研究記事

ML385 は、ROS/NRF2 オートファジー軸経路を介してシリカ誘発性肺腺癌細胞の悪性進行を弱めます

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DOI：

10.3791/69382

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2025年10月31日

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1School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, 2Department of Medical Laboratory, Huaian Hospital of Huaian City, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 6Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 7Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, 8Department of Blood Transfusion, Shanghai Pudong New Area People's Hospital

この記事について

サマリー

この研究では、動物および細胞モデルを使用して、 NRF2 阻害剤ML385がROS / NRF2オートファジー軸経路を介してシリカ誘発性肺腺癌の悪性進行を弱めるかどうかを調査します。

要約

シリカ曝露は肺腺癌のリスク増加と関連していますが、その分子メカニズムは不明のままです。この研究は、核因子赤血球 2 関連第 2 因子 (NRF2) 阻害剤 ML385 が、ROS/NRF2 オートファジー軸経路を調節することにより、シリカ誘発性肺腺癌の悪性進行をどのように阻害するかを調査するための反復可能な実験プロトコルを確立することを目的としています。まず、C57BL/6マウスにおけるシリカ懸濁液の鼻腔内灌流により珪肺症モデルが確立されました。肺線維症の程度をマッソン染色で評価し、免疫細胞の浸潤を免疫蛍光法で分析し、肺組織におけるNRF2、サイクリン依存性キナーゼ1(CDK1)、および電位依存性陰イオンチャネル1(VDAC1)の発現を免疫組織化学によって検出しました。続いて、in vitro実験で、RAW264.7マクロファージ細胞株をシリカで処理しました。オートファジーフラックスと酸化ストレスレベルは、LC3-リソソーム共局在とROSプローブによって評価され、NRF2阻害剤ML385による介入が行われました。最後に、肺腺癌細胞の遊走、浸潤、およびアポトーシスに対するML38の効果を、スクラッチアッセイ、特定のサイズの細孔を通過する細胞アッセイ、およびフローサイトメトリーによって分析されました。その結果、シリカがマウスの肺線維症、免疫細胞浸潤、NRF2、CDK1、VDAC1のアップレギュレーションを誘導し(p < 0.001)、マクロファージのオートファジーフラックスを阻害し、ROSレベルを低下させることが示されました。ML385はこれらの効果を逆転させることができます(p < 0.05)。このプロトコルは、in vivo モデルの構築から in vitro メカニズム研究までの完全な実験プロセスを提供し、シリカ関連肺腺癌の分子メカニズムと NRF2 を標的とする治療戦略を研究するための運用技術パスを提供します。

概要

肺腺癌は、世界中でがん関連死亡の主な原因であり、毎年推定200万人の新規症例と176万人の死亡があります1。近年、喫煙したことのない人々の肺腺癌の発生率が上昇していますが、これは大気汚染などの環境要因に関連している可能性があります2。シリカは一般的な環境汚染物質であり、ヒト肺腺癌の潜在的な病原性因子として特定されています3。シリカは持続的な慢性炎症を引き起こし、マクロファージ、リンパ球、好中球の浸潤、活性酸素種や炎症因子の放出を引き起こす可能性があります4。この長期にわたる炎症性微小環境は、肺腺癌の発生を促進します 5,6。シリカ曝露と肺腺癌との関連は確認されていますが、その具体的な分子メカニズムは完全には解明されていません。

NFE2L2遺伝子によってコードされる転写因子NRF2は、酸化ストレスに応答して細胞の酸化還元恒常性を維持するマスター調節因子として重要な役割を果たします7,8。通常の状況では、NRF2 は KEAP1-CUL3 ユビキチン リガーゼ複合体によって標識され、分解されます。酸化ストレスまたは求電子性物質の刺激下で、KEAP1の活性が阻害され、NRF2が安定して蓄積して核に入ることができ、それによってコア9の防御および調節の役割を発揮します。それにもかかわらず、腫瘍微小環境における過剰なNRF2活性化は、ROSの蓄積を止め、アポトーシス抵抗性を高めることにより、解糖と腫瘍細胞の生存を促進する可能性があります10,11。研究により、シリカへの曝露により NRF2 シグナル伝達経路12,13 の異常な活性化が生じる可能性があることが証明されています。したがって、NRF2 を標的とすることは、シリカによって誘発される肺腺癌の悪性進行に介入するための効果的な戦略である可能性があります14。

