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膜タンパク質阻害結合の調査のためのバイオレイヤー干渉計:TACAN変異体とモデルシステムとしてのGSTx4

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DOI：

10.3791/69348

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2026年5月8日

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1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

この記事について

サマリー

本論文は、洗剤可溶性膜タンパク質の膜タンパク質-リガンド相互作用を研究するためのバイオレイヤー干渉法(BLI)実験の最適化と実施のための詳細なプロトコルを提供します。TMEM120A M207A変異体とペプチド阻害剤GsMTx4の相互作用をモデルとして用い、このワークフローはタンパク質の調製、バイオセンサーの負荷、動態データ取得を概説します。

要約

生体層干渉法(BLI)は、生体分子相互作用のリアルタイムかつ定量的な解析を可能にする効率的な生物物理学的手法です。可溶性タンパク質には一般的に用いられますが、疎水性と洗剤依存性のため膜タンパク質への応用は依然として困難です。本研究は、洗剤可溶性膜タンパク質とペプチド阻害剤間の相互作用を特徴づける最適化されたBLIプロトコルを提示します。

モデル系として、ゲーティング修飾ペプチドであるグラモストラ・メカノトキシン4(GsMTx4)が、多機能膜タンパク質変異体M207Aに対してTMEM120A試験されました。FLAGタグ付きTMEM120A変異株は、タグベースで蛍光および酵素ラベルを含まないアンチFLAGバイオセンサーに固定され、GsMTx4の連続希釈にさらされて関連率および解離率を測定しました。

このプロトコルは、ローリルマルトースネオペンチルグリコール(LMNG)を用いた洗剤最適化と、質量光度測定および差分走査蛍光測定(DSF)による補完的な特性評価を統合しています。このワークフローにより信頼性の高い運動学的測定が可能であり、中スループットスクリーニングと互換性があります。このアプローチは、洗剤の安定性が保たれる他の膜タンパク質リガンド系にも適用可能である可能性があります。総じて、本研究は固定化効率と分析物送達に影響を与える主要なパラメータを強調し、阻害剤プロファイリングや膜タンパク質相互作用の機構的研究におけるBLIの潜在的な有用性を支持しています。

概要

膜タンパク質は、シグナル伝達、イオンおよび代謝物の輸送、膜の組織化など、重要な生理学的過程において中心的な役割を果たします。細胞のコミュニケーションや恒常性に関与していることから、臨床開発における薬剤標的のかなりの割合を占めています。膜タンパク質-リガンド相互作用の理解は、機能の解明と治療設計の指針となる上で極めて重要です。しかし、これらのタンパク質の両親性特性と脂質環境への依存性は、精製、安定化、生物物理的特徴付けにおいて大きな課題を提起しています。

表面プラズモン共鳴(SPR)および等温滴定量熱測定(ITC)は、膜タンパク質-リガンド相互作用の動力学および熱力学を研究するために広く用いられている技術です。適切に最適化されれば、洗剤で溶けた膜タンパク質や再構成された膜タンパク質に対しても詳細な定量的洞察を提供できます。マイクロスケール熱泳動(MST)は、特に膜タンパク質³において、ほぼ自然条件下での結合親和性の評価にも成功裏に応用されています。しかしながら、これらの方法は大量のサンプル消費、膜タンパク質の安定性維持の困難、特定の洗剤システムとの互換性の制限によって制限されることがあります。

バイオレイヤー干渉法(BLI)は、洗剤やアンフィポールで可溶性に溶けた膜タンパク質を含む生体分子相互作用の定量的測定を可能にするリアルタイム光学技術です。前述の生物物理学的手法に加え、BLIは結合(kオン)、解離(kオフ)、平衡解離定数(KD)などの結合速度を直接測定できる効率的なプラットフォームを提供し、サンプル濃度を低く、洗剤やナノディスク溶解膜タンパク質への適応も容易に行えます。また、すべての生物物理技術と同様に、BLIにも独自の制限があることも注目に値し、これは議論セクションで述べます。

BLIは、バイオセンサーの先端から反射された白色光の干渉パターンの変化を検出し、生体分子結合イベントに対応する光学厚さの変化を検出します。これらのシフト(Δλ、nm単位)はセンセングラムとして記録され、センサー表面で束縛された質量に比例します。BLIはタンパク質-タンパク質およびタンパク質-リガンド相互作用(ペプチドや小分子を含む)に広く応用されており、ナノモルからマイクロモル4までの親和性範囲に適しています。その柔軟性、低いサンプル消費量、比較的単純な構成により、洗剤可溶性膜タンパク質5,6,7の研究において潜在的に有利なツールとなります。

本研究は、膜タンパク質であるM207A TMEM120Aペプチド阻害剤であるグラモストラメカノトキシン4(GsMTx4)との相互作用を特徴づけるBLIプロトコルを提示します。TMEM120Aは機械的疼痛検出に関与する機械感性イオンチャネルとして提案されています8;しかし、そのイオンチャネル活性は依然として議論の的となっています。複数の研究で、HEK293やCHO細胞1,9,10,11などの異種系でTMEM120Aが発現すると、機械感受性電流が存在しないことが報告されています。これまでに4件以上のクライオEM研究で閉じた状態のTMEM120A構造が解明されており、1,9,10,11は開放的な立体構造は観察されていません。

分子動力学シミュレーションおよび電気生理学的解析により、野生型ヒトのメチオニン207(M207)がイオン伝導経路内のゲートバリアとして機能する可能性が示されているTMEM120A 11。この残基のアラニン(M207A)変異は、ヘリックス充填を変化させ、Phe223のような疎水側鎖を置換することでイオン透過性を高めることが示されています。その結果、M207A変異体はGsMTx4との結合研究に選定されました。

GsMTx4はクモ毒由来のゲーティング修飾ペプチドで、機械感受性カチオンチャネルを阻害します。32アミノ酸配列からなり、分子量は4〜5 kDa、ピエゾおよびTRPチャネルを含み、主に脂質二重層と相互作用することで形成されます。12,13は孔を直接遮断するのではなく、脂質二重層と相互作用します。過去の研究では、GsMTx4が人工二重層システムにおけるTMEM120A活性を低減させることが示されています。BLIアッセイでは、TMEM120A M207A変異体をアンチFLAGバイオセンサーで固定し、GsMTx4の濃度を増加させて、結合(kオン)および解離(kオフ)率を測定しました。

本研究は、バイオレイヤー干渉計(BLI)を用いた洗剤最適化および動態分析のための詳細なプロトコルを提供します。BLIにはセンサー過負荷や質量輸送効果によるアーティファクトの可能性や、高速結合率(kオン)相互作用への適合性の低下などいくつかの制限がありますが、制御された洗剤溶解条件下での膜タンパク質-リガンド相互作用の研究には有用な手法です。このプロトコルは、中程度から低い結合親和性を持つ系(通常はナノモルからマイクロモルの範囲)に適しており、適切なコントロールやバッファー条件が適用されれば、他の疎水性ターゲットにも適応可能です。

