うつ病およびパーキンソン病のマウスモデルにおける腹内側前頭前野の覚醒電気生理学的プロファイリング

サマリー

パーキンソン病(PD)様マウスモデルを用いて、背側広鎖核(DR)における変異型のヒトαシヌクレイン(h-α-Syn)を過剰発現させ、PDのうつ・不安障害における腹内側前頭前野(vmPFC)-DR回路の役割を調査する電気生理学的記録法を開発しました。

要約

パーキンソン病(PD)は主に運動障害として知られていますが、運動障害よりも先に非運動症状が現れ、病気の進行に大きな影響を与え、あらゆる病期で重要です。その中で、うつ病や不安症が最も多く、女性の方が男性よりも症状負担が高いです。セロトニン作動性(5-HT)系の変化は気分障害と頻繁に関連しており、パーキンソン病(PD)およびうつ病患者の5-HT閉鎖核(RN)にα-シヌクレイン(α-Syn)の蓄積が観察されています。したがって、これらの非運動症状の背後にある神経回路を理解することが極めて重要です。

ここでは、PD関連気分障害における腹内側前頭前野(vmPFC)-背側裂孔核(DR)回路の役割を、変異したヒトαシン(h-α-Syn)を過剰発現したメスマウスモデルを用いて調査する改良プロトコルを提示します。本手法により、基礎条件および嫌悪条件付け・消滅時の両方において、下皮質(IL)および前辺縁皮質(PL)の神経活動を高解像度で評価できます。覚醒した頭部固定マウスを対象にトーンライト感覚条件付けパラダイムを用い、多チャネル電気生理プローブを用いて神経反応を記録します。実験はバーチャルリアリティの通路で行われ、円筒形のトレッドミルとデュアルスクリーンの視覚表示を組み合わせて行動の関与を維持しつつ、感覚刺激の正確な制御と安定性の記録を確保しました。

このプロトコルは、IL皮質とPL皮質が恐怖条件付けと消滅に関与していることを基盤とし、PDにおけるうつ病や不安様行動に関与する回路における動的な神経活動を検証するための堅牢な枠組みを提供します。制御された条件下で同時行動および電気生理学的測定を可能にすることで、このアプローチはパーキンソン病における非運動症状の神経生物学的メカニズムを解明し、介入の可能性を検証するための強力なツールを提供します。

概要

パーキンソン病(PD)は運動障害ですが、運動症状に先立ち、すべての病期1、^2、3、⁴で重要な非運動症状が現れることが知られています。これらの中でも、うつ病と不安症は最も一般的な神経精神症状であり、パーキンソン病患者の生活の質に深刻な影響を与え、女性の方^{が男性よりも}症状負担が高いとされています5。それにもかかわらず、彼らはしばしば過小診断され、^{十分な治療を受け}ていません。これらすべての理由から、患者を階層化し、より個別化されたケアを提供するためには、パーキンソン病の神経精神症状に関与する神経生物学と回路を理解することが不可欠です。

パーキンソン病の病因は部分的に不明ですが、いくつかの重要な神経病理学的特徴が特定されています。この疾患は、黒質線条体系におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンおよび線維の進行性変性と喪失を特徴とし、PD ^7,8に関連する典型的な運動障害を引き起こします。PDのもう一つの特徴は、主にα-シヌクレイン(α-Syn^)9,10から構成されるルビー小体(LB)および線維性タンパク質集合体によって形成される細胞内包有物の存在です。神経画像検査では、DA関与前から他の神経伝達物質システムも影響を受けていることが明らかになっています。その中には、セロトニン作動性(5-HT)システム11,12,13があります。セロトニン作動性(5-HT)系の変化は気分障害と一般的に関連しており、パーキンソン病(PD)およびうつ病と診断された個人の5-HT閉鎖核(RN)にα-シヌクレイン(α-Syn)の沈着が検出されています¹⁴。

