哺乳類細胞における細胞膜および細胞内ニコチン性アセチルコリン受容体の局在化

サマリー

このプロトコルは、哺乳類のNeuro-2a細胞株を用いたニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの発現と定量を記述しています。pH感応蛍光タグと共焦点顕微鏡は、pH中性細胞内区画での受容体局在とpH中性細胞内区画での受容体の位置を正確に評価し、nAChRの輸送および薬理学的調節の研究を促進します。

要約

哺乳類細胞の細胞膜上で発現するニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)の定量化は、新規標的選択療法の開発や受容体輸送を調節するシャペロンタンパク質の研究に重要です。本研究は、哺乳類のNeuro2a(N2a)細胞におけるホモマーおよびヘテロメトリックnAChRを発現し、pH感応蛍光タグを用いて表面と細胞内局在を定量化するための堅牢な手法群を提示します。pHujiおよび超黄道pHluorin(SEP)はpH感受性タンパク質であり、組換えタンパク質にタグ付けするために設計可能であり、これによりnAChRサブユニットの空間的分布を可視化できます。これらの蛍光タグは中性pHで発光しますが、酸性環境では消火されます。α7、α4、β2 nAChRサブユニットの内部対細胞膜局在を追跡するために、pHujiまたはSEPのいずれかが各DNA構成体のC末端に付加されます。α7-pHujiとそのシャペロンであるNACHO(α4-SEP;β2-pHuji)をN2a細胞で発現させるために、脂質ベースのDNAトランスフェクション試薬が用いられます。トランスフェクション試薬とプラスミドDNAは、室温の還元血清培地で別々に培養され、その後結合して脂質-DNA複合体を形成し、プラスミドの細胞内送達を促進します。培養後、細胞は高pHおよび低pH条件下、または亜型選択的蛍光配位子の存在下で生細胞共焦点顕微鏡を用いて画像化されます。画像は、関連する蛍光層チャネルにおける補正された全細胞蛍光を用いて解析され、蛍光標識されたnAChRサブユニットの細胞膜と細胞内区画間の分布に関する定量的情報を提供します。生細胞共焦点イメージングにより、nAChRサブユニットの局在をリアルタイムで追跡し、内部受容体群と表面受容体群の違いを識別できます。α7-pHuji(α4-SEP;β2-pHuji)の堅牢な細胞膜発現は、37°Cで24時間以内に達成されます。 この方法は、nAChRの輸送、薬理学的調節、疾患関連のnAChR発現変化の研究のために、追加のシャペロン、補助サブユニット、蛍光リガンドを含めることができます。

概要

ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)は、ニューロン、グリア細胞、免疫細胞を含む多くの細胞タイプの細胞膜上で発現するリガンドゲートされた膜貫通イオンチャネルです。これらの受容体はα(α2-α10)またはβ(β2-β4)のサブユニットで構成されており、これらが集合してホモメリックまたはヘテロメトリックサブタイプを形成します。特にα7およびα4β2 nAChRが脳内で最も豊富です^1,2。これらのサブタイプの調節障害は、アルツハイマー病、ニコチン使用障害、睡眠関連過運動てんかん、パーキンソン病、大うつ病など、さまざまな神経学的および精神疾患と関連しています。^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}.nAChRを迅速かつ確実に発現・定量化する方法は、疾患メカニズムの理解や標的選択的治療薬の開発に不可欠です。しかし、これらの受容体の堅牢な形質膜発現を達成することはしばしば困難で時間がかかります。ここで説明する方法は、DNAトランスフェクション後約24時間以内にnAChRsの強い表面発現を可能にし、受容体輸送を調節するリガンドやシャペロンタンパク質と組み合わせることが可能です。