プロトコル

1. タンパク質精製とサンプル最適化

  1. 細胞培養とトランスフェクション
    1. HEK293T/SF17懸濁細胞を、20 mM L-グルタミンを補足した血清不使用培地で、振動インキュベーターで120 RPM、37°C、湿度80%、CO₂8%で培養します。細胞はパセジング(5番)まで維持し、細胞密度は約5×10⁶細胞/mLに達することができます。
    2. 製造元の指示に従い、市販のトランスフェクション試薬を用いてpCDNA3.1ベクターの細胞にTMEM120A M207Aプラスミド(N末端FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A)をトランスフェクトします(材料 表参照)。
    3. ペレットは4°Cで5,000 × g の遠心分離で15分間細胞をトランスフェクトしました。 細胞ペレットは-80°Cで保存し、精製されるまで保存します。
  2. 細胞溶解と溶解(図1)
    1. 30 mLの細胞ペレットを100 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネエトスルホン酸(HEPES)、pH 7.8を含む溶解バッファーに再懸浮させます。300 mM NaCl;0.5%(w/v)または4.98 mMのラウリルマルトースネオペンチルグリコール(LMNG);プロテアーゼ阻害剤カクテル1回;DNase Iを50μg投与;10%(v/v)グリセロール。
    2. 細胞を25%振幅の超音波で溶離し、20秒オン/20秒オフのパルスサイクルを用いて15分間、サンプルを氷上に保管して過熱を防ぎます。
    3. 溶解液は4°Cで25,800× g で遠心分離し、45分間洗浄します。
  3. アンチFLAG樹脂を用いた親和性精製
    1. 平衡バッファー付き25 mM HEPES、pH 7.8を含む平衡抗FLAG M2樹脂;200 mM NaCl;0.05%(水/量)または0.4975 mM LMNG;10%(v/v)グリセロール。
    2. 浄化した上澄液を平衡樹脂と共に4°Cのロッカーで2時間培養します。
    3. 樹脂を25 mM HEPES、pH 7.8を含む洗浄バッファーで2回洗います。150 mM NaCl;0.05%(水/量)または0.4975 mM LMNG;10%(v/v)グリセロール。
    4. 結合タンパク質を25 mM HEPES、pH 7.8を含む洗脱バッファーで溶出します。400 mM NaCl;0.001%(水/水量)または0.00995 mM LMNG;10%(v/v)グリセロール;200 μg/mL FLAGペプチド。
  4. 濃縮およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
    1. 30 kDaカットオフの遠心フィルターユニットを用いて、溶出タンパク質を~500 μLまで濃縮します。
    2. 25 mM HEPES、pH 7.8で平衡化された参照サイズ除外カラムを用いてSECを実施;200 mM NaCl;0.00015%(水/水量)または0.00149 mM LMNG。
    3. 標的タンパク質に対応するピーク分数を収集し、プールします。
    4. 最終濃度~3 mg/mLまで濃縮します。親和性精製後、TMEM120A M207Aタンパク質モノマーがSDS-PAGE上で約43 kDaで現れることを確認します(図2A)。SECについては、LMNG中の精製タンパク質が約150 kDaに相当する単分散ピークとして溶出していることを確認し、これはLMNG洗剤ミセルとともにTMEM120A M207A二量体を表します(図2B)。
      注意:時折、単量体タンパク質バンドが約50 kDaで現れることがあり、これは洗剤で溶けた膜タンパク質ではよく見られます。膜タンパク質サンプルを沸騰させるのが一般的ではないためです。

2. ナノ差分走査蛍光計(NanoDSF)による熱安定性解析

  1. 精製済みTMEM120A M207Aタンパク質をSECバッファー(25 mM HEPES、pH 7.8、200 mM NaCl、0.00015% LMNG)で0.15 mg/mLに希釈します。
  2. 各サンプル10μLを高感度毛細血管に注入します。
  3. 温度が25°Cから90°CまでのNanoDSF機器で熱シフトアッセイを実施します。
  4. 対応ソフトウェアを使ってアッセイを設定し、自動分析を行います。
  5. 単一の熱遷移(Tm)曲線が見えるか確認し、協調的な展開事象を示しているか(図3)。

3. オリゴマー状態決定のための質量光度測定

  1. SECバッファー(25 mM HEPES、pH 7.8、200 mM NaCl、0.00015% LMNG)で80 nMに希釈したサンプルを準備します。
  2. サンプルを事前に洗浄した質量光度互換スライドに入れます。
  3. 標準設定でデータを取得し、タンパク質標準を用いて校正します。
  4. 解析ソフトウェアでデータを処理し、大量分布のヒストグラムを生成します(図4A-C)。

4. バイオレイヤー干渉法(BLI)プロトコル

注:本プロトコルは、384ウェルマイクロプレート形式を用いて、FLAGタグ付き TMEM120A M207A とGsMTx4などのリガンドとの相互作用を研究するために設計されたBLIキネティックアッセイを記述しています。TMEM120A向けに開発されたものの、このワークフローは他の膜タンパク質にも応用可能です。すべての実験は、FLAGバイオセンサープローブを用いた光学干渉計プラットフォームを用いてFLAGタグ付きTMEM120A M207Aを固定化しました。384ウェルの黒色マイクロプレートを使用し、最適化されたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)バッファーを使用し、25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015%(w/v)、0.0005% Tween-20、pH 7.8を含みました。非特異的結合を最小限に抑えるためにTween-20も含まれました。タンパク質濃度は250 nMに維持され、再現性を確保するためにすべてのアッセイは重複して実施されました。