背側鎖骨核(DR)は^RN15で最大の5-HT核であり、感情調節、知覚、報酬、攻撃性、社会的相互作用において重要な役割を果たしています。したがって、DRの機能障害はストレス、不安、うつ病などの神経精神疾患と関連しています^15,16。この時点で、DRと前頭前野(PFC)との間にある強力で双方向の機能的かつ解剖学的なつながりを強調することが重要です。PFCは高次の脳機能に不可欠な脳領域です。PFCのより背側側の領域は認知機能に関連していますが、より腹側内側の領域(vmPFC)は感情調節、行動制御、記憶、意思決定において基本的な役割を果たします(^17,18)。したがって、vmPFCとDRは共に気分に有意な影響を与え、この回路の活動の変化はうつ症状と関連しています¹⁸。さらに、RNの5-HTニューロンに集まったα-Synの蓄積は、不安やうつ様表現型を誘発することが示されています 19,20,21。

うつ病表現型を持つPDメスマウスモデルを用いて、変異したA53T型のヒトαシン(h-α-Syn)をアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを介して過剰発現させるPDメスマウスモデルを用いて、電気生理学的記録法を開発しました。この方法は、PDにおけるうつ/不安障害におけるvmPFC-DR回路の役割を調査することを目的としています。このアプローチは、覚醒マウスにおける下皮質(IL)および前辺縁皮質(PL)の神経活動を単一単位および局所フィールド電位(LFP)記録を通じて評価するものです。これはマルチチャネルプローブとバーチャルリアリティランナーを組み合わせて実現されます。嫌悪条件付けにおけるプルプル(PL)および内層皮質(IL)の関与を認識し、ストレス状況下での機能を評価するために、これらの活動も測定します。PLは主に条件反射を駆動し、IL皮質がこれらの反応の消滅に重要な役割を果たしていることを理解することが重要です(^22,23)。

以下のプロトコルは、ヘッドバーを埋め込み、 生体内でPLおよびIL皮質の電気活動を鋭く記録するための手順を説明しています。これは、頭部固定マウス用の円筒形トレッドミルとダブルスクリーンの視覚表示を組み合わせたバーチャルリアリティ回廊を用いて実現しています。プロトコルは主に4つの段階に構成されています:(1) ヘッドバーインプラント手術、(2) 習慣化、(3) 記録および信号取得、(4) データ解析:スパイクソーティングとデータ前処理。

脳の5-HT系でh-α-Synの過剰発現を誘導してから3週間後、マウスはヘッドバーインプラント手術を受け、その後の頭部固定が可能になります。1週間の回復期間の後、マウスは実験者とトレッドミルおよび頭部固定システムの両方に4日間慣れます。記録日には、このセットアップを基線条件下および嫌悪条件付け時にPLおよびIL皮質の神経活動を記録するために用いられます。生の神経データはKilosort4による自動スパイクソートを経て処理され、その後Phy2で手動でキュレーションされて、高品質な単一ユニットクラスタを抽出し、さらなる解析を行います(図1)。

提案されている覚醒状態で頭部固定型の多チャンネルvmPFC記録プロトコルは、麻酔下や体外準備、自由に動く動物でのワイヤレス記録などの従来の代替手段と比べていくつかの利点があります。麻酔や体外アプローチとは異なり、この方法は仮想現実環境内で制御された視覚および聴覚刺激の下でvmPFCの活動を評価することを可能にします。これは嫌悪的条件付けパラ^ダイムの実装に^{不可欠です。}自由に動く録音とは異なり、ヘッド固定配置は感覚入力や課題の条件を正確に制御し、変動を減らし、一貫した試験構造を可能にします。さらに、ヘッドフィクセーションは、特に嫌悪刺激下で自由に動くパラダイムで観察されるタスク離脱のリスクを低減しつつ、高収量で安定したマルチチャンネル記録を可能にします²⁶。