nAChR発現には、一時的なDNAトランスフェクションや、目的のサブタイプを発現する安定細胞株の生成など、いくつかのアプローチがあります。安定した細胞株の作製は同じ受容体サブタイプを用いた長期研究に役立ちますが、このプロセスは労力集約的で数か月かかることもあります。確立されると、これらの細胞株は受容体発現が異なり、時間経過による発現喪失、または受容体機能や密度が最適でないクローンでは選択バイアスを示す^{ことがあります。}培養温度を37°Cから30°Cに下げ、ニコチンなどの分子チャペロンの追加、または潜伏時間の延長により表面発現を促進する^{ことができます。}これらの制限は、適切なサブユニットの組み立てと輸送を必要とする異形型nAChRや、シャペロン補助受容体調節に焦点を当てた研究で特に顕著です。したがって、安定したnAChR発現細胞株を扱う際には、受容体サブタイプ発現のパッセージ間での定期的な検証が必要です。

研究者はしばしばnAChRサブユニットのバリアントやシャペロンまたは補助タンパク質サブユニットに関心を持ち、迅速な柔軟性を確保するために様々なDNAを短時間で発現させる必要があります。nAChRsの一時的発現はこの点で有利であり、このプロセスが迅速に完了できるため、研究者は安定した細胞株を生成するのに数か月待つことなく複数の受容体サブタイプや実験条件を研究できます。一時的な発現であっても、多くのnAChRが誘導後24時間経っても細胞内に残り、48時間^16,17分の追加>潜伏期間が必要になることがよくあります。例えば、コリンエステラーゼ阻害剤(RIC)-3に対する耐性を持つシャペロンタンパク質がない場合、哺乳類のSHE-P細胞の細胞膜上で発現するα7 nAChRsはわずか~1%に過ぎません¹⁸。RIC-3の共発現により、α7 nAChRsの約20%が表面で検出されます。これは改善を示していますが、総受容体の存在比は依然として低いままです。α7 nAChRsとNACHOの共発現は表面発現をさらに促進できますが、それでも全受容体集団の40%未満が細胞膜に輸送されます¹⁹。別の方法は、形質膜発現を改善するために30°Cでトランスフェクト細胞を培養する方法^です。α4β2 nAChRの場合、この温度低下は表面受容体密度の5倍のアップレギュレーションをもたらし、総サブユニットタンパク質²¹の増加は伴いません。しかし、この改善には少なくとも1日の追加と消耗品、試薬、計測機器の利用拡大が必要です。

本研究は、哺乳類のN2a細胞において、トランスフェクション後24時間以内に特定のnAChRサブタイプを発現・定量する最適化された手法群を提供し、α7で約83%、α4で77%、β2サブユニットが形質膜に局在する56%を達成しています。α7 nAChRの場合、細胞膜発現はα7選択的蛍光標識α-バンガロトキシン(αBTX)または組換え蛍光タグ付けを用いて定量化できます。各サブユニットを標識するために、pH感受性蛍光タンパク質pHujiおよび超黄道pHluorin(SEP)22,23,24を個々のnAChRサブユニット^25,26のC末端に設計します。pHujiとSEPはそれぞれpH感受性の赤色および緑色蛍光タンパク質の変異体で、pH 7.4で蛍光を発しますが、より酸性な条件下で消光されます^27,28。SEPおよびpHuji蛍光はpH<6で抑制されるため、観察される細胞内信号は細胞膜上ではなく中性区画に存在する蛍光体を反射します。ゴルジ体のような一部の小器官は酸性ルーメンを持つことに注意が必要です。したがって、nAChRサブユニットのC末端領域に付着した蛍光体は、サブユニットが分泌経路²⁹を通過する間は検出されません。pH 7.5時とpH <6時の全蛍光の差は、細胞膜上に位置するnAChRsによって生成される信号を表しています。ライブセル共焦点顕微鏡による画像のキャプチャは高い空間分解能を提供し、サブユニットの位置特定を正確に定量化することを可能にします。さらに、すべての実験を生細胞で行うことで、各細胞が独自のコントロールとして機能し、各^{処理群内の}細胞間タンパク質発現のばらつきを考慮します。この方法は、NACHOなどの追加のシャペロンタンパク質を含めるためにさらに適応され、nAChRの輸送を調査することが可能です。その他の応用例としては、薬理学的調節、補助サブユニットの組み込み、疾患関連のnAChR発現変化の解析などがあります。

