方法論記事

抗ウイルス薬スクリーニングのためのアルファウイルス感染の定量的蛍光イメージング

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DOI：

10.3791/69384

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2026年8月14日

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、アルファウイルス感染を連続的に可視化するための、堅牢で適応性の高いプロトコルを提示します。このプロトコルは、蛍光イメージングに基づき、細胞レベルでアルファウイルスの複製を調査し、抗ウイルス化合物の有効性を評価するための手法を提供します。

要約

蛍光顕微鏡法は、細胞レベルでのアルファウイルス感染を調査するための、非常に感度が高く汎用性のあるアプローチを提供します。蛍光標識ウイルスと定量的な画像解析を組み合わせることで、本法は複製キネティクスのわずかな差異や細胞間伝播の検出を含む、感染ダイナミクスの詳細な空間的および時間的特性評価を可能にします。本プロトコルの中心的な目的は、抗ウイルス剤スクリーニングアッセイへの応用です。蛍光強度の画像ベースの定量化は、抗ウイルス化合物の有効性を評価するための堅牢で再現性のある手段を提供し、感染細胞における抑制効果を早期かつ高感度に検出することを可能にします。これにより、有望な抗ウイルスヒット化合物の特定が促進され、用量依存的な反応の評価がサポートされます。また、複製挙動や拡散パターンの変動が容易に明確になるため、このアプローチは異なるアルファウイルス株や変異体の比較研究にも適しています。その柔軟性、複数の細胞株への適合性、および自動画像プラットフォームへの容易な統合により、本法は拡張性があり、ハイスループットスクリーニングキャンペーンに適しています。総じて、本プロトコルは抗ウイルス戦略の発見と評価を前進させるものです。いくつかのアルファウイルスは、ヒトや動物に重大な疾患を引き起こし、承認された抗ウイルス療法がなく、新興のアウトブレイクに伴い地理的に拡大し続けているため、新規抗ウイルス剤の特定は依然として急務となっています。したがって、この蛍光ベースのワークフローは、現代のアルファウイルス研究において価値あるタイムリーな貢献となります。

概要

アルファウイルスは、Togaviridae科に属するエンベロープを有する正鎖一本鎖リボ核酸（RNA）ウイルスである1,2,3。主に蚊によって媒介され、ヒトや動物にさまざまな疾患を引き起こす。アルファウイルス属には、チクングニアウイルス（CHIKV）、シンドビスウイルス、東部馬脳炎ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルスなど、医学的に重要なウイルスがいくつか含まれている4,5。これらの病原体は、発熱性疾患や発疹から重篤な神経学的合併症まで、幅広い症状を引き起こす6。懸念すべき点として、CHIKVが主要な公衆衛生上の問題として再浮上している。2025年に入っただけでも、14カ国で220,000件以上の症例が報告され、少なくとも80人の死亡者が発生している7。致死率は低いものの、感染者の相当数が慢性的な関節痛を発症し、それが長期的な障害や可動性の低下につながる可能性がある8。標的を絞った抗ウイルス戦略を開発するためには、アルファウイルスの複製および宿主・病原体相互作用についてより包括的な理解が不可欠である。一方で、セミリキフォレストウイルス（SFV）のような一部のアルファウイルスは、より毒性の強いアルファウイルスと遺伝的・構造的に高い類似性を共有しているにもかかわらず、ヒトに対する病原性は低い。そのため、SFVはヒトの健康へのリスクを抑えつつアルファウイルスを研究するための理想的なモデルとなっている9,10,11。