実務的な観点から見ると、このプロトコルは動物がヘッドフィクセーションとトレッドミルランニングに慣れることを必要としますが、市販の比較的手頃な価格の円筒形トレッドミルを用いたヘッドフィクションシステムの恩恵を受けています。これにより、プローブは複数回(最大~10回まで)再利用できるため、慢性的に自由に動くインプラントに比べてコストを大幅に削減できるため、小規模な研究室でもこのアプローチが利用可能となります。したがって、この方法は実験的な管理、行動の関連性、コスト効率のバランスを提供します。もう一つ考慮すべき要素は、嫌悪的条件付けパラダイムの実装です。本研究では、齧歯類の自然な光嫌悪感に基づく実験デザインを用い、10回の聴覚トーン(条件付き刺激)にそれぞれ短時間強い光(無条件刺激)を浴びさせました。このパターンは電気ショックを含む他の古典的条件付け法よりもストレスが少ないものの、より似た現実世界のストレス源となります。

プロトコル

すべての実験は年齢に応じた対照群で行われ、動物処置も3Rの規則に従って設計されました。EU指令2010/63(2010年9月22日)、スペイン法(RD 1201/2005、L.32/2007、L.6/2013)に記載された倫理指針に従い実施され、バレンシアナ自治政府(ES462500001003、参照番号2023-VSC-PA-0073)およびバレンシア大学の現地生命倫理委員会(参照A20230214153605)によって承認されました。

注意:安全を確保し汚染防止のため、処置中は使い捨て手袋やブーティー、白衣、マスク、ヘアネットなどの個人用防護具を着用してください。獣医用医薬品の回収システムは、地域の規制および適用される全国的な回収プログラムに従い、使用による残留物の処理に使用してください。

1. マウスモデル生成

注:成体の雌のC57BL/6Jマウス(生後9週)は、制御された環境条件(22±1°C、12時間の明暗サイクル)で飼育され、自由に餌と水を得られました。

1. マウス麻酔室でイソフルラン麻酔(誘導時4%、維持時2%)下で、マウスをランダムにDRに立体微注射(ブレグマ相対座標:前後方[AP] −4.5 mm、中外側[ML] −1.0 mm、背腹側[DV] −3.2 mm、注射角度:20°)を自動マイクロインジェクターで割り当て、流量0.4 μL/minで投与します。 前述の^{通り19、27、28}。
2. 各マウスに、組換えアデノ関連ウイルス血清型1/2(AAV1/2;濃度:5.16 ×^{10 12} gp/mL)のいずれかを総体積0.6 μLを受け取り、これはヒトh-α-Synの5-HTニューロン(n=4)の過剰発現を誘導するため、または非コード寄生DNAを含む空のAAV1/2ベクター(AAV-EV)のいずれかを摂取してください。 対照群として使用されます(n=5)。
3. 逆流を防ぐために、針をさらに8分間そのままにしてから、320〜400μm/分の速度でゆっくりと抜きます。
   注意:安全のため、立体走位手術(セクション1および2)前に、麻酔蒸気を適切に捕捉するためにスカベンジングシステムが正常に機能していることを確認してください。ベイパライザーを補充中にイソフルランがこぼれた場合は、すぐにおがくずなどの不活性で吸収性の高い素材で清掃してください。イソフルランフィルターおよび使用に起因する残留物の処分には、獣医用医薬品の回収システムを使用してください。地域の規制に従いましょう。