  1. アッセイ設計の考慮事項
    1. 温度平衡
      1. BLIアッセイ開始前に、バッファー、サンプル、バイオセンサープローブを含むすべてのアッセイ成分を室温(約20〜25°C)に平衡させます。データ取得時には、タンパク質の安定性、リガンド結合、再現性を最適化するために、活性分析に推奨される30°Cのアッセイ温度を維持してください。
        注:この平衡ステップにより、実験中の温度変動による一貫した運動学的プロファイルが確保され、ノイズが最小限に抑えられます。アッセイ開始前に、すべての試薬およびバイオセンサーが熱平衡に達するまで十分な時間(少なくとも10〜15分)を確保してください。
    2. センサーの水分化と再生
      1. 使用前に、新しいFLAGバイオセンサーをMaxプレート内で250μLのBLI互換バッファー(SECバッファー、25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% w/v LMNG、0.0005% Tween-20、pH 7.8を含む)に水和化します。
        注意:バイオセンサーは、信号取得に妨げられ結果に欠ける汚染を避けるため、清潔で埃のないピンセットで慎重に取り扱ってください。センサーの再利用には、Qバッファー(0.3 Mグリシン、pH 3.8)を用いて再生を行います。適切な水和と再生は、特に環境条件に敏感な洗剤可溶性膜タンパク質を扱う際にセンサーの性能と再現性を維持するために不可欠です。
    3. バッファ処理
      1. 液体を供給する際は気泡を避けるようにしてください。気泡は光信号の取得に干渉する恐れがあります。
    4. バッファーの組成と一貫性
      1. タンパク質の機能を保ちつつ、非特異的相互作用を最小限に抑えるバッファーを使いましょう。TMEM120A M207Aに対して、25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015%(w/v)LMNG、0.0005%(w/v)Tween 20、pH 7.8を含むバッファーを準備します。
    5. タンパク質固定化
      1. リガンド負荷を最適化し、センサーの飽和度を50〜80%に達成します。250 nMの固定濃度のタンパク質を使用し、典型的な負荷持続時間は約120秒です。FLAGタグ付きのTMEM120A M207A(250 nM)をバイオセンサーに120秒装着し、50〜80%の飽和度を実現します。
      2. ロードフェーズ中にバイオセンサー信号が最大結合能力の 50〜80% に達していることを確認してください。
        注意: 50%未満 の信号はタンパク質固定不全を示す可能性があり、 80%を超える と質量輸送の制限や立体障害を引き起こし、動力学的測定を妨げる可能性があります。
      3. 質量輸送効果を評価するために、分析物濃度(例:100 nM GsMTx4)を一定に保ちつつ、FLAGバイオセンサー上のTMEM120A-M207Aの負荷レベルを変化させるコントロール実験を実施します(補足図S1)。
        注:その後の動態的測定(結合、解離、全域結合適合、kオンおよびkオフの決定を含む)は、主アッセイで得られたものと有意な差はありませんでした。この結果は、50〜80%の範囲でのTMEM120A負荷が重大な質量輸送アーティファクトを導入しないことを示しており、バイオセンサー負荷レベルが信頼性の高い運動解析に適していることを裏付けています。
    6. KD 推定
      1. 0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、30 μM、50 μM、100 μMの分析物(GsMTx4)濃度を試験して結合親和率(KD)を決定します。
    7. バックグラウンド信号制御
      1. 背景信号を正確に差し引き、信頼性の高い運動学的測定を確保するための適切な制御を含ませてください。
      2. アッセイ中に発生する非特異的結合やドリフトを考慮し、参照用FLAGプローブを使用します。
        注意:このリファレンスプローブは標的タンパク質を固定してはいけず、サンプル含有プローブから得られた信号を補正するための基準として機能します。
      3. サンプル信号から参照信号を差し引き、FLAGタグ付きTMEM120A M207Aと分析物との特定の相互作用のみを解析します。
        注意:アッセイ全体を通じて、参照FLAGプローブが最小限の信号を示していることを確認しましょう。安定して低い基線は無視できるほどの非特異的結合を示します。基準信号が変動または増加した場合は、非特異的相互作用を減らすためにバッファーの組成、プローブの取り扱い、または試料準備を再評価してから動力分析を進めます。
  2. 動力学分析のための基本アッセイパラメータの設定
    1. データ取得周波数を5Hzに設定すると、5ポイント/秒を収集できます(すべての運動学アッセイで推奨されます)。
    2. プレートフォーマットとして 384ウェルプレート を選択してください。
    3. シェーカーの回転数を1,000 RPMに設定し、温度は周囲温度と30°C(この実験では最適な動力学結果を得るために30°C)の間に設定します。
  3. プレートのセットアップを設定してください。
    1. プレートセットアップタブに移動し、384ウェルプレートとMaxプレートの両方のウェル割り当てを定義してください。
    2. 384ウェルプレートに井戸機能を割り当てます。
      注:384ウェルプレートとMaxプレートの両方で使用された記号と注釈は補 足表S1にまとめられています。
      1. バッファー、タンパク質(ローディング)、リガンド(サンプル)などの役割に応じてウェルを標識します。
      2. 活性化アッセイのためにタンパク質ローディングウェルに濃度(例:250 nM)を注釈付けします。
        注:kのkとKDの計算には正確なラベル付けが不可欠です(補足図S2A参照)。
    3. 最大プレートマップ(プローブプレート)を設定します。
      1. バイオセンサープローブを適切な井戸に割り当ててください。
      2. プローブ再生を計画する場合は、再生および中和バッファー用の井戸を割り当ててください。再生時の適切な自動化を確保するために、ソフトウェア内でこれらの井戸に明確なラベルを付けてください(補 足表S2参照)。
        注:アッセイバッファーは25 mM HEPES(pH 7.8)、200 mM NaCl、0.00015%(w/v)LMNG、0.0005%(v/v)Tween-20で構成されていました。アンチFLAGバイオセンサープローブの再生ステップは、0.3%グリシン(pH 3.8)を含むQバッファーを使用して行われ、その後アッセイバッファー(25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% LMNG、0.0005% Tween-20、pH 7.8)を用いた中和ステップが行われました。
  4. アッセイステップタブを選択してください。
    1. アッセイステップタブに移動して、キネティックアッセイのワークフローを設定します。各アッセイ相ごとにウェル位置を指定し、ベースライン、タンパク質ローディング、結合、解離(補足図S3参照)を挙げます。
    2. ドロップダウンメニューから適切な ステップタイプ を選択します。正確な動態分析のために、連合および解離のステップが正しくラベル付けされていることを確認してください。
    3. 各ステップの所要時間を秒単位で入力すると、すべての相互作用フェーズの 露光時間を 定義できます。
      1. 基準ステップの持続時間を、タンパク質負荷(60秒)前にセンサーの平衡を許容するように設定します。
      2. タンパク質ローディングステップの期間を設定し、望ましいリガンド固定レベル(60秒)を達成するようにします(図5)。
      3. 結合ステップの時間は、十分な分析物結合(300秒)を確保するように設定します(図5)。
      4. 解離ステップの持続時間を、分析物の結合速度論を十分に捉えるように設定します(600秒)(図5)。
    4. 各ステップごとにシェーカー速度(RPM)を設定し、混ぜの一貫性と最適なデータ品質(1,000 RPM)を維持します。
  5. アラインとフィルタのステップ(補 足図S4 および 補足図S5参照)
    1. 必要に応じてデータ範囲を調整して、キネティックステップのアーティファクトを除去して生データ補正を行います。
    2. Y軸を揃えるには、アリューションステップの開始時に「アラインメントステップタイプ」の「アリューション」を選択し、「開始」オプションを有効にしてデータをアリゲートします。
    3. 標準的なキネティックアッセイ中にステップ間の連続性を維持するために、 インターステップ補正 オプションを有効にしてください。
    4. フィルタリング:傾向を歪めずに信号ノイズを低減するためにデータスムージングを適用します。平滑化されたデータと生信号を比較するには 「処理済み」 を選択します。
  6. 参照ステップを設定してください(補 足図S6参照)。
    1. 参照プローブを選択して参照プローブを指定し、「 参照プローブ 」ボタンをクリックしてください。
    2. サンプルプローブの対応するカラム番号をクリックして、サンプルプローブを選択します。
    3. 減算関数を定義するには、 数式エディターを開き、「 数式編集」をクリックし、背景を除去するための 減算 関数を定義してください。
    4. 参照の減算が正しく適用されているかを確認するために、 表ビュー を確認してください。
  7. バインディングフィッティングステップ
    1. フィッティングタブに移動し、解析パラメータを定義してください(補足図S7)。
    2. データ選択:局所的な運動学フィッティングのために、結合フェーズと解離フェーズの両方を含めてください。曲線フィッティングが悪い、または信号が不安定な場合は、外れ値を手動で除外してください。
    3. バインディングモデルの選択:複雑な挙動が観察されない限り、データに適合する1:1のバインディングモデルを選択してください。曲線のオーバーレイや残差をレビューしてモデル適性を検証してください。
    4. フィッティング戦略:データ品質および実験目的に応じて、以下のいずれかのフィッティング戦略を選択してください。
      1. 局所:各分析物濃度を個別に適合し、連合および解離の動態を独立して評価できるようにします。
      2. グローバル:単一の動態パラメータセットを用いてすべての分析物濃度を同時に適合させ、データセットの全体モデルを提供します。
      3. 全:すべての集中において、連想期と解離期の両方に適合します。
      4. 部分的:解離を無視して連想段階のみに当てはまる。
        注:BLIデータは局所的完全フィッティングを用いた1:1ラングミュア結合モデルを用いて解析されました。局所フィッティングにより、各分析物濃度が独立して処理され、解離相における異質性によるアーティファクトを最小限に抑えつ、結合動力学を正確に表現できます。この手法により、変動信号や不安定信号を持つ領域での過学習を避け、運動パラメータ(kのオン とkのオフ)のより信頼性の高い推定が可能となります(表1および表2)。
  8. 運動解析
    1. フィット曲線と残差のレビュー:フィット曲線と対応する残差を調べ、モデルの質と妥当性を評価します。残差が体系的な偏差なく零付近でランダムに分布していることを確認しましょう(代表的な残差については 図4E を参照)。
    2. 適合度の悪いデータの除外:フラットでノイズが多い、または信頼性の低い信号を示す分析物濃度を除去し、モデル全体の精度を向上させます。
      注:例えば、10μM濃度は5μMデータセットと重複するためフィッティングから除外されており、これが動力パラメータ推定を歪める可能性があります(図6A,B参照)。