プロトコル

注:以下の手順は、nAChRサブユニットでN2a細胞株を一時的にトランスフェクションするために成功裏に用いられた方法について説明しています(図1)。活細胞共焦点顕微鏡で捉えられたものの、堅牢な形質膜発現は24時間以内に達成されます。

図1:プロトコルで提示された個々の手法の回路図的表示。 細胞はイメージング皿内で70%〜80%まで培養されます。その後、細胞はトランスフェクション試薬とDNA複合体で処理されます。 (上) 24時間後、細胞は蛍光標識リガンドで処理され、細胞膜上で発現したサブユニットを標識し、共焦点顕微鏡で画像化します。 (下) あるいは、トランスフェクション後24時間でpH感受性タンパク質でタグ付けされるよう改変されたnAChRサブユニット遺伝子については、共焦点顕微鏡を用いて細胞の全蛍光を捉えるために生きた細胞を画像化することも可能です。その後、pH 7.4のイメージングバッファーはpH 5.5のクエンチングバッファに交換されます。これにより、細胞の細胞膜上にあるnAChRサブユニットにタグ付けされたpH感受性タンパク質の蛍光が止まり、内部サブユニットのみが蛍光を保つことができます。同じ細胞を再び画像化します。画像解析はImageJを用いて内部および外部サブユニットの発現を定量化します。これらの手法は、シャペロンや補助タンパク質を取り入れるために修正可能です。BioRenderで作成。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. N2a nAChR過渡性トランスフェクション

注:N2a細胞株が選ばれたのは、神経表現型を示し、nAChRの内因性発現が低いためです。α7-pHuji、α4-SEP、β2-pHujiサブユニット遺伝子は、それぞれ哺乳類のpcDNA3.1(+)発現ベクターに個別に収容されています。シャペロンタンパク質のNACHOはpREP9から発現しています(ノースイースタン大学のR. Loring博士から寛大に寄贈されました)。すべての工程で無菌技術を使用し、バイオセーフティキャビネット内で作業してください。清潔な実験用コート、安全メガネ、手袋を着用してください。バイオセーフティキャビネットに出入りするすべての材料を70%エタノールで洗浄してください。以下の手順は、イメージングに適した35mmポリDリジンコーティングガラス底皿でのトランスフェクションについて説明します。培養容器によって体積は必要に応じて調整可能です。