2. ヘッドバーインプラント手術

注意:マウスモデル作成後3週間後、以下の手順に従ってヘッドバーインプラント手術を行います。

1. 術前準備と麻酔
   1. イソフルラン(誘導時は4%、維持時は1.5〜2%)で動物に麻酔をかけ、イソフルラン蒸気器で投与します。
   2. マウスを立体誘導装置の温熱パッドに置き、処置中は体温を保ちます。
   3. マウスの口を優しく開けて歯をバイトバーに置き、立体誘導装置に接続されたマスクを装着することで、麻酔維持のための継続的なイソフルラン投与を確保します。
   4. 眼潰瘍を防ぐために点眼薬を塗布しましょう。
   5. メス切開の少なくとも10分前に、生理食塩水で5 mg/kgのブトルファノールを皮下注射して鎮痛を投与してください。
   6. 耳のバーによる不快感を軽減するために、局所リドカイン(両耳に0.03 mL、4 mg/kg、最大用量は7 mg/kgまたはリドカイン/プリロカインクリーム[リドカイン25 mg/gおよびプリロカイン25 mg/g]を超えないように)を塗布します。
2. 立体定位と頭蓋骨の準備
   1. 耳棒を頭をしっかりと固定し、左右対称性と最小限の動きを確保します。
   2. 切歯バーを調整してブレグマとラムダを同じ水平レベルにし、中間線に合わせます。
   3. ペダルの引き込みの喪失、触肢反射、呼吸数の低下、ひげの動きの欠如を確認して麻酔誘発を確認します。
   4. マウスがステレオタキシックフレーム内で正しく位置し、イヤーバーも慎重に調整してください。
   5. 手術部位を剃り、消毒液(ポビドンヨウ素の後に70%エタノールを加えた)で消毒し、感染リスクを最小限に抑えます。
   6. 頭皮の中央に切開し、止血を維持しつつ頭蓋骨を露出させるために下の組織を優しく引き戻します。皮膚が十分に開かれて頭頂側頭隆起が見えるようにしてください。これを実現するために、皮膚下の筋膜に細かいブルドッグクランプを4つ当てて、露出を最大化します。
   7. 露出した頭蓋骨をきれいにし、徹底的に乾燥させて、解剖学的なランドマーク(ブレグマとラムダ)をはっきりと見ることができます。
   8. ブレグマとラムダを同じ水平面に合わせることで、頭蓋骨を前後軸で水平にします。
   9. 頭蓋骨の内側軸を水平にし、両頭頂側頭隆起の深さに合わせて調整します。
3. ドリルとインプラントの埋め込み
   1. 座標AP: +1.75のvmPFC上方に直径1mmの穴を開けます。ML:−0.4;DV:+3.1(図2)。録音当日にシリコンプローブ挿入を導くために、立体アームで4つの頂点をインクでマーキングします。さらに、前述のポイントをメスでつなぎ、たっぷりのインクを塗って切開部に浸透させ、印が安定するように十字を描きます。余分なインクは70%アルコールで湿らせた綿棒で取り除きます。
   2. 小脳の上方、後頭部にさらに2つの穴を開けます。それぞれの穴に1本ずつ手動で配線を挿入し、将来の参照と接地用にします(図2)。
      1. または、ステンレス製のネジ(A2ステンレススチール、M1×2サイズ、または18-8ステンレススチール、直径0.061インチ×長さ3/16インチ)やステンレス製オスジャンパーを使う方法もあります。いずれの選択にせよ、電気的接触を提供する要素が脳表面に直接接触し続け、圧力をかけずに維持し、組織損傷や動物福祉への影響、記録品質への悪影響を避けてください。
   3. 露出した頭蓋骨に浅い溝を開けて表面積を増やし、インプラントの接着性を高めましょう。
   4. 中間の歯科接着剤樹脂を洗浄・乾燥した頭蓋骨に2層連続で塗布します。まずベース触媒混合物で完全に乾燥させ、次に粉末を含む混合物で塗布し、表面全体と頭蓋骨の縁を覆います。進行前に、頭蓋骨と将来のインプラントセメント間の接着結合が完全に固まっているかピンセットで確認してください。
   5. PFC記録穴と基準/接地穴の間にステンレス製のヘッドバーを設置します(図2)。ヘッドバーを立体アームと整列させ、頭蓋骨と完全に同じ高さになるようにすることで、頭部固定およびその後のシリコンプローブ挿入時に正確な立体座標を維持できます。
   6. すべての金属部品はデンタルセメントで頭蓋骨に接着し、録音穴にセメントが入らないように注意してください。
   7. 開頭切開は二成分の外科用シリコーンで覆います。
      注:すべての手順を慎重に守れば、埋め込みおよびその後のヘッドバーの機能が合併症なく進行し、成功率は95%を超えると推定されます。
4. 術後ケア
   1. 脳手術後のマウスの回復を注意深く観察し、意識を取り戻し、体温を保ち、痛みを和らげる様子を確認しましょう。
   2. マウスはケージに入れて飼い、完全に回復するまで観察してください。
   3. 手術後3日間、12時間ごとに皮下ブトルファノール(生理食塩水で5 mg/kg)を投与します。
      注意:(重要)手術中は心拍数と呼吸数、酸素飽和度、血圧などのバイタルサインを継続的に監視してください。角膜の乾燥や損傷を防ぐために、必要に応じて点眼薬を塗布してください。