結果

TMEM120 M207A変異体は、N末端FLAGタグを符号化したpCDNA3.1ベクターを用いてHEK293SF-17懸濁細胞で発現させました( 図1)。一時的なトランスフェクションにより組換えタンパク質発現が可能となりました。細胞採取後、膜タンパク質は0.5%ラウリルマルトースネオペンチルグリコール(LMNG)に溶解され、膜タンパク質の溶解度を維持するのに適した非イオン性洗剤です。

溶解した分画はアンチFLAG M2樹脂を用いた親和性精製を受けました。樹脂は0.01% LMNGを含むバッファーで洗浄され、非特異的結合タンパク質を除去し、M207A TMEM120 0.001% LMNGを含むバッファーで溶出されました。洗脱は、試料収率に応じて分子量カットオフが30 kDaまたは100 kDaの遠心フィルターを用いて濃縮されました。さらにサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による精製が行われました。最後のSECステップは0.00015%のLMNGを含むバッファーで実施され、均一かつ安定したタンパク質調製と整合した単分散洗脱プロファイルを生成し、後の構造的および機能的解析に適しています(図2B)。

FLAGタグ付きTMEM120 M207Aの最適化および生物物理的特徴付けは 図2にまとめられています。発現と精製はSDS-PAGEによって確認され、約50 kDaの単一帯域が示されました。観察された移動は単量体の予想分子量をやや上回っており(図2A)、これは電気泳動前の非沸点試料の影響と考えられます。SECクロマトグラムでは、約150 kDaの見かけの分子量に相当する体積で、LMNG洗剤ミセル中のTMEM120A M207Aダイマーと一致する単一の対称ピークが溶出を示しました(図2B)。この洗脱挙動は均一で単一分散のタンパク質集団を示し、下流の生物物理学的特徴付けに適しています。

実験バッファー条件下でのLMNGの洗剤ミセル特性は質量フォトメトリーを用いて分析されました。タンパク質を含まない中でLMNG濃度を変えたSECバッファーで測定を行い、洗剤ミセルが透明分子量に寄与するかどうかを評価しました。LMNGが0.001%(w/v)、臨界ミセル濃度(CMC)を上回る濃度では、主要なピークは約69 kDaで検出され、これは関連するタンパク質を含まないLMNGミセル単独に相当します (図4A)。LMNG濃度がCMCを下回る0.0001%(w/v)に低下すると、主要種は~48 kDaにシフトし、タンパク質のないより小さな残留LMNG集合体または亜ミセラー集合体の存在を示しました(図4B)。さらに図4Cでは、M207A TMEM120A異なるLMNG濃度を含むSECバッファーで希釈され、質量フォトメトリーによってオリゴマー状態を評価しました。LMNGの0.00001%(CMCより約20倍下、マゼンタ)では、約42 kDaで支配的なピークが観察され、これはM207Aのモノマーに対応しTMEM120A。LMNGの0.00015%(CMCより約10倍低い青色)では、主集団が~86 kDaで二量体の存在を示しました。LMNG濃度を0.001%(オレンジ色のCMCより約2倍)に上げると、主要種~150 kDaとなり、タンパク質-洗剤複合体と一致しました。LMNGの0.002%(CMCより約4倍、緑)では、約180 kDaを中心とした広範な分布が検出され、より大きなミセル関連アセンブリや高次オリゴマーを表していました。これらの結果は、SECバッファー内のLMNG濃度がM207Aの透明なオリゴマー状態TMEM120A強く影響し、CMC下ではモノマー-二量体平衡が観察され、CMC上では洗剤-タンパク質複合体の形成が優勢であることを示しています。

主SECピークから採取され、SECバッファー内に保持されたTMEM120A M207Aの熱力学的安定性(25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% (w/v) LMNG、pH 7.8)は熱変性分析で評価されました。タンパク質は約46°Cで転折点を示し、これはこれらの洗剤溶解条件下での融点(Tm)に対応します。このTm 値は中程度の熱安定性を示しており、M207A TMEM120A LMNGミセル内で適切に折りたたまれた構造を保持しているものの、高温で展開または凝集が始まる可能性を示唆しています。