この研究は、 NRF2 阻害剤ML385がROS/NRF2オートファジー軸経路を調節することにより、シリカ誘発性肺腺癌の悪性進行を阻害するかどうかを明らかにすることを目的としています。シリカ誘導マウスモデルを確立し、マクロファージと腫瘍細胞の相互作用を研究するためにin vitro 実験法を用いて研究しました。シリカが炎症分子と免疫分子の発現を誘導し、ROS/NRF2-オートファジー軸経路を介して腫瘍形成をさらに促進することを発見しました。NRF2阻害剤(ML385)を使用すると、腫瘍形成に対するシリカの促進効果が遅くなり、NRF2阻害剤がシリカ誘発性肺腫瘍の治療に役割を果たしている可能性があることが示唆されました。

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プロトコル

すべてのドナーブロックは、2016年から2018年の間に南京医科大学付属淮安第一人民病院で収集されたアーカイブ病理標本から取得されました。サンプルは使用前に匿名化され、承認されたプロトコルに従って処理されました。南京医科大学付属淮安第一人民病院倫理委員会、KY-2024-250-01。実験用マウスの繁殖、処分、応用は、実験動物管理規則および国際ガイドラインに厳密に従っています。

シリカ誘導マウスモデルの構築
マウスとシリカ懸濁液の調製:6〜8週齢の雄のC57BL / 6マウスを、室温20〜25°C、12時間の光/12時間の暗サイクルの動物室で飼育します。シリコンダスト懸濁液を調製するために、300 mgのシリコンダスト粉末を正確に計量し、10 mLの滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水に懸濁しました。続いて、混合物を激しく渦巻き、5分間振動させた後、ウォーターバス超音波装置で30分間超音波処理して、粒子の均一な分散を確保し、凝集を防ぎました。この予備懸濁液の最終濃度は 30 mg/mL です。121°Cで30分間オートクレーブ滅菌して滅菌します。毎回使用する前に、沈殿した粒子を再懸濁するために、再び2〜3分間渦を巻き、振とうする必要があります。

マウスは鼻からシリカ懸濁液を吸入しました。マイクロピペットを使用して、溶液をマウスの鼻腔にゆっくりと滴下的に導入しました。マウスを6つのグループに分け、各グループに20匹のマウスを分けました。各グループの吸入量は、10 μL、30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、200 μL、濃度 30 mg/mL で、1 日 1 回、連続 40 日間投与しました。灌流するときは、左手の親指と人差し指でマウスの耳の後ろの皮膚をつかみ、他の指でマウスの胴体と尻尾を固定します。マウスが仰臥位にあり、頭をわずかに後ろに傾けて、懸濁液が自然に気道に吸い込まれるようにします。マウスでは10 μL、30 μL、50 μL、70 μLのシリカ懸濁液を吸入して2日目に死亡事象は見られなかったのに対し、マウスでは90 μLと200 μLのシリカ懸濁液を吸入して2日目以降に死亡事象があることがわかりました。したがって、マウスにおけるシリカ吸入の最大量は1日あたり70μLでした。

結晶性シリカを取り扱うときは、バイオセーフティキャビネットまたはヒュームフード内で行う必要があり、プロセス全体を通してN95マスク、防塵ゴーグル、ニトリル手袋、および保護服を着用する必要があります。サスペンションを準備するときは、動きは穏やかで、エアロゾルの発生を避けるために計量チャンバーを使用する必要があります。すべてのシリカ接触廃棄物は、耐穿刺性を備えた密閉容器に収集し、有害化学廃棄物の規制に従って廃棄する必要があります。一般ごみと混ぜたり、下水道に流したりすることは固く禁じられています。細胞培養培地などの生物学的廃棄物は、消毒剤の入った特別なゴミ箱に収集し、高圧下で滅菌する必要があります。動物の死骸と組織は生物学的廃棄物バッグに入れ、無害な処理のために高圧で滅菌する必要があります。

シリカ誘導マウスモデルの成功を評価します。シリカ吸入後のさまざまな時点で動物を評価します、すなわち3日目、14日目、および40日目。マウスを専門的な動物安楽死装置に入れ、二酸化炭素を30%〜50%の体積/分の充填速度で導入しました。彼らは呼吸が止まるまで被ばくし続けた。死亡を確認した後、その後の手術が行われた。肺組織は切除されました。肺組織を室温で4%パラホルムアルデヒド溶液に48時間固定した。固定後、組織をグラジエントアルコールで脱水し、キシレンで透明にしてからパラフィンに包埋しました。連続切片は、その後の組織学的染色および免疫組織化学的分析のために、厚さ4〜5μmのパラフィン切片機を使用して作成されました。肺組織は脱灰処理を必要としません。モデル生成の成功を評価するために、肺組織の病理学的検査が実施されました。珪肺症モデル構築の成功基準は、重大な肺炎症、線維症、珪肺結節の発生でした。