プラークアッセイ、50%組織培養感染量（TCID50）測定、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析などの従来のアッセイは、ウイルス力価や遺伝子発現の定量化に有用ですが、エンドポイント測定に限定されており、細胞の溶解または固定が必要です。その結果、同一細胞内における感染のダイナミクスを時間経過とともに直接的に捉えることはできません12,13。これらの制限に対処するため、リアルタイム蛍光イメージングは、複数のタイムポイントにわたる感染キネティクスをモニタリングするための強力で非破壊的なアプローチを提供します。mCherry標識SFVなどの蛍光タグ付きウイルスを用いることで、生細胞内におけるレポーターウイルスのシグナルと拡散を直接的に可視化し、定量化することが可能になります14,15。ここで述べる実験では、アルボウイルス研究で一般的に使用される細胞株を用いました。Aedes albopictus幼虫由来のU4.4細胞は、多くのアルボウイルスの効率的な複製をサポートし、ベクターとウイルスの相互作用に関する研究を促進する蚊由来の細胞です16,17。並行して、ベビーハムスター腎臓組織由来の線維芽細胞様哺乳類細胞株であるBHK-21細胞は、ウイルスの増殖や分子ウイルス学的なアッセイに頻繁に使用される、許容性の高い脊椎動物宿主システムを提供します18。

本プロトコルでは、フリン阻害剤を例に、ウイルスレポーター発現のモニタリングおよび抗ウイルス化合物の特性評価について詳細に記述します。フリンは多くの真核生物に存在するプロタンパク質変換酵素であり、成長因子、ホルモン、マトリックスメタロプロテアーゼ、血漿タンパク質、および受容体の前駆体の活性化において重要な役割を果たしています。19,20多くのアルファウイルスは、表面タンパク質を切断・活性化するためにフーリンを利用しており、これはウイルスの複製を成功させるための極めて重要なステップである。20Furin阻害剤は、Furinの活性を阻害するように合成設計された化合物であり、これにより ウイルス複製の抑制21,22,23セルイメージング・マルチモードリーダーを用いた、アルファウイルス感染の自動蛍光顕微鏡分析に関する標準的なプロトコルは限られているため、Aedes cellsにおける抗ウイルス化合物の特性評価のための詳細なワークフローを提示する。本プロトコルでは、細胞培養、ウイルス産生、感染、抗ウイルス化合物（フリン阻害剤）による処理、蛍光イメージング、および画像解析の手順を概説する。なお、ここに記載した手法は、他のウイルスや代替の蛍光ラベルにも容易に適用可能である。

プロトコル

1. バイオセーフティ

注意：本プロトコルで使用されるリコンビナントmCherryタグ付きセミリキフォレストウイルス（SFV-mCherry）は、遺伝子組換え体です24,25,26。蛍光レポーター遺伝子の導入により、これは遺伝子組換え生物に分類され、追加の封じ込め措置および規制要件の対象となります。他のアルファウイルス、特にCHIKVなどのより病原性の高いウイルスを扱う場合は、さらなる封じ込め措置および許可が必要となる場合があります。

  1. ウイルスアッセイの前後に、適切な消毒剤を用いてバイオセーフティキャビネットを清浄し、少なくとも 30 min 間 UV 照射を行う。
  2. すべての汚染物は、地域のバイオセーフティ規定に従って廃棄する。固形廃棄物と液体廃棄物はオートクレーブ可能な容器に分けて回収し、廃棄前にオートクレーブ滅菌を行う。

2. 抗ウイルス化合物の調製

注：本研究で使用したFurin阻害剤のMI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide)、MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide)、およびMI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide)は、試験用に選定された抗ウイルス化合物の例である。Furin阻害剤のMI-1148は、細胞毒性試験では陰性対照として、抗ウイルス試験では陽性対照として使用された。

  1. 抗ウイルス化合物を適切な溶媒に溶解させる。細胞毒性を避けるため、可能な限り滅菌水を使用すること。ジメチルスルホキシドまたはメタノールは、最大2% (v/v) まで使用可能である。滅菌水を用いて10 mMのストック溶液を調製することを推奨する。
  2. メーカーによる特記がない限り、安定性と溶解性に応じて、ストック溶液を-20 °Cで保存する。