バイオレイヤー干渉計(BLI)は、M207A TMEM120A GsMTx4Tに対するμM結合親和性を示しています。 図5 の痕跡は5つの実験ステップを示しています:(1)ベースライン、(2)TMEM120A M207Aのサンプルロード、(3)非特異的結合および過剰TMEM120A M207Aの除去のためのベースライン、(4)結合、(5)解離。固定されたTMEM120A M207Aと相互作用するGsMTx4(0、5、10、20、30、50、100μM)の濃度増加に応じて波長シフト(nm)をプロットします。

初期の基準線(ステップ1)では信号が安定し、バッファ内のセンサー平衡が確認されました。M207Aの負荷(ステップ2)TMEM120A、センサー全体のプローブ飽和率が50〜80%に相当する特徴的な信号増加が生じました。負荷相は急激なプラトーではなくわずかに湾曲した応答を示し、部分質量輸送制限を反映している可能性があります。M207A TMEM120Aセンサー表面への拡散は結合速度より遅いです。これは膜や洗剤溶溶性タンパク質に共通する現象で、表面被覆に影響を与えることがあります。

次の基準段階(ステップ3)では、結合されていない、または緩く付着していたM207A TMEM120A実質的に除去されました。結合段階(ステップ4)では、GsMTx4濃度が増加すると、濃度依存的な波長シフトが明確に増加しました。解離(ステップ5)では、バイオセンサーをCMCより約10倍下の位置でLMNGを含むSECバッファーに置きました。解離の最初の5〜10秒は、GsMTx4が容易にアクセスできる部位からの急速な放出を示し、その後、より安定したTMEM120A M207A-GsMTx4複合体がゆっくりとした解離動態を示す可能性のある緩やかな崩壊が見られました。実験中、基準プローブ信号は平坦なままで、非特異的結合が最小限であることを示しました。全体として、これらのデータは特定のTMEM120A M207A-GsMTx4相互作用を示しています。しかし、観察された動力学は洗剤環境や潜在的な質量輸送効果を考慮すると慎重に解釈する必要があります。

参照プローブの減算後の処理データの関連および解離センサーグラム(図6A)では、GsMTx4の濃度依存応答が5〜100μMの範囲で示されました。リガンド濃度の増加は波長シフトを徐々に高め、その後200秒の解離フェーズで徐々に減少しました。10μMデータセットは5μMトレースとの重複によりフィッティングから除外され、全体のモデル品質が向上しました。

キネティック解析は、局所的なフルフィッティング戦略を用いた1:1ラングミュア関連-解離モデルを用いて行われ、個々の分析物濃度を共有の動態的枠組み内で独立にフィットさせました(図6B)。フィットした曲線(赤)は実験のトレースと良好に一致し、低微小モル範囲の推定解離定数(KD)を得ました。残差解析(図6C)では大きな系統的偏差は見られず、適用されたモデルがデータセットに適していることが示されました。初期の結合期で観察されたわずかな違いは、質量輸送の制限や洗剤ミセル環境の影響を反映している可能性があります。複数のアッセイ複製およびプローブ位置におけるフィッティングされた結合曲線および解離曲線、残差プロット、フィッティング統計量の追加例は 補足図S8に示されています。

生データ(図5)では、解離の最初の5〜10秒で急速なシグナル低下が見られ、これは容易にアクセスできる部位からのGsMTx4の急速放出を示し、その後、より安定したM207A-GsMTx4複合体TMEM120Aゆっくりとした解離動力学を反映している可能性があります。したがって、 表2では最初の100回の解離はフィッティングから除外されました。系統的な偏差がないことは、すべての試験濃度において局所的な完全フィットLangmuir 1:1モデルTMEM120A良好に適合していることを示しています(図7)。

GsMTx4がM207A TMEM120A結合する動態解析で、5〜100μMリガンドの範囲で濃度依存的な関連および解離挙動が示されました(表1)。観察された関連率定数(kオン)はGsMTx4濃度の上昇とともにわずかに増加し、約1.0×10⁻⁶から3.2 × 10-6 1/M·sまで幅を伸ばしました。一方、推定解離率定数(kオフ)は実験誤差内でほぼゼロにとどまり、試験条件下で解離相が遅いか無視できる程度であることを示唆しました。計算された平衡解離定数(Kd)は低〜中マイクロモル範囲(~0.8〜3.3 μM)であり、中程度の親和性相互作用と一致しました。ラングミュア1:1結合モデルを用いた局所フルフィッティングでは、すべてのGsMTx4濃度で高品質な適合が得られ、相関係相および解離相の両方で相関係係数が0.99を超え、相対χ2 値が低いことが示されました(表1)。計算された平衡解離定数は濃度や複製に間違って一貫しており、KD 値は低微小モル範囲(~1〜2 μM)で、M207AとGsMTx4間の中程度ながら特異的な結合TMEM120A示していました。

各濃度の再現データセットは、結合フィットおよび解離フィットの両方で高い相関係数(R² > 0.99)を示し、再現性を示しました。全χ²値と相対的なχ²値は低く、複製間で比較可能であり、分析で適用された1:1ラングミュア結合モデルの堅牢性をさらに支持しました。より高い配位子濃度(≥50 μM)では、kon およびKD の値がわずかに増加し、これは真の親和性変化ではなく、軽微な質量輸送効果や局所的な表面異質性を反映している可能性があります。複数複製およびプローブ位置における動態的一貫性は補 足図S9でさらに示されています。

この動態プロファイルは、GsMTx4がTMEM120A M207Aと特異的かつ安定的に相互作用し、比較的安定した複合体を形成し、ゆっくりとした解離と微小臼歯結合親和性を特徴としていることを示しています。