シリカ誘導マウスモデルにおける免疫細胞浸潤の解析
シリカ吸入後14日目のマウスの肺組織を、CD3e(希釈比1:200)、CD8a(希釈比1:200)、CD86(希釈比1:200)、F4/80(希釈比1:200)、Nk1.1(希釈比1:200)を含む蛍光マーカーで染色し、免疫細胞を可視化しました。細胞または組織切片を固定し、5%ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロックして、非特異的結合を減らします。ブロッキング抗体と同じ種由来の正常血清を使用し、血清をPBSで1:10の比率で希釈し、希釈血清100 μLをサンプルに加えます。次に、室温で30分間ブロックして、血清が内因性抗体をブロックできるようにします。密封後、PBSで2回優しくすすいでください。CD3e(1:200希釈比)、CD8a(1:200希釈比)、CD86(1:200希釈比)、F4/80(1:200希釈比)、およびNk1.1(1:200希釈比)を含む一次抗体を、4°Cまたは室温で1〜2時間一晩インキュベートしました。PBSで洗浄した後、蛍光二次抗体を添加し、暗所で1時間インキュベートした。

マッソン染色と免疫組織化学分析
パラフィン切片をキシレンで脱蝋し、グラジエントアルコールで水和させ、pH 6.0のクエン酸ナトリウム緩衝液中で高圧熱修復により抗原回収を行いました。高圧熱修復のために、修復バッファーに浸した組織スライスを電子レンジに中火で8〜12分間置きます。内因性ペルオキシダーゼ活性を3%過酸化水素溶液で20分間ブロックし、次に非特異的結合部位を室温で5%BSAで30分間ブロックしました。一次抗体 NRF2 (1:200)、 CDK1 (1:400)、および VDAC1 (1:500)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 PBSで3回洗浄した後、HRP標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500)を加え、室温で1時間インキュベートします。パラフィン切片を DAB 染色、ヘマトキシリン対比染色、脱水透明性、および中性ゲル シーリングにかけ、対応する分子免疫組織化学結果を取得しました。DABを発色に使用する場合、適度な発色は茶色がかった黄色から茶色がかった茶色で、背景は明確でなければなりません。過剰な(濃い茶色)と不十分な(淡黄色)の発色はどちらも、発色時間の最適化が必要です。

肺線維症の程度は、アシュクロフトスコアリング法を使用して半定量的に分析されました15: マッソン染色切片を 100 倍倍の顕微鏡で観察し、肺組織をランダムに 8 つの領域に分割しました。各領域は線維症の程度(0〜8点)に応じて採点され、最終スコアはすべての領域の平均です:0点(正常な肺組織)、1〜2点(軽度の線維症)、3〜4点(中等度の線維症)、5〜8点(重度の線維症)。

免疫組織化学的結果は、画像ソフトウェアを使用して定量的に分析されました。5つの高倍率フィールドをランダムに選択し、タンパク質発現レベルの指標として各フィールドの平均光学密度値(MOD)を測定しました。

RAW264.7細胞におけるオートファジーとROSに対するシリカとML385の影響を調べる
RAW264.7 細胞と A549 細胞 (安徽科学技術大学から提供) の両方を、10% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン二重特異性抗体溶液を添加した DMEM 高グルコース培地を使用して培養しました。1 x 107細胞を、37°Cおよび5%CO2の恒温インキュベーターで均一に培養しました。5 μLの30 mg/mLシリカ懸濁液を1 x 105細胞/mLのRAW264.7細胞に添加しました。24時間インキュベートした後、細胞をPBS 3xですすぎ、オートファジーと酸化ストレスをROS、LC3、およびリソソームプローブによって検出しました。同時に、NRF2の阻害剤であるML38516を使用して、NRF2の発現を阻害しました(ML385の最終濃度:5 mM/L)。オートファジーと酸化ストレスは、上記の実験ステップに従って検出されました。2 つのグループの酸化ストレスとオートファジーの流れを統計的に分析しました。