3. 習慣化

注:マウスが手術前の体重(手術後約5〜7日)回復したら、4日間の慣れ育成プロトコルを開始し、徐々に実験環境に慣れさせてください。

1. 1日目:2回の10分間のハンドリングセッションを行い、セッション間には1時間の休憩を設けてマウスを実験者に慣れさせます。マウスが前腕にいる状態で優しく触れて、実験者に慣れさせてください。
2. 2日目:5分間のハンドリングセッションを2回実施します。各セッションの後は、マウスをヘッドバーのそばで10秒間隔で優しく持ち、合計5分間保持します。
3. 3日目:短いハンドリングの後、マウスを7分間自由にトレッドミルで走らせます。その後、頭部を固定し、マウスを頭部に固定したまま5分間維持します。
4. 4日目:15分間のヘッドフィックストレッドミルランニングセッションを行います。
   注意:(重要)動物福祉ガイドラインに従い、過度な体重減少、理容、探索行動の減少、運動性の低下を示す動物は研究から除外されなければなりません。インプラントは完全に安定していなければなりません。いかなる変位も、記録中にマルチチャネルプローブを損傷したり、不安定でノイズの多い信号を引き起こす可能性があるため、その動物を研究から除外する必要があります。

4. プローブ準備

注意:プローブをアダプターに接続するには(図3A)、以下の手順に従ってください。

1. プローブアダプター/コネクターをステレオタキシックアームアダプターに接続します。
2. ヘッドステージアダプター2個(各Om32)をプローブアダプター(図3A)と組み合わせ、向きが一致し過度な力を避けます。
3. プローブをアダプターに接続します(図3B)。IL領域とPL領域から64段階の異なる深さで同時に記録を可能にするには、1シャンク64チャンネルのシリコンプローブ(シャンク長:8 mm;シャンクの厚さ:15μm)(図4A)。
4. プローブの局在化を促進するために、組織学的に適合する蛍光染料や強磁性粒子をプローブにコーティングし、事後的に記録部位の検証を可能にします。
5. 染料は以下のいずれかの方法で塗布します:
   1. シャンク全体を溶液に浸します。
   2. マイクロピペットから少量の溶液をプローブに垂らし、シャンクに沿って広げます。
   3. 細かいブラシで溶液に浸したものを使ってプローブの裏側を塗ります。
   4. ステップ4.5.2および4.5.3では、シャンクに適切なコーティングを施すために少なくとも3回のストロークを施します。
      注意:ステップ4.1から4.3はプローブを初めて使用した時のみ必要で、複数の録音セッションで再利用可能です。録音後は、プローブをアダプターに接続したまま、シリアル周辺機器(SPI)ケーブルを外し、アダプターは立体アームアダプターに取り付けたままにします。