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図1:HEK293SF-17懸濁セルで発現したTMEM120A M207A変異体の精製ワークフロー。 タンパク質精製手順の概説。TMEM120A M207AはpCDNA3.1プラスミドからHEK293SF-17細胞から発現されました。細胞は0.5% LMNGで溶解され、その後抗FLAG M2樹脂を用いた親和性精製が行われました。樹脂は0.01% LMNGを含むバッファーで洗浄され、非特異的結合タンパク質を除去しました。TMEM120A M207Aは0.001% LMNGを含むバッファーで溶出されました。エリュートは100 kDaまたは30 kDaの分子量カットオフフィルターを用いて濃縮され、0.00015% LMNGを含むバッファー内でサイズ除外クロマトグラフィーでさらに精製されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:LMNG洗剤(A)におけるFLAGタグ付きTMEM120A M207Aのサイズ除外クロマトグラフィーおよびSDS PAGE(サイズ除外クロマトグラフィーで精製された)における精製TMEM120A M207AのSDS-PAGE。タンパク質バンドはレーン1で~50 kDaの位置に現れ、期待されるモノマーに対応します。(B) SECバッファ内のSECカラム(25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% LMNG、pH 7.8)における精製済みTMEM120A M207AのSECプロファイル。タンパク質の洗脱は、下流の生物物理学的アッセイに適した優勢な単分散種を示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:LMNG中の精製TMEM120A M207Aの差分走査蛍光測定。 DSFは46°Cで熱力学的な曲折点を示し、試験されたバッファー条件下でのタンパク質の熱安定性を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:質量光度法を用いたLMNG洗剤中の精製TMEM120A M207Aの特徴付け。 (A,B)異なるLMNG濃度を持つSECバッファーの質量光度測定。LMNGが0.001%(臨界ミセル濃度CMCを上回る)では、見かけ分子量は~69 kDaで、主にLMNGミセルに対応します。LMNGの0.0001%(CMCの10倍)では、ピークは~48 kDaで現れます。(C) LMNG濃度依存性によるTMEM120Aオリゴマー化への影響の質量光度解析。0.00001%のLMNG(CMCより約20倍低いマゼンタ)のTMEM120Aは、主な集団が約42 kDa(モノマー)で現れます。0.00015%のLMNG(CMCより約10倍下、青色)では、約86 kDaの個体群が観察され、これは二量体と一致しています。0.001%のLMNG(オレンジ色のCMCより~2倍)では、主要種が約150 kDaのタンパク質-洗剤複合体に対応します。0.002%のLMNG(CMCより~4倍の緑色)では、約180 kDaを中心とした広範な分布は、より大きなミセル関連アセンブリまたは高次のオリゴマーを示します。これらの結果は、LMNG濃度がTMEM120Aの見かけのオリゴマー状態に強く影響を与え、CMCより下ではモノマー-二量体平衡が観察され、CMC上ではタンパク質-洗剤複合体の形成が優勢であることが示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5:ソフトウェアからの生データで、M207A-GsMTx4の相互作用TMEM120Aを示します。 バイオレイヤー干渉計は、TMEM120A(M207A)が機械感受性チャネル阻害剤GsMTx4に微小モル親和性で結合していることを示しています。図はGator Primeソフトウェアから得られた生のBLI応答データを示し、5つの主要なアッセイフェーズを示しています:(1) 初期ベースラインで、信号が安定していた;(2) タンパク質の固定(負荷)、波長シフトが約1.5 nm増加すること;(3) 第二基準線で、結合していないまたは緩く結合したタンパク質の除去を可能にします。(4) 結合相(リガンド結合)、GsMTx4濃度の増加により300秒以内に~5.5 nmまでの応答上昇が起こる;および(5) 解離相(リガンド放出)、600秒にわたる徐々の信号減衰を示す。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図6:TMEM120A M207AとGsMTx4ペプチドの結合速度論。 (A) 5 μM、20 μM、30 μM、50 μM、100 μMの5濃度でのTMEM120A M207Aの結合および解離センサーグラム。10μMデータセットは5μM曲線との重複によりフィッティングから除外され、全体のモデル適合度が向上しました。縦の赤い線は解離フェーズの開始と終了を示します。(B) センサーグラムのフィッティングは、局所フルフィッティング・ラングミュア1:1の連合-解離モデルを用いて実施されました。赤い曲線は適合モデルを表し、実験トレースは各GsMTx4濃度(各条件に2回の重複)の関連および解離データに対応します。(C) 結合フェーズおよび解離フェーズの両方で、実験データとフィットモデルの偏差を示す残差プロットで、適合度の良好性を確認する。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図7:フィッティング結合曲線に対応する残差プロット。 各プロットは、単一のGsMTx4濃度(5 μM、20 μM、30 μM、50 μM、100 μM)に対する残差(実験データとフィットモデルの差)を表しています。残差はシフト偏差(nm)と時間(s)で表示され、結合相と解離相の両方でほぼゼロ付近のランダム分布を示します。系統的な偏差がないことは、すべての試験濃度において局所フルフィッティング・ラングミュア1:1モデルが良好に適合していることTMEM120A示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:M207A TMEM120A GsMTx4への結合の動力学パラメータの概要。ラングミュア1:1結合モデルを用いた局所フルフィッティングからキネティックパラメータが得られました。各GsMTx4濃度および複製について、結合(kオン)、解離(kオフ)、観察速度定数(kobs)、平衡解離定数(KD)が報告されます。フィットの質は、完全相、連合相、解離相のR²およびχ²値を用いて評価されました。すべての濃度において、フィットは高い相関係数(R² > 0.99)と低い相対χ²値を示し、信頼性の高いモデル性能を示しました。注記:M Conc. は GsMTx4(μM)の濃度を示します。KOBSは、結合過程と解離過程を反映した観測された速度定数を表します。kobs、kオン、kオフの誤差は適合不確実性を反映しています。R²値は、完全相、連合相、解離相における適合度を示します。相対χ²値は正規化された適合度の良さ指標を表し、絶対χ²値は観測データとフィットデータ間の残差を示します。略語:kon = 関連率定数(1/M·s);koff、= 解離速度定数(1/s);kobs = 観測された速度定数(1/s);KD = 平衡解離定数;Rmax = 最大応答;Req = 平衡応答。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:処理パラメータおよび動力学フィッティングの残差。 処理パラメータ:アソシエーション開始時間0秒;アソシエーションエンド、300南;解離開始、100秒;解離終了、300秒。最小R²値、0.9;最大χ²の値は8。アライメントステップ:1ステップの端(インデックス=1、平均=0)。連合段階ではステップ間補正が適用されました。協会平均50点、解離平均は0。サヴィツキー・ゴレイ平滑化は無効化されました。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図S1:GsMTx4ペプチドの濃度(100 nM)をアンチFLAGプローブに異なる濃度TMEM120A M207Aタンパク質を負荷する最適化実験。 (A) 動力学測定の5つのステップを示す生のBLIセンサーグラム:(1) SECバッファーまたはアッセイバッファー内の基準値(25 mM HEPES、pH 7.8; 200 mM NaCl; 0.00015% (w/v) LMNG; 0.0005% (v/v) Tween-20);(2) 4種類の異なるTMEM120A濃度のM207AをFLAGプローブに搭載し、参照プローブ(オレンジ)をネガティブコントロールとして使用し、非特異的結合の欠如を確認する;(3) セカンドベースラインステップ;(4) 連想期、(5) 解離期。(B) 100 nM GsMTx4ペプチドと相互作用する4 TMEM120A M207A濃度に適合するグローバル1:1結合モデル。(C) 結合相および解離相の両方の残留プロットで、適合モデルからの最小の偏差(<0.05 nm)を示す。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図S2:プレートのセットアップおよびアッセイ構成。 (A) 異なるパラメータを割り当てられる384ウェルプレートのプレート設計。サンプルは異なる濃度の配位子(GsMTx4)に対応します。オレンジウェルは250 nM TMEM120 M207A タンパク質を示しています。ウェルは250 nMのタンパク質複製を表し、同じバッファーがベースライン、結合、解離ステップに使用されました。(B) Max Plateビューで4つのアンチFLAGバイオセンサープローブが表示:1つは参照プローブ、3つはタンパク質複製用プローブ。すべてのプローブはアッセイバッファで事前に湿らせ、Qバッファで再生され、アッセイバッファで中和されました。同じバッファーはベースライン、連想、解離の各ステップで使用されました。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図 S3:アッセイセットアップサイクル(ベースライン、タンパク質ローディング、セカンドベースライン、結合、解離を含む)。 略語:B = バッファ;L = 荷重;0、5、10、20、30、50、100 = μM単位のGsMTx4濃度。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図S4:新しい動力学(K)解析ワークフロー。 「 実験 」アイコンを選択すると、単一の実験内で行われたすべてのアッセイの概要が表示されます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図S6:新しい運動学(K)解析ワークフロー。「参照アイコンを設定し 」:背景引き算と正確なデータ解釈のための適切な参照センサーを選択するために使われます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図S7:運動解析ワークフローにおける結合フィッティングステップ。 結合相互作用データの解析に用いられるキネティックフィッティングパラメータ設定。このモデルは単一のリガンド結合部位との1:1の相互作用を仮定しています。フィッティングタイプはローカルに設定されており、各濃度曲線をグローバルではなく独立してフィッティングします。Full Stitchを有効にしたフルフィッティングオプションには、連続的な連合曲線と解離曲線全体が含まれます。連想フェーズと解離フェーズのタイムウィンドウは、それぞれ0秒から300秒、0秒から200秒に設定されています。背景には、結合フィッティンググラフ、残差グラフ、個別のアッセイ曲線がフィット品質と実験的変動を示しています。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図S8:動力解析ワークフローにおける結合フィッティングステップ。複数のアッセイ複製およびプローブ位置(C1およびD1)における結合相および解離相を示す結合フィッティンググラフ。下の残差グラフは適合度の評価であり、残差は実験データと適合モデルの差を示しています。ゼロに近い値は良い適合を反映します。付随する表は、各レプリケートごとに完全なR²、アソシエーションR²、解離R²、カイ二乗(X²)値を含むフィッティング統計量をまとめています。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図S9:運動解析ワークフローにおける結合フィッティングステップ。複数複製およびプローブ位置(C1およびD1)からの結合相互作用の動態解析。センサー応答シフト(nm)は時間経過とともに、結合位相と解離位相を示し、それぞれの曲線はアッセイとプローブの位置で色分けされています。縦の赤い線は、結合(0-300秒)と解離フェーズの移行を示しています。以下の表は、1:1結合モデル適合から導かれた運動学的パラメータを報告しており、分析物濃度(Mコンク)、結合率定数(kオン)、解離率定数(kオフ)、誤差、平衡解離定数(KD)を含みます。一貫したフィット品質が運動測定の堅牢性を支えています。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足表S1:384ウェルプレートとマックスプレートの両方で使用されている記号を示す表。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足表S2: 固定konおよびkoff値を用いて、FLAGバイオセンサーに搭載された4 TMEM120A濃度のM207Aの4濃度の動態パラメータを100 nM GsMTx4ペプチドと相互作用させました。この ファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