肺腺癌組織における VDAC1,CDK1,p62, および NRF2 発現の免疫組織化学的分析
VDAC1、CDK1、p62、およびNRF2の発現を30人の患者でチェックしました。肺腺癌の組織と隣接する健康な組織は、南京医科大学付属淮安第一人民病院から採取され、免疫組織化学 (IHC) によって分析されました。IHC と肺線維症の結果を統計的に分析しました。病院システム内の患者情報に従って患者データを収集します。具体的な実験手順は次のとおりです。パラフィン切片をキシレンで脱ワックスし、勾配アルコールで水和させ、pH 6.0のクエン酸ナトリウム緩衝液中で高圧熱修復により抗原修復を実施しました。内因性ペルオキシダーゼ活性を3%過酸化水素溶液で20分間ブロックし、次に非特異的結合部位を室温で5%BSAで30分間ブロックしました。一次抗体NRF2(1:200)、CDK1(1:400)、p62(1:500)、およびVDAC1(1:500)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 PBSで3回洗浄した後、HRP標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500)を加え、室温で1時間インキュベートします。DAB発色、ヘマトキシリン対比染色、脱水透明、中性ガムシーリング。DABを発色に使用する場合、適度な発色は茶色がかった黄色から茶色がかった茶色で、背景は明確でなければなりません。過剰な(濃い茶色)と不十分な(淡黄色)の発色はどちらも、発色時間の最適化が必要です。

細胞遊走および浸潤解析
肺腺癌細胞株A549とインキュベートした後の細胞遊走および浸潤に対するシリカとRAW264.7細胞の同時インキュベーションによるML385および上清の効果が研究されました。シリカと24時間共培養したRAW264.7細胞の上清をA549細胞に添加した。細胞をシリカ群、シリカ+ML385群、PBS群に分けた。シリカ群:5 μLの30 mg/mLシリカ懸濁液を1 x 105 細胞/mLのRAW264.7細胞に添加しました。24時間インキュベートした後、後で使用するために細胞上清を取り除きます。シリカ+ML385群:5 μLの30 mg/mLシリカ懸濁液および最終濃度5 mM/L ML385を、RAW264.7細胞の1 x 105 細胞/mLに添加しました。24時間インキュベートした後、後で使用するために細胞上清を取り除きます。PBS群:5 μLのPBSをRAW264.7細胞の1 x 105 細胞/mLに添加しました。24時間インキュベートした後、後で使用するために細胞上清を取り除きます。スクラッチアッセイ中に、A549細胞を最初にウェルあたり5 x 105 の密度で12ウェルプレートに播種しました。細胞が95%〜100%融合に成長した後、200 μLの滅菌ピペットの先端を使用して単層細胞に傷を付けました。剥離した細胞をPBSで優しく洗い流しました。その後、7日間の実験期間中、細胞生存率を維持するために、1%FBS塩基性培地と各処理群の上清を含むように培養条件を変更しました。同じ位置の画像を、引っかき傷後 0 時間 (0 日目) と 7 日目 (7 日目) にそれぞれ倒立顕微鏡下で収集しました。最後に、スクラッチ領域を定量的に分析し、ImageJ ソフトウェアを使用してスクラッチ閉鎖率を計算し、A549 細胞の遊走能力に対するさまざまな治療群の上清の影響を評価しました。

細胞通過孔の特定のサイズの浸潤アッセイでは、8 μm のポリカーボネート膜チャンバーを使用し、上部チャンバー膜に細胞外環境をシミュレートしたゲルをプレコートして基底膜バリアを構築し、1:8 の比率で希釈しました。A549細胞を、無血清培地と各処理群の上清を1:1の比率で混合して作った懸濁液に再懸濁し、上部チャンバー(チャンバーあたり2×104 細胞)に接種した。下部チャンバーでは、20%FBSを含む培地と、対応する処理群(シリカ+ML385群、シリカ群、PBS群)の上清を同じ割合で混合して作った溶液を化学誘引剤として添加した。対応する処理群の上清は、シリカのRAW264.7細胞食作用でピペットガンを吸引することによって収集されました。細胞を37°Cおよび5%CO2 で7日間連続インキュベートした後、上部チャンバー内の非侵襲性細胞を綿棒で除去し、膜を貫通して下部チャンバーに到達した細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1%クリスタルバイオレットで染色しました。最後に、浸潤細胞の数を光学顕微鏡で5つの視野からランダムに選択しました。

フローサイトメトリーを用いたA549細胞のアポトーシスに対するシリカとML385の影響の解析
細胞の調製とグループ化:各処理群(PBS群、シリカ群、シリカ+ ML385群)の上清で処理したA549細胞を採取した。細胞を予冷したPBSで2回穏やかに洗浄し、次に1x結合バッファーに再懸濁し、細胞密度をチューブあたり1 x 106 細胞/ 100 μLに調整しました。次に、5 μLのアネキシンV-FITCと5 μLのPI染色液を細胞懸濁液に添加し、穏やかにボルテックスして混合し、室温で暗所で15分間インキュベートしました。インキュベーション後、400 μLの1x結合バッファーを各チューブに添加し、すぐに機械でテストしました。検出はフローサイトメーターを使用して行いました。488 nm レーザーによって励起され、アネキシン V-FITC の蛍光シグナルは FITC チャネルを介して収集され、PI の蛍光シグナルは PE チャネルを介して収集されました。実験前に、スペクトルの重複を排除するために、蛍光補正調整に単一染色サンプルを使用しました。データ解析を行うときは、まずFSC-A/SSC-A散布図で標的細胞集団を描写し、フラグメントを除去します。続いて、FSC-H/FSC-A散布図を使用して細胞癒着を除外しました。最後に、生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス/壊死細胞、および機械的に損傷した細胞を区別するためのゲートが設定されました。データは、FlowJo V10 ソフトウェアを使用して取得および分析されました。