5. 記録と信号取得

1. 膣塗抹で細胞型に基づく非侵襲プロトコルを用いて発情周期を監視し、女性がディエストラ^{ス期にあることを確認します。}
2. 動物を立体型フレームと統合された円筒形トレッドミルに頭部固定した位置に固定します(図4B)。トレッドミルとフレームが適切にアライメントされているか確認し、被験者間の安定性と比較可能性を確保しましょう。
3. 信号を記録・取得するには、手順5.3.1-5.3.15に従ってください。
   1. インプラントが完全に動かないように拡大レンズを使ってください。
   2. プローブアセンブリ(プローブ、アダプター、ヘッドステージアダプターから成る)をステレオタキシックフレームのアダプターアームに取り付けます。
   3. 以前取得ボードに接続されていたSPIケーブルをヘッドステージに接続します(図3B)。各ヘッドステージに接続されているSPIケーブルを記録しておくと、この対応は後の自動スパイク選別時に電極の配置を維持するために不可欠です。
   4. プローブアダプターから記録された半球の同側オスブリッジに接地線を、対側に基準線を接続します。脳に埋め込まれたワイヤーに少量のはんだ付けを塗り、短時間熱を加えて接続を固定します。下層組織やアダプターの電子機器への損傷を防ぐために、過度の熱は避けてください。
   5. PLおよびIL皮質へのプローブ挿入用の穴を拡大レンズで確認してください。インクのランドマークは常に明確に見えるようにし、正確な立体座標を維持してください。
   6. プローブを立体型アームとあらかじめ示されたランドマークを使ってvmPFC穴の中心に誘導します。
   7. プローブを開頭切開の中心に慎重に位置させ、脳表面に優しく触れます。乾燥を防ぐために、露出した組織に温かい生理食塩水を当ててください。
   8. プローブを50μm/分の速度で4〜5分間下げて、組織の炎症を最小限に抑えます。この初期挿入時にプローブシャンクが曲がらないように注意してください。
   9. 録音部位のインピーダンスを測定し、メーカーが提供する値と比較してください。この初期評価により、脳にアクセスする最初のチャネルが挿入時に損傷や詰まりがないことが確認されます。
      注意:(重要な)電極インピーダンスはメーカーの基準値と比較する必要があります。最大~30%の偏差は一般的に許容されており、録音を損なうことはありません。30%から100%の増量でも使用可能ですが、注意と詳細な監視が必要です。変化が100%を超える場合は、損傷や閉塞を示すことが多く、影響を受けた部位は信頼性が低いと考えられます。そのような場合、前述のようにインピーダンスを下げるためにプローブを清掃する必要があります。インピーダンスが許容範囲に回復できない場合は、プローブを破棄しなければなりません。しかし最終的には、プローブを廃棄する前にどれだけの信頼性の低いチャネルを許容できるかは実験者の判断に委ねられます。一般的に適用される標準として、チャネルの侵害は最大~10%に制限されるべきです。
   10. 脳に入るチャネルからのライブ信号を監視しながら、プローブを50μm/minの速度で下げ続けます。これらの信号が以前に評価されたチャネルのものと似ているか確認し、適切な挿入を確認しましょう。
   11. プローブを+3.1 mm DVの深さまで進め、降下中に温かい生理食塩水を投与して開頭切開を水分補給します。
   12. 拡大レンズを外し、部屋の他の電気ノイズ源を排除してください。
   13. プローブ降下時に記録部位が遮断されていないことを確認するためにインピーダンスを再測定してください。
   14. 4〜5チャンネルの連続した信号を基準として監視し、プローブ信号の安定化を90〜120分待ちます。この安定化期間の後、信号ドリフトが最小限であることを確認し、その後の自動スパイクソートが単一ユニットクラスターを確実に分離できるようにします。
   15. データ取得開始前にインピーダンスを再測定し、適切な記録現場条件を確認し、基準インピーダンス測定を確立します。組織の乾燥を防ぐために、定期的に温かい生理食塩水を投与してください。録画をバイナリファイル(例:.datや.bin)として保存し、データの後処理を容易にします。
4. 安定したら、手順5.4.1-5.4.6に従ってください。
   1. 30分間のベースライン神経活動を記録します(図4C)。
   2. ベースライン記録から30分後にArduinoを使って嫌悪条件付けプロトコルを開始します。これは10の聴覚音(10s/音)で構成され、1分間1分間発信されます。各トーンの後には、仮想現実迷路のスクリーンを通じて提示される10秒間の光刺激がすぐに続きます(図4C)。
   3. 条件付け刺激なしで10分間神経活動を記録します。
   4. 消滅プロトコル中にPLおよびIL皮質活動を記録し、10の聴覚トーンが提示される際に、その後の光刺激はありません。
   5. 刺激がない状態でさらに10分間神経活動を記録します。
   6. 録画を止めて。
5. 録音後の手順:録音セッション終了後、ステップ5.5.1を実行してください。
   1. プローブ抜出:温かい生理食塩水を投与し、プローブを100〜150μm/分の速度で慎重に引き抜きつつ、プローブの機械的損傷や組織の伸びを防ぐために電極信号を継続的に監視します。これにより組織学的再建が妨げられる可能性があります。
   2. プローブを脳から取り出したら、すぐにシャンクを蒸留水に10分間浸し、付着組織の乾燥を防ぎます。
   3. 動物にナトリウムペントバルビタール(100 mg/kg)で麻酔します。その後、化学的なフームフード内でマウスに80 mL(0.9%)の生理食塩水を経心灌流し、続いて80 mLのPB(0.1 M、pH 7.6)で希釈したパラホルマルデヒド4%を投与します。
      1. パラホルマルデヒドや接触・吸入を避けるために、目や顔の保護具、化学的保護手袋、防塵マスクを使用してください。灌流の最後に、残ったパラホルムアルデヒドを非ハロゲン溶媒用の容器に沈着させます。
      2. こぼれた場合は、粉塵の拡散を防ぐために材料を湿らせ、密閉容器に入れてください。汚染された場所や作業台は漂白剤で清掃し、パロルマルデヒドを中和します。
   4. 脳を摘出し、4°Cで一晩固定し、PB(0.1 M、pH 7.6)に30%ショ糖を4°Cで冷凍保存します。凍結ミクロトームを使って30μmの冠状切片を取得し、そのスライスをゼラチン化ガラススライドに取り付けます。
      注:これらの切片は、これまでの^19、20、21およびプローブ位置による免疫組織化学によるDR α-Syn過剰発現の確認に使用されます。
   5. プローブクリーニング:プローブの埋め込み可能な部分を1%酵素洗剤溶液の蒸留水に1時間浸します。
   6. プローブシャンクを蒸留水にさらに10分間浸して洗剤の残留物を取り除きます。
   7. 直立したまま20〜30分乾燥させます。乾燥後、顕微鏡でプローブを点検し、記録部位に組織や破片が残っていないか確認します。プローブが完全に清潔であれば、高品質のイソプロピルアルコールに1分間浸し、元の静電気防止箱に保管してください。