3. 細胞培養

  1. 10% fetal bovine serum (FBS)、1% MEM non-essential amino acids、1% tryptose phosphate broth、1% glutamine、および1% penicillin/streptomycin (Pen/Strep)を添加したLeibovitz's L-15 MediumでU4.4細胞を培養する（播種密度：T25フラスコあたり約1 × 106 cells、培養液量：5 mL）。細胞は28 °Cで維持する。U4.4細胞は週に1回、1:6の比率で継代するが、実験上の必要に応じて播種密度を調整すること。
    注：C6/36細胞などの他の細胞株も本プロトコルに適合する。必要に応じて、代替の培地や添加剤を使用してもよい。抗生物質の添加は任意であり、省略可能である。
  2. 10% FBS、1% glutamineまたは静的平衡、ΣFx=0、グラフ、力バランス分析、機械的安定性図。‑alanyl‑静的平衡、ΣFx=0、グラフ、力バランス分析、機械的安定性図。‑glutamine、および1% Pen/Strepを添加したDulbecco's Modified Eagle's MediumでBaby hamster kidney (BHK-21)細胞を培養する（播種密度：T75フラスコあたり約1 × 106 cells、培養液量：10 mL）。細胞は5% CO2を含む加湿インキュベーター内で37 °Cで維持する。細胞は4〜5日ごとに1:12の比率で継代し、必要に応じて播種密度を柔軟に変更する。
  3. 細胞が健全で、活発に増殖していることを確認する。

4. ウイルスの作製

  1. BHK-21細胞におけるSFV-mCherry（SFV6-2SG-mCherry）ストックの調製。
    1. 上記に記載した条件下で、透明な細胞培養用24ウェルプレートを用いてBHK-21細胞を培養する（播種密度：約1 × 105 cells/well、培養液量：500 µL）。
    2. コンフルエンシーが約90%（目標コンフルエンシー：約2 × 105 cells）に達した時点で、感染培地（1% Pen/Strepおよび0.2% 牛血清アルブミンを添加したDMEM）を用い、トランスフェクション試薬を使用してSFV6-2SG-mCherryプラスミドをBHK-21細胞にトランスフェクションする。その際、1 µLのトランスフェクション試薬を25 µLの低血清培地で希釈する。
    3. 別のチューブで、0.5 µgのプラスミドDNAと1 µLの専用添加剤を25 µLの低血清培地で希釈する。この希釈DNA溶液を、希釈したトランスフェクション試薬を含む溶液に加え、室温で15分間インキュベートする。その後、得られた複合体50 µLを細胞に添加する。
      注：特定の細胞株に適合している場合は、他のトランスフェクション試薬も使用可能であり、使用する試薬によって手順が異なる場合がある。
    4. トランスフェクションの48時間後に、ピペットを用いてウイルスを含む上清を回収し、DNA/RNAフリーチューブに250 µLずつ分注して-80 °Cで保存する。
  2. TCID50法によるタイトレーション。
    1. 上記に記載した条件下で、黒色のイメージンググレード96ウェルプレートを用いてBHK-21細胞を培養する（播種密度：約2 × 104 cells/well、培養液量：100 µL）。
    2. ウイルスの分注液を融解し、感染培地を用いてウイルスサンプルの10倍連続希釈系列を調製し（ウイルスサンプル15 µL ＋ 感染培地135 µL）、古い培地を除去した後、各希釈液100 µLを細胞に添加する。
    3. 5% CO₂含有加湿インキュベーター内にて37 °Cで1時間インキュベートし、その後、接種液を100 µLの新鮮な感染培地に交換する。
    4. 感染後48時間（hpi）に、マルチモードイメージングウェルプレートリーダー（詳細はセクション7に記載）を用いた蛍光測定によりウイルス複製を評価し、ウイルス感染による細胞変性効果を判定する。Reed-Muench法28に基づいてTCID50値を算出し、1 TCID50が0.7 PFUに相当するという標準的なポアソン近似を用いて、推定ウイルス力価（PFU/mL）に換算する。