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結果

シリカマウスモデル
図1では、マウスにシリカを30 mg/mLおよび70 μLの用量で40日間連続して鼻腔内投与したところ、マウスに死亡事象は発生せず、シリカマウスモデルの確立に成功しました。一方、PBSによるマウス強制経口投与を陰性対照として使用した。目的は、操作と溶媒自体の影響を排除し、表現型がシリカによって特異的に誘導されるようにすることでした。このシリカ誘発性肺損傷モデルの複製の成功は、悪性進行と薬物介入のメカニズムに関するその後の研究に必要な in vivo 基盤を提供します。

シリカ誘導マウスの結節における免疫細胞浸潤の解析
図2では、シリカマウスの結節における免疫細胞浸潤を検出することにより、結節内に多数の免疫細胞浸潤(CD3e+、CD8a+、CD86+、F4/80+、およびNk1.1+細胞)があり、シリカ肺疾患の形成と発症に関与していることがわかりまし...

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ディスカッション

肺腺癌は、世界中でがん関連死亡の主な原因の 1 つであり、その発生率と死亡率は17 年ごとに増加しています。シリカは国際がん研究機関によってクラス 1 のヒト発がん物質に分類されており、肺腺がんのリスクは累積的な職業曝露とともに増加します 18,19,20,21。以前の研究では、シリカが酸化ストレスと慢性炎症を引き起こすことによって肺線維症を活性化する可能性があり、NRF2シグナル伝達経路が酸化損傷に重要な役割を果たしていることが証明されています12,22,23。それ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究へのサポートと貢献に感謝します。この研究は、安徽省高等教育機関の産業粉塵深部低減および労働安全衛生の主要研究所(NO.AYZJSGXLK202202006)、上海浦東新区人民病院人材導入スタートアップ基金(NO.PRYYH202501)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ベイヨゴールド・トランスウェルビヨタイム・バイオテクノロジー FTW067-48LNSトランスウェル
CD3eBD バイオサイエンス561827FITC ハムスター アンチマウス CD3e(145-2C11)
CD86BD バイオサイエンス105013CD86
CD8aBD バイオサイエンス100713CD8a
CDK1アブカムab133327アンチCDK1
細胞アポトーシス検出キットビヨタイム・バイオテクノロジー C1062Lアポトーシス検出
ダピビヨタイム・バイオテクノロジー P0131-25mlダピ
埋め込み機P.S.JメディカルBM450A埋め込み機
F4/80BD バイオサイエンス123109F4/80
完全自動組織脱水機ライカ・バイオシステムズASP3005完全自動組織脱水機
ガラス顕微鏡スライドシトテスト250124A1ガラス顕微鏡スライド
H&E染色ビヨタイム・バイオテクノロジー C0105MH&E染色
IHCキットアブシン・バイオテクノロジーABS996-5mlIHCキット
LC3プローブビヨタイム・バイオテクノロジー C3018MLC3プローブ
ロープロファイルミクロトームブレードサーモ・フィッシャー3052835ロープロファイルミクロトームブレード
リソソームプローブビヨタイム・バイオテクノロジー C1046リソソームプローブ
マーカーペンデリSK109マーカーペン
マッソン染料ビヨタイム・バイオテクノロジー C0189Mマッソン染料
マトリックス・ゲルビヨタイム・バイオテクノロジー C0371-5mlマトリックス接着剤
ミクロトームライカ・バイオシステムズHistoCore BIOCUTミクロトーム
ML385アブカムAB287109NRF2阻害剤
NK1.1BD バイオサイエンス561117NK1.1
NRF2アブカムab1809Y反NRF2
p62アブカムAB20735アンチp62
パラフィンワックスソーラービオYA0012パラフィンワックス
活性酸素種の分析キットビヨタイム・バイオテクノロジー S0033MROSプローブ
シリカシグマ・オルドリッチS5631結晶性シリカ
VDAC1アブカムAB34726アンチVDAC1

参考文献

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