6. データ解析:スパイクソートとデータ前処理

注:細胞外神経記録を解析し、個々のスパイクを特定のニューロンに帰属させるには、Kilosort4³¹ スパイクソートアルゴリズムを使用します。

1. Kilosort4³¹を使って自動スパイクソートを実行してください。Kilosort4のGUIでバイナリ記録ファイルを選択し、メーカーの設定シートに従ってプローブのレイアウトを指定します。スパイクソートはデフォルトのパラメータで実行します。これによりILおよびPL皮質に記録された波形を追加の調整なしで捉えられます。
2. Phy2(クイックチーム/phy)を使ってKilosortの出力をチェックして、追加の手動管理を行ってください。コミュニティ開発のプラグイン(petersenpeter/phy2-plugins;jiumao2/PhyWaveformPlugin)を取り入れ、Phy2に追加機能を追加し、キュレーションデータの品質を向上させましょう。
3. ノイズとしてラベル付けし、周波数<0.05 Hzまたは500個未満のスパイクを含むクラスターは廃棄します。
4. また、以下のクラスターをノイズとしてマークしてください:
   1. 三角形の自己相関を示すものはノイズとしてマークしてください。
   2. スパイクに似ていない波形のものはノイズとしてマークしてください。
   3. 単一の録音チャンネルで検出されたものや、振幅が異なる全チャンネルで検出されたものをノイズとしてマークしてください。
   4. 自己コレログラムで強い周期性を示すものはノイズとしてマークしてください。
5. 生理学的に適切な波形を示すクラスターのみ、自己相関図に耐火谷の証拠があり、もっともらしい振幅変動があり、主成分が明確に分離されているものを選ぶ。
6. 各クラスターは、Mahalanobisの距離ベースの外れ値除去を適用して手動でクリーンリングします。
7. 手動クリーニングの妥当性を示す重要な指標として、波形形状や振幅の変化を引き続き確認してください。
   注:スパイクソートが完了すると、vmPFCのニューロン活動パターンをPythonで実装したルーチンで解析できます。

