「塩と胡椒」のような外観を示すことを確認してください。
      5. 誤った焦点面の場合:画像がぼやけたり均質で、明確な点構造が明確でない場合は、焦点が体面のない領域にあることを認識してください。大きくて暗く構造化されていない血管の影が見える場合は、それが血管層であると特定してください。
   2. 適切な蛍光基準の検証
      1. 実験刺激を適用する前に、健康で安定した蛍光基準値を確認し、その後のカルシウム信号(ΔF/F)の有効解釈を確保してください。ステップ3.2.2.2-3.2.2.4を実行してください。
      2. レーザー出力を正式なイメージングレベル(例:30〜50 mW)に調整します。
      3. 数秒間、高速で低解像度のプレビューモードで画像を取得できます。
      4. リアルタイムで表示される平均蛍光強度を観察するか、画像の明るさを直接監視してください。実験データ取得に進む前に、信号が安定し、急速な光漂白の兆候がないことを確認してください。
   3. 画像視野は頭蓋窓の中央に位置します。
      1. 対物レンズとカバースリップの間に超音波ゲルまたは蒸留水を塗布し、浸漬結合を行います。赤外線ドット勾配コントラストまたはエピフルオレセンス照明を用いて、表面血管を特定し、視野角(FOV)を調整して大きな表面血管(>20μm直径)を避けることができます。
      2. 調整可能なフェムト秒パルスTi:サファイアレーザーを使って 二光子励起 モードに切り替えます。 励起波長 を920 nmに設定し、GCaMP6f(ピーク~920 nm)を励起するのに最適であり、短波長に比べて緑色の自己蛍光や光損傷を最小限に抑えます。
      3. 透明硬膜を通して皮質表面(PIAMATER)に焦点を合わせながら、レーザー出力(通常20〜50 mW)を徐々に増加させます。圧電ナノフォーカス装置を用いて対物レンズのZ位置を調整し、皮質層II/IIIに対応する200±10μmの深さまで到達します。
      4. 特徴的な神経細胞密度と形態によって深さを確認する:直径10〜15μmの小から中型の錐体型ニューロン体質の密集集団で、目に見える頂端樹状突起。
      5. レーザー出力および光電子増倍管(PMT)のゲイン設定を最適化_し、飽和度(ピクセル強度~検出器最大値の50-70%)なしで強力な基線GCaMP6f蛍光(F0)を実現し、背景を最小限に抑える^30,31。
         注:イメージング中、920 nm励起光の平均出力は対物レンズで正確に30〜50 mWに維持されていました。このパワーレベルは、同じ外科手術を受けた動物組織を対象としたパイロット実験で検証され、最大25分間のスキャン期間で効果的な信号獲得を保証しつつ、光損傷や蛍光光漂白を最小限に抑えました。
3. 高速カルシウムイメージング取得プロトコル
   1. 高速フレーム取得のために共振スキャナーの設定:
      フレームサイズ:512 × 512ピクセル(典型視野角:~450 × 450 μm、ピクセルサイズ ~0.88 μm)
      フレームレート:双方向走査(~14 kHzラインレート)で毎秒7フレーム(fps)を実現。この速度はGCaMP6fの減衰速度論(τ~500ms)を十分にサンプリングしつつ、信号対雑音比(SNR)のバランスと光漂白の最小化を行っています。
      ピクセル滞留時間:~0.8 μs(7 HzでSNR最適化)。
   2. 取得ソフトウェア(例:ScanImage、Prairie View)を用いて連続的なタイムラプス取得を開始します。EA刺激開始前の5分間の基準期間を記録し、刺激前の神経活動動態(F₀)を確立します。
   3. 正確にt=5分でST36でEA刺激を開始し、画像撮影は中断なく続けます。20分間のEA刺激期間中、継続的にデータを取得します。総スキャン時間=25分(1500秒、~10,500フレーム)。
   4. データをマルチTIFFスタックまたは独自のバイナリ形式として保存し、埋め込みタイムスタンプをTTL入力チャネルを介してEAトリガーパルスに同期させます。
   5. レーザーの出力安定性と焦点ドリフト(<2μm)をリアルタイムで監視し、重要なドリフトが発生した場合(例:>5μm)に限り、時間点^32,33に注意して再フォーカスを一時停止してください。
4. 厳密なモーションコレクションと空間位置づけ
   1. 取得後、MATLABのNoRMCorre(非剛性モーションコレクション)を用いて生イメージングスタックを処理し、呼吸や脈拍などの微小動作による空間アーティファクトを除去します。
   2. まず、スタックを重なる空間的な区画(例:64ピクセル×64ピクセル、50%の重なり)に分割します。各パッチごとに、基準期間から高SNRフレームを平均して参照テンプレートを計算します。
   3. フーリエベースの交相関係を用いて、テンプレートに対して各フレームのX-Y平行移動シフトを計算します。これらのシフトはサブピクセル補間で適用します。
   4. 次に、非剛性変形に対処します。パッチ内の局所歪みを区分アフィン変換(平行移動+せん断)を用いてモデル化します。登録の精度を高めるためにテンプレートを繰り返し更新してください。主なパラメータ:
      max_shift:20ピクセル(翻訳の上限)
      max_dev:3ピクセル(最大非剛体偏差)
      bin_width:50フレーム(テンプレート更新のための時間ビンニング)
   5. 補正効果を可視化するには、フレーム間の相関プロット(補正後はほぼ1.0で安定するはずです)と平均画像投影差マップ(補正前後)を作成します。モーションコレクトスタックは後処理のために取っておきましょう。このステップは、特にEAによる微細な四肢の動きにおけるカルシウム過渡期の正確なピクセル単位解析に不可欠です。