膜タンパク質相互作用の特性評価は、綿密なタンパク質精製、洗剤濃度の慎重な最適化、精密なアッセイ設計の必要性から依然として困難です。本研究は、M207A TMEM120A詳細なワークフローを示し、GsMTx4を用いたバイオレイヤー干渉計(BLI)を用いた精製およびキネティック解析の両方を示しています。

重要なステップと最適化:
重要なステップの一つが洗剤濃度であり、これはタンパク質の安定性を左右する主要な要因と特定されました。精製プロセスは、0.5% LMNGを含むバッファーによる細胞溶解、その後0.005% LMNGでの逐次洗浄、0.001% LMNGでの洗脱、そして0.00015% LMNGを含むバッファー内での最終サイズ除外クロマトグラフィー(SEC)を行っていました。この洗剤戦略は、LMNGの低臨界ミセル濃度(CMC)とスローオフレートに基づくもので、精製時のミセル中のタンパク質の安定性を向上させました。SECバッファーにはLMNGのCMCの10倍(0.001%)の濃度で洗剤が含まれており、下流の生物物理学的アッセイへの影響を効果的に最小限に抑えています。質量分析および熱安定性解析を用いて、タンパク質の均一性と凝集の欠如が確認されました。図2、図3、図4は、CMC未満の洗剤濃度における精製およびタンパク質安定化の成功した最適化を示しています。

バイオセンサー上のタンパク質固定化は、プローブ飽和度を50〜80%に抑えるよう厳密に管理されました。荷重レベルが50〜80%になると、ある程度の質量輸送の制限が生じる可能性があります。この範囲は、アッセイ中にプローブがウェル間を移動するBLIシステムで十分な信号強度を提供するために選ばれました。このレベルのリガンド非モビリティを達成することで、信号品質の一貫性を維持できたが、この負荷レベルには利点と潜在的な制約の両方がある。基準プローブの導入はBLI実験において極めて重要でした。

追加の対照実験では、4つの異なる固定TMEM120Aレベルを単一のペプチド濃度(100 nM)で試験しました。これらのデータは改訂版原稿(補足図S1)に含まれています。固定タンパク質の量を増やすことで負荷信号は高まりましたが、いずれの場合もシフトはベースラインから1 nm未満のままでした(補足図S1A)。フィットした関連曲線と解離曲線は、グローバルな1:1結合モデルを用いて報告し、適合データと実験データの間に小さな非有意差を示す残差プロットも含めました。

主なキネティックアッセイ(5-100μM分析対象)では、適合したレート定数が濃度依存の傾向を示しました。kオフの値はおよそ1.48×10⁻⁴から1.43×10⁻³s⁻¹まで幅があり、kオン値は1.12×10²から1.26×10¹ M⁻¹⁻¹まで幅がありました。濃度系列にわたるこれらの徐々の変化は、正常な分析物依存性の連合および解離行動と一致しています。

対照実験では、異なるプローブ負荷レベルを単一の分析物濃度(100 nM)で試験し、4つの痕跡すべてが非常に似た運動定数を示しました。kオフ値はすべての荷重レベルで一貫して1.42×10⁻¹ s⁻¹、kオン値は10³ M⁻¹ × 2.76 でした。この変異の欠如は、結合相や解離相がプローブ密度、質量輸送制限、分析物再結合の影響を受けなかったことを示唆しています。

対照実験では100 nMでの解離がより速く見られることも期待されます。100 nMの分析物濃度はKDより約1桁低く、KDよりかなり低い濃度では錯体は不安定になり、有効占有率も低くなります。このような条件下では、低分析物濃度では結合親和性が弱くなり、解離相中の再結合が最小限であるため、解離はより速く進みます。この挙動は、分析物濃度がKDよりかなり低い場合に通常観察される現象と一致します。