1. T25(または類似)組織培養フラスコに、イーグルズ最小必須培地(EMEM)を含み、10%胎児用牛血清(FBS)および必要に応じて100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLのストレプトマイシンを補足します。細胞が~90%の合流に達するまで、37°C、5%のCO₂で培養します。4倍の光学顕微鏡対物レンズを使ってイメージしてください。
2. 光顕微鏡で毎日コンフルエンシーを監視し、最適な状態を維持するために1〜2日ごとに培地を交換してください。細胞が~90%の合流に達すると、イメージング皿への移行準備が整います。
3. すべての試薬を水浴で37°Cまで予温してください。手順開始前に、バイオセーフティキャビネットとすべての材料を70%エタノールで洗浄してください。
   注意:70%エタノールは非常に可燃性の高い液体であり蒸気で、深刻な目の刺激を引き起こす可能性があります。熱、火花、火花、その他の引火源から離れてください。換気の良い場所で容器をしっかり閉めて保管してください。取り扱う際は保護手袋と目・顔の保護具を着用してください。皮膚や目に触れた場合は、すぐに水で洗い流し、刺激が続く場合は医療機関を受診してください。代わりに5%〜10%の漂白剤溶液などの消毒剤を使用することもあります。
4. フラスコから古い培地を吸引し、細胞を5mLのPBSで洗浄します。フラスコに1mLのトリプシンを加え、優しく回します。細胞が浮かぶまで潜伏(<5分)。過剰消化を防ぐために、すぐにEMEM培地4mLを加え、優しくピペットで操作して単一細胞懸濁液を作ります。
5. ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を測定し、1 mLに0.5〜2 x 10⁵細胞を含むように懸濁液を調整するためのEMEM増殖培地の体積を計算します。
6. 35mm皿あたり1mLの細胞懸濁液をプレートし、EMEM増殖培地を足して総体積を2mLにします。37°C、CO₂5%で一晩培養します。細胞は70%〜80%のコンフルエンシーでトランスフェクションの準備が整います。
7. トランスフェクション当日には試薬を37°Cまで予温し、nAChRサブユニットDNAを完全に解凍し、トランスフェクション試薬を室温に持ち込みます。すべての試薬をバイオセーフティキャビネットに入れる前に70%エタノールで洗浄してください。
8. α7 nAChRを発現させるには、マイクロ遠心分離機チューブ内で、α7 4 μg(1 μg/μL)とNACHO 1 μg(1 μg/μL)プラスミドDNAを希釈して、抗生物質なしの還元血清培地に滴下して最終体積250 μLにします。DNA追加後にピペッティングで優しく混合します。
   1. α4β2 nAChRを発現させるために:各サブユニットDNAを合計250μLの還元血清培地に希釈します。ピペッティングで優しく混ぜます。各サブユニットの比率を調整し、特定の受容体アイソフォームの発現を最適化します。
   2. 追加のプラスミドでα4β2 nAChRを発現させるには、各プラスミドDNAを等量に加えます。pcDNA3.1(+)に含まれる青色蛍光タンパク質mTagBFP2³¹は対照プラスミドとして機能し、任意のα4β2シャペロンに置き換えることができます。
9. 使用前にDNAトランスフェクション試薬を優しく混ぜてください。別のマイクロ遠心分離機チューブで、8μLのトランスフェクション試薬を250μLの還元血清培地に滴下して希釈します。室温で5分間孵育します。25分以内に次のステップに進みます。
10. 5分後に希釈したDNAと希釈したトランスフェクション試薬(合計=500μL)を滴ごとに混ぜます。ピペッティングで優しく混ぜ、室温で20分間培養します。DNA脂質複合体は最大6時間安定しています。
11. 複合体が形成される間、培養皿をインキュベーターから取り出し、抗生物質は不要な血清不使用EMEM1mLに交換してください。
12. 各皿に500μLのDNAトランスフェクション試薬複合体をドロップごとに添加します(最終体積=1.5mL)。皿を揺らして、皿全体、特にガラス底の表面に均一に混ぜるように混ぜます。37°Cで24時間培養し、4〜6時間後に培地を交換して細胞の健康を促進します。

2. αBTX Alexa Fluor 647を用いた細胞膜発現α7 nAChRの生細胞標識

注:以下の手順は通常、トランスフェクションから24時間後に実施されます。αBTX Alexa Fluor 647(αBTX-AF647)を光から保護し、蛍光色素の光破壊を防ぎます。

1. すべての試薬を37°Cに予温し、αBTX-AF647ストック(2.3μM)溶液を解凍します。70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネットに入れます。
2. インキュベーターからα7およびNACHO DNAをトランスフェクトした細胞を回収し、外側を70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネットに入れます。
3. 古い媒体は真空吸引で捨てます。細胞を洗浄するには、新鮮なEMEM培地2mLを加えます。
4. 洗浄液は真空吸引で除去します。食器にEMEM成長培地2mLを加えます。
5. 適切な量の培地をαBTX-AF647に置き換え、最終濃度80 nMにします。37°Cで一晩抱卵します。
6. 朝はPBSや好みのイメージング媒体で予温し、70%エタノールで洗浄します。バイオセーフティキャビネットに移す。
7. インキュベーターからトランスフェクトした細胞を取り出し、洗浄してバイオセーフティキャビネットに入れます。
8. 古い培地のαBTX-AF647を除去し、適切な廃棄物容器に入れます。
9. 細胞を2mLのPBSで3回、各10分室温で洗浄します。洗浄は結合していないリガンドや残骸を除去し、研究者のニーズに合わせて時間を調整できます。洗車のたびにPBSを取り除きます。
10. PBSまたは推奨されるイメージング培地を2mL追加し、共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。