結果

詳細な実験プロトコルを用いたPLおよびIL皮質活動の最近記録は重要な発見を示しています。すなわち、DRにおけるh-α-Syn過剰発現は、メスマウスに不安様表現型を誘導し、腹内側vmPFC活性も変化させるというものです。Pythonを用いた解析を通じて、DR核の5-HTニューロンにおけるα-Synの過剰発現がvmPFC-DR回路の発火動態と機能的組織を変化させ、神経細胞サブタイプ間の電気生理学的区別を減少させることを示しました。対照動物では、神経細胞の亜型が電気生理学的特性に基づいて明確に分離可能であり、SST+、ピラミッド型、PV+ニューロンの正確な分類が可能でした。対照的に、A53T α-Synの過剰発現は分離性の著しい喪失をもたらし、特徴空間の重なりや神経集団間の広範な誤分類を引き起こしました(図5)。この乱れは発射率分布の崩壊を反映しており、α-Syn病理が正常条件下で回路レベルの組織を維持する明確な電気生理的同一性を損なうことを示しています。

図6は、対照...

ディスカッション

本プロトコルは、覚醒中の頭部固定マウスにおけるPLおよびIL皮質の生体内電気生理学的評価のための堅牢な方法論を、バーチャルリアリティ回廊システムを用いて提示します。この手法の重要性は、PDモデル内でvmPFC-DR回路を覚醒状態で直接調査できる点にあります。たとえ頭部集中が動物の動きを制限しストレスを与えることがあるとしても、正確な刺激制御や安定性の記録を提供し、知覚や認知過程の研究に適していますが、自然な行動を反映しないかもしれません(^24,25)。このアプローチは、特に嫌悪条件付けの際に、より生理学的に関連性の高い状態での神経活動の研究を可能にすることから、生体外や麻酔製剤に比べて大きな利点を持ちます。これはストレス関連状況をモデル化します(^32,33)。実際、全身麻酔中は行動状態や全身脳活動、特に皮質反応が大きく変...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AAV1/2-CMV/CBA-ヒトA53T aSyn-WPRE-BGH-polyA	チャールズ川	GD1001-RV	ヒトA53T aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Empty-WPRE-BGH-polyA	チャールズ川	GD1004-RV	空ベクトル制御
ADPT A64-Om32x2	ケンブリッジ・ニューロテック	オムネティクス 2228	アダプター
二成分外科用シリコーン 	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	クイックシル
ブトルファノル	Torbugesic Vet / cymit quí雲母	67753-31-5
デュラレイ	リライアンス・デンタル・マニュファクチャリング / カルマ	43640	デンタルセメント
H9マルチチャネルプローブ	ケンブリッジ・ニューロテック	ASSY-77 H9
EMLAクリーム(リドカイン/プリコレイン)とnbsp;	リリオス・ヴァランティルデ;そして急性;センペレ薬局	679290
マイクロインジェクター	ワールド・プレシジョン・インスツルメント	KDS-310-PLUS
MSSイソフルラン・ヴェポライザー	医療用品・サービス、英国	MSSVAP02
オープンEphys取得委員会	オープン・エフィス	OEPS-9029	調達委員会;Open Ephys取得ボードはUSB経由で最大512チャンネルの神経データをコンピュータにストリーミングできます
C&B MetaBond	パーケル	S380-RD	クイック接着セメント
ペントバルビタール	ドリーサル・ベトキノール/メルク・ライフサイエンス、S.L.U.	P-010-1ML	バルビツール酸
右弦32チャンネル ヘッドステージ	インタン・テクノロジーズ	#C3314	ヘッドステージアダプター
シカフルード	Thea S.A.ラボラトリーズ/リリオス・ヴァンティルデ;そして急性;センペレ薬局	6515167	眼科用ジェル
立体タキシック装置	ストールティング	51730U
ステレオタキシックフレーム	成重	SR-6N/SM-15R
テルグアザイム	シグマ・オルドリッチ	Z273287	プローブクリーニング液