総合的に見ると、プローブ負荷間の運動学パラメータの一貫性と低分析物濃度での期待される挙動は、観測される速度定数が表面荷重や質量輸送効果による偽物ではなく、本物の結合特性を反映しているという考えを支持しています。

結合力の動力学と解釈:
キネティック解析は、局所的なフルフィッティング戦略を用いた1:1ラングミュア関連-解離モデルを用いて行われ、個々の分析物濃度を共有の動態的枠組み内で独立にフィットさせました(図6B)。このアプローチは、特に低リガンド濃度のデータセットで、質量輸送制限や洗剤ミセルによるタンパク質拡散への影響によるわずかな重複や初期段階の偏差が見られたため、従来のグローバルフィッティングよりも選ばれました。グローバルフィッティングは、すべての痕跡が厳密に同じ運動的挙動に従うことを前提としており、表面のアクセス性や局所的な微小環境が濃度間でわずかに異なる場合、その挙動は損なわれることがあります。局所的なフルフィッティングにより、各分析物濃度を独立してモデル化しつつ、一貫した動力学的枠組みを維持し、導出パラメータが各濃度の挙動を正確に反映することを保証しました。フィットした曲線(赤)は実験の痕跡とほぼ一致し、低微モル範囲の推定解離定数(KD)を得ました。残留解析(図6C)では大きな系統的逸脱は見られず、これらの洗剤溶解膜タンパク質相互作用に対するモデルの適性を支持しました。

TMEM120A M207AおよびGsMTx4では、低微小モル範囲(約0.8〜3.3μM)のKD 値が見られました。結合速度(kオン)は配位子濃度とともにわずかに増加した一方で、解離速度(kオフ)は非常に遅く、安定した複合体形成を示しました。解離の最初の5〜10秒間の初期の急速なシグナル減衰は、容易にアクセスできる結合部位を反映したと考えられる一方、遅い相はより安定した相互作用を示していた(図6A)。これらの観察は、洗剤可溶性膜タンパク質を解析する際に解離ウィンドウを慎重に選び、質量輸送の限界を考慮する重要性を強調しています(表2)。

制限とトラブルシューティング:
TMEM120A M207Aのような洗剤溶解膜タンパク質については、いくつかの制限を考慮する必要があります。質量輸送効果は、結合初期段階で起こり得ます。タンパク質がバイオセンサー表面にゆっくりと拡散し、運動学的測定がわずかに歪むことがあります。プローブの飽和度が推奨される50〜80%の範囲を超えるとセンサー過負荷が発生し、グローバルな運動解析の精度が制限され、konおよびkoff値に影響が出る可能性があります。洗剤依存性の影響は、特にCMCより上または近い濃度では、タンパク質の安定性、オリゴマー状態、または表面アクセスに影響を与える可能性があります。その他の要因としては、軽度のベースラインドリフト、非特異的結合、非常にゆっくりとした解離の動力学の捉え方の困難があります。

これらの問題の多くは、タンパク質の負荷を減らして過飽和を防ぐこと、バッファー組成の最適化、基準値ドリフトや非特異的シグナルを補正するためのリファレンスプローブの追加など、簡単な調整で緩和できます。本研究では、0.00015%のLMNGを含むSECバッファーと低濃度のTween-20が、タンパク質の安定性を維持しつつ非特異的結合を効果的に最小限に抑えました。運動学的フィッティングのための解離ウィンドウを慎重に選び、レプリケート測定や残差解析を行うことも、運動学パラメータの信頼性を確認する上で重要でした。これらの戦略は一般的に再現性を高め、より堅牢で解釈可能なデータの生成に役立ちます。個々のリガンド濃度における微細な痕跡の違いを考慮し、グローバルフィッティングの代わりに局所完全フィッティングが用いられ、各データセットの挙動を正確に反映する動力学パラメータを確保しました。

今後の方向性:
このワークフローは、他の膜タンパク質、タンパク質-脂質相互作用、または小分子調節因子のスクリーニング研究へと拡張可能です。BLIを質量光度測定、構造特性評価、クライオEMなどの直交的アプローチと組み合わせることで、オリゴマー化、化学量論、結合機構についてより詳細な洞察が得られる可能性があります。さらに最適化することで、より天然に近い脂質環境における高親和性配位子、多価相互作用、または複合体の解析も可能になるかもしれません。

結論として、タンパク質の固定化、洗剤濃度、バッファー条件の綿密な制御により、BLIはM207Aおよび同様の難関膜タンパク質に対して信頼性が高く再現性の高い動態データを生成TMEM120A。本質的な限界はありますが、この手法は明確に定義された実験条件下で特定の中程度親和性のタンパク質-リガンド相互作用を研究するための堅牢なプラットフォームを提供します。

開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

メルボルン大学の研究プラットフォームであるメルボルンタンパク質特性評価(MPC)施設のタンパク質精製と特性評価の支援に心より感謝申し上げます。この研究は、国立保健医療研究評議会(NHMRC)のアイデア助成金(2020/GNT2000934年にI.R.へ)およびオーストラリア研究評議会(産業変革訓練センター、IC200100052からI.R.およびM.M.へ)によって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
384ウェル黒マイクロプレートGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra遠心フィルター、30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008精製
Anti-FLAGプローブGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルSigma-AldrichA2220-10ML精製
BioRenderBioRenderhttps://biorender.com図1作成 
ウシ血清アルブミンSigma-Aldrich9048-46-8質量フォトメトリ
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019細胞培養
遠心機 5920 R: 大容量および高性能EppendorfNA精製
cOmplete, Mini, EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルMerck11836170001精製
ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼ ISigma-Aldrich9003-98-9精製
ExpiFectamine 293トランスフェクションキットThermofisherA14524トランスフェクション
Gator Bio ソフトウェアGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAXサプリメントThermofisher35050061細胞培養
GsMTx4 トリフルオロ酢酸塩Sigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17細胞（懸濁培養に適応）ATCCATCC CRL11268細胞培養
LMNG（ラウリルマルトースネオペンチルグリコール）ThermofisherA50940精製
Max PlateGator Bio130062BLI
フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）Sigma-Aldrich11359061001精製
Prometheus 高感度キャピラリーNano TemperPR-C006熱力学的安定性
Prometheus PantaNano TemperNA熱力学的安定性
Qバッファー（0.3% グリシン pH 3.8）Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 ソニケーター超音波細胞破砕器QsonicaNA精製
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44精製
合成されたTMEM120A（M207A）遺伝子をFLAG-3Cリンカー付きpCDNA 3.1プラスミドにクローニングGenScript BiotechNAプラスミド
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNA質量フォトメトリ

参考文献

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