3. 全および内部α7-pHuji nAChRsのライブセルイメージング

注:以下の手技は、社内で製造されたα7-pHuji pcDNA3.1プラスミドをNACHOシャペロンと共トランスフェクトして使用しています。同様のプロトコルが、対照プラスミドmTagBFP2 pcDNA3.1を用いてpcDNA3.1中のα4-SEPおよびβ2-pHujiを発現するために用いられました(結果セクションで説明しています)。検査中は、蛍光色素の光破壊を防ぐために試料を光から守りましょう。

1. pH 7.4イメージングバッファ(表1)およびpH 5.5のクエンチングバッファ(表2)を準備します(^表23)。
2. 試薬を37°Cまで予温し、70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネットに移します。インキュベーターからトランスフェクトした細胞を取り出し、70%エタノールで洗浄してバイオセーフティキャビネットに入れます。
3. 古い培地は吸引で取り除きます。皿を2mLのPBSで、室温で3回、各10分ずつ洗い流します。pH7.4イメージングバッファーを2 mL追加します。
4. 皿を共焦点顕微鏡に持っていきましょう。pH 7.4のイメージングバッファーを入れたイメージングアンテナをスライドホルダーに挿入し、ホルダーを共焦点顕微鏡の予温環境チャンバーに置きます。
5. 蠕動ポンプのチューブをイメージングディッシュホルダーに接続し、チャンバーを閉じます。
6. イメージングソフトを開き、目的の蛍光分子(pHuji 566/598 nm、α4-SEP 499/520 nm、β2-pHuji 568/603 nm、mTagBFP2 359/461 nm)のレーザーを選択します。
7. 10x-60x対物レンズを使って、アンテナをスキャンして細胞を特定して画像を撮ります。必要に応じて拡大倍率を上げ、必要に応じてピント深度を調整してください。
8. レーザーの強度と検出器の感度を調整し、背景信号なしで蛍光を可視化します。必要に応じて、蛍光信号を増幅させるために絞りを調整してください。
9. 希望する解像度を選択し、目的の対物レンズ(例:60倍)で単一の画像を撮影します。
10. バッファーがpH 5.5のクエンチバッファに変化した後、同じセルを再配置するための位置をディッシュマップに記録します。
11. アンテナの複数の箇所で画像処理を繰り返し、新しい位置ごとに記録します。すべての画像(実験群および対照群)で同じ撮影設定を使用して有効な比較を有効にします。
12. 出口ラインだけを蠕動ポンプに接続し、皿からpH7.4のバッファーをゆっくりと吸い込み、廃棄物容器に吸い込みます。
13. バッファーの大部分が除去されたら(乾燥セルなしで)、インレットラインをpH 5.5のクエンチングバッファーに移します。
14. 蠕動ポンプを起動して、pH 5.5バッファーをゆっくり(1.5 mL/min)ディッシュに追加し、細胞がしっかりと付着していることを確認します。
15. ポンプを20分間動かし、バッファーが正しくアンテナに出入りしているか確認してください。
16. ポンプを停止し、pH 5.5のクエンチングバッファーでさらに20分間細胞を培養して平衡させます。
17. イメージングを繰り返すには、前回のセッションで保存された位置を読み込み、同じ領域に戻します。
18. バッファ交換後に焦点深度と位置が変わる可能性があるため、焦点深度と位置が正しいか確認してください。
19. pH-クエンチド条件を用いて保存済みの全位置で再度イメージングを行います。