4. 時空動態解析

モーション補正イメージングスタックは、PythonのSuite2pパイプライン(v0.12.3)を用いて自動神経細胞の分割と信号抽出を行います。主な処理段階には以下が含まれます:

1. 空間的フットプリント識別
   1. 制約付き非負行列分解(CNMF)を適用してスタックを空間成分に分解します。
   2. 相関に基づくアプローチを用いて関心領域(ROI)を初期化します。空間的交差相関が0.7>、局所SNRが4>のピクセルを統合して候補ROIを作成します。体細胞ROIは、サイズ(直径8-15μm)および円形性(コンパクト度閾値>0.6)で樹状突起や軸索と区別します。
2. ニューロピル汚染の是正
   1. 各ROIに対して、同心神経皮環(内側半径1.5×ROI半径、外側半径2.5×ROI半径)を定義します。
   2. 最小二乗回帰法でニューロピル係数(r_neuropil)を計算します:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0.7 × F_neuropil(t)
      (係数はThy1-GCaMP6fマウスで実証的に検証されています。)
3. シグナルのデコンボリューション
   1. OASIS(l₁正則化脱畳み込み)を用いてAR(2)ノイズモデルを用いて、ΔF/Fトレースからスパイク確率 S(t) を推定する。
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      ここで「k」はカルシウム過渡核、 ε はガウスノイズです。
4. 品質管理
   1. SNR<3、空間重なり>30%、または神経相関>0.3のROIは除外します。視覚的検証はSuite2p GUI³⁴を通じて行われます。
      具体的な操作やインターフェース要素は 補足ファイル1に記載されています。上記で生成されたモーションコレクトされたTIFFファイルは、直接Suite2pパイプラインに入力されました。Suite2pの統合環境には独自のリジッドモーションコレクションが含まれていますが、より精密な非リジッド補正がすでに適用されていたため、この冗長な内部ステップは無効化されました。自動抽出されたニューロンROIは 補足ファイル2で確認できます。

Results

S1皮質の構造的特徴づけと基線神経活動
まず、画像実験のための高精度構造的および機能的基準を確立しました。組織形態解析により、非カプド(図2A)とカバースリップアパルド(図2B)の頭蓋窓準備の間に明確な構造的差異が認められました。カバースリップの適用は軽微な圧縮アーティファクト(矢じり、図2B)を生じさせましたが、関心領域(ROI)の構造的完全性を効果的に維持し、安定した慢性イメージングに不可欠でした。その後の2光子z射影により、皮質柱を通ってL2/3層からL5層まで分岐した頂端樹状突起の密なネットワークが明らかになりました(破線、図2C-E)。高解像度の画像品質は、樹状棘の明確な分解可能性(

Discussion

電気鍼治療(EA)の皮質への影響をリアルタイムで観察する重要なギャップを埋めるため、慢性的な頭蓋窓埋め込みによる光学アクセス、標準化されたEA刺激、一次体性感覚(S1)皮質を標的とした縦方向の二光子カルシウムイメージングを組み合わせた包括的な統合プロトコルを提示します。

この統合プロトコルは、EAの皮質効果の研究において従来の方法に比べていくつかの明確な利点を提供します。第一に、EA刺激³⁶時にS1ネットワーク内の数百のニューロン間で同時にミリ秒スケールの神経活動動態を捉える、前例のない時空分解能を提供します。これにより、適切な標識と組み合わせることで、活性化の正確な時間的順序、活動波の空間的分布、異なる神経細胞サブタイプ間での応答の異質性が明らかになります。次に、慢性的な頭蓋窓により縦方向画像診断が可能となり、研究者は繰り返しのEAセッション³⁷に応じてS1内の皮質表象や回路動態がどのように進化するかを追跡し、累積的鎮...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
カープロフェン	MCE	該当なし	鎮痛のために5 mg/kgを投与
デジタル立体タキシックフレーム	後輪駆動	コップ・モデル1900
電気鍼刺激器	HANS LH202(2/100 Hzの二相パルス)	該当なし	HANS LH202(2/100 Hzの二相パルス)
イソフルラン	後輪駆動	R510-22-10	医療グレード、100%酸素キャリア
マイクロドリルシステム	後輪駆動		0.5mmカーバイドバー、塩水冷却
ポビドンヨード	MCE	HY-B2234	10%溶液
スキャンイメージ	スキャンイメージ	https://scanimage.org/
無菌生理食塩水	北雲天	ST341-500ml	0.9% NaCl
外科用顕微鏡	ツァイス	https://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html	10-40倍以上;拡大
Thy1-GCaMP6fトランスジェニックマウス	サイゲン	5523978	生後8〜12週、オス/メス
二光子顕微鏡	ニコン A1MP	ニコン A1MP	Ti:サファイアレーザー(920nm励起)