試薬	濃度(mM)
NaCl	135
KCl	5
MgCl2	1.8
ヘペス	20
D-グルコース	1
溶液をpH7.4に調整してください

表1:イメージングバッファーレシピ。 以下の試薬を組み合わせ、溶液をpH7.4に調整しました。

試薬	濃度(mM)
NaCl	135
KCl	5
MgCl2	0.4
CaCl2	1.8
MES	20
D-グルコース	1
溶液をpH5.5に調整してください

表2:焼入れバッファーのレシピ。 以下の試薬を混合し、得られた溶液をpH5.5に調整しました。

4. 画像定量化

注:この手順は、ImageJ(国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州)および補正全細胞蛍光法(CTCF)³²を用いた細胞画像の解析方法を説明します。

1. ImageJを開き、解析対象の画像を開きます。画像はスタックとして表示され、各キャプチャされたチャネルは同じフレーム内で分離されます。
2. フェーズチャンネルに進みなさい。画像が明るすぎる場合(空白や背景の領域でよくある)、コントラスト強化>処理を選択し、OKをクリックします。
3. 虫眼鏡ツールを使って、1つのセルを(+)ズームインします。Freehand選択ツールを使って、位相チャネル内のセルの輪郭をなぞります。
4. 対象の蛍光分子に対応する蛍光チャネルに切り替えます。「 分析」>「測定セット」を選択して、望ましい測定を設定してください。 面積、平均グレー値、 統合密度 を必ずチェックしてください。
5. 選択した領域を測定するには、 分析>測定 を選択し、Macでは Command + M 、Windowsでは Ctrl + M を押します。
6. セル近くの空洞をなぞって背景測定を3回行います。希望するセル数を同じ手順で繰り返します。
7. 測定データはImageJの別の結果ウィンドウに表示されます。これらのデータをコピーしてExcelに貼り付けて分析してください。
8. 3つの背景測定から平均背景平均を計算します。
9. 各セルのCTCF値を以下の式で計算します。
   CTCF=積分密度−(細胞面積×平均背景蛍光)
10. このプロセスを複数の細胞と各実験群(および該当する場合はpH条件)の画像に対して繰り返します。すべての結果をデータ分析ソフトウェアにエクスポートし、統計処理を行います。

結果

上記のトランスフェクション手順の後、α7 nAChRsとNACHOシャペロンタンパク質がN2a細胞内で共発現しました。非トランスフェクト細胞およびトランスフェクトされた細胞の両方が、DNAトランスフェクション後24時間後にαBTX-AF647で標識されました。αBTXは膜透過性がないため、検出されるすべての蛍光は細胞膜上にある受容体から発生します。 図2A,A′では、 非トランスフェクトN2a細胞で弱いαBTX-AF647染色が観察されました。N2a細胞は内因性に少量のα7 nAChRを発現しており、この最小限の標識を説明しています。対照的に、陽性トランスフェクトされた細胞は堅牢なαBTX-AF647標識を示しました(図2B,B′)。蛍光信号は、しばしば細胞膜発現と関連する離散的な点として現れ^ます。nAChRが配位子に結合すると、エンドサ...

ディスカッション

哺乳類N2a細胞におけるnAChRサブユニットの発現および定量に関する方法論は、創薬、局在、輸送研究において、nAChRの細胞膜発現を迅速(~24時間)かつ豊富に達成するという長年の課題に対応しています(>60%)。このプロトコル群の重要な強みは、ホモマー(α7)およびヘテロメリック(α4β2)nAChRの両方に適応できることであり、シャペロンタンパク質の共発現とともに他のnAChRサブタイプにも応用可能である可能性が高いです。SEPやpHujiのようなpH感受性タグを活用することで、この手法は細胞膜と細胞内nAChR集団間の生細胞識別と定量化を可能にします。この区別は、nAChRサブタイプが14-3-3、NACHO、RIC-3、Lynx-1タンパク質など、さまざまなシャペロンおよび補助タンパク質、そしてニコチン^{17、18、35、}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA(1X)	ギブコ	25200-056	細胞剥離試薬
アルファ・ブンガロトキシン アレクサ フルー 647	インビトロジェン	B35450	アルファ-ブンガロトキシン共役体
BSLレベル1 バイオセーフティキャビネット	ヌアイレ	NU-425-400	無菌細胞培養作業区域
塩化カルシウム	アベントル/VWR	BDH9224	バッファ成分
D-(+)-グルコース	ミリポア・シグマ	G8270	バッファ成分
L-グルタミンを用いたEMEM	ATCC	30-2003	細胞培地
エンドトキシンフリーDNA	Zymoキットを使って自社製	該当しません	細胞一時型トランスフェクションに使用されるnAChR DNA
エンドトキシンフリーマイクロ遠心分離管、0.5 mL	アベントル/VWR	89000-010	DNAおよびトランスフェクション調製
エンドトキシンフリーのマイクロ遠心分離チューブ、1.5 mL	アベントル/VWR	20170-038	DNAおよびトランスフェクション調製
胎児用牛血清	アベントル/VWR	97068-085	血清サプリメント
フルオビュー FV10i	オリンポス	FV10i	共焦点顕微鏡
ガラス底のMatTek皿	マットテック	P35GC-0-10-C	イメージングアンテナ
GraphPad プリズム v. 10	GraphPad プリズム	https://www.graphpad.com/features	データ分析ソフトウェア
ヘペス	ミリポア・シグマ	H3375	バッファ成分
リポフェクタミン 2000	インビトロジェン	11668019	トランスフェクション試薬
塩化マグネシウム六水和物	熱力学	413410025	バッファ成分
MESハイドレート	ミリポア・シグマ	M5287	バッファ成分
mTagBFP2-pBAD	AddGene	54572	細胞一時的なトランスフェクションに使用される制御DNAを指す。
ニューロ2a(N2a)細胞	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	CCL-131	DNAトランスフェクションおよびnAChR発現に用いられる細胞
オプティMEM	ギブコ	31985-070	還元血清培地
ペニシリン/ストレプトマイシン	アベントル/VWR	K952-100mL	抗生物質
蠕動ポンプ	ギルソン	ミニパルス3	イメージング時のバッファの変化など;
リン酸塩緩衝塩水	クオリティ・バイオロジカル	119-069-131	生理食塩水バッファー
ピペット・エイド	Drummondとnbsp;	140084	精密な液体移動
ピペットチップ(無菌・内毒素フリー、1000uL)	レイニン	30389216	精密な液体移動
ピペットチップ(滅菌・内毒素フリー、20uL)	レイニン	30389229	精密な液体移動
ピペットチップ(滅菌・内毒素フリー、250uL)	レイニン	30389246	精密な液体移動
ピペットス、P10	レイイン	L-10XLS	精密な液体移動
ピペット、P100	レイイン	L-100XLS	精密な液体移動
ピペット、P1000	レイイン	L-1000XLS	精密な液体移動
塩化カリウム	ミリポア・シグマ	P3911	バッファ成分
血清学的ピペット(無菌かつ内毒素フリー、10ML)	アベントル/VWR	89130-898	精密な液体移動
血清学的ピペット(無菌かつ内毒素フリー、25 mL)	アベントル/VWR	89130-900	精密な液体移動
血清学的ピペット(無菌かつ内毒素フリー、5 mL)	アベントル/VWR	76201-710	精密な液体移動
血清学的ピペット(無菌かつ内毒素フリー、50 mL)	アベントル/VWR	75816-088	精密な液体移動
塩化ナトリウム	アベントル/VWR	BDH9286	バッファ成分
組織培養フラスコ	ファルコン	353109	料理の栽培
ZymoPure II プラスミド Maxiprepキット	ザイモリサーチ	D4203-A + D4203-B	エンドトキシンフリーDNAの産生
α4-SEP	サーモフィッシャー・サイエンティフィック GeneArt遺伝子合成サービス	https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html	カスタム遺伝子合成サービス
α7-pフジ	ツイスト・バイオサイエンス	https://www.twistbioscience.com/	カスタム遺伝子合成サービス
&ベータ;2-pフジ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック GeneArt遺伝子合成サービス	https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html	カスタム遺伝子合成サービス