5. 細胞毒性の判定

  1. 前述の条件下で、透明な細胞培養用96ウェルプレートを用いてU4.4細胞を培養する（播種密度：約3 × 104 cells/well、培養液量：100 µL）。
    注：蒸発の促進などのエッジ効果を避けるため、外周のウェル（A行およびH行、1列および12列）にも細胞を播種したが、実験解析からは除外した。
  2. コンフルエンシーが90%に達した時点（目標コンフルエンシー：約6 × 104 cells）で、総量100 µLのfurin阻害剤MI-1130およびMI-1131を100、50、25、12.5 µMの濃度で細胞に添加する。また、MI-1148（MI-1130およびMI-1131と同濃度）、未処理の細胞、および水で処理した細胞を陰性対照として、さらにionomycin（アッセイ中での濃度100 µM）を細胞毒性の陽性対照として添加する。
  3. 処理後48時間（hpt）に、ATP定量に基づくルミネッセンスアッセイを用いて細胞生存率を評価する。各ウェルにルミネッセンスアッセイ試薬を培養液と同量（1:1）添加し、プレートを2分間振盪して確実に細胞を溶解させた後、暗所で10分間インキュベートし、ルミネッセンスを測定する。
    注：異なる検出原理に基づく他の細胞生存率アッセイを用いることも可能である。
  4. マルチモードリーダーを用い、黒色または白色の96ウェルプレートでルミネッセンスを記録する。

6. ウイルス感染および抗ウイルス化合物による処理

  1. 上述の条件で、黒色のイメージング用96ウェルプレートにU4.4細胞を培養する（播種密度：約3 × 104 cells/well、培養液量：100 µL）。
    注：外周のウェル（A行およびH行、1列および12列）にも細胞を播種したが、蒸発の促進などのエッジエフェクトを避けるため、実験解析からは除外した。
  2. 添加剤を含まないL-15培地を用い、接種量100 µLで、SFV-mCherryを感染多重度（MOI）0.01で細胞に感染させ（標的コンフルエンシー：約6 × 104 cells）、28 °Cで1時間インキュベートする。
    注：特に非常に低いMOIでの操作や数日間にわたる感染実験を行う場合は、低継代のレポーターウイルスストックを使用する必要がある。
  3. 別の96ウェルV底プレートを用い、添加剤含有L-15培地でfurin阻害剤（MI-1130、MI-1131、およびMI-1148）を最終濃度100、50、25、および12.5 µMに希釈する。10%の余裕を持たせるため1ウェルあたり110 µLを調製し、100 µL（最終容量）を細胞に添加する。コントロールとして、抗ウイルス化合物の溶媒で処理した感染細胞、およびウイルスのみを含む感染細胞を陰性コントロールとして使用する。また、背景蛍光を測定するために、未感染・未処理の細胞も加える必要がある。
  4. 1時間の感染期間後、接種液を除去し、V底プレートから希釈したfurin阻害剤100 µLを黒色のイメージング用プレートに移す。
  5. 細胞を28 °Cでインキュベートする。

7. 生細胞蛍光イメージング、定量画像解析、およびデータの提示

  1. 蛍光顕微鏡によるウイルスレポーター発現の測定（プログラム設定については、Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6, および Supplementary Figure 7 を参照）。
    1. 感染後 24 および 48 hpi に、ウェルあたり 8 µL の細胞透過性核対比染色溶液を添加して細胞核を染色する。28 °C で 30 分間インキュベートする。
      注：感染の状態は複数のタイムポイントでモニタリング可能である。しかし、感染後 48 h での測定が最も強いシグナルが得られ（Supplementary Figure 8 を参照）、抗ウイルス効果を最も確実に評価できる。24 h または中間タイムポイントでの読み取りも可能だが、インキュベーションを 48 h 以上延長すると、細胞の過剰増殖のリスクが高まる。読み取りに選択したタイムポイントまでに細胞が過剰増殖しないよう、実験開始時に適切な細胞コンフルエンシーを選択すること。これにより、正確な細胞計数の妨げを回避できる。
    2. インキュベーション後、（透明なカバーリッドに加えて）安全のためにプレート上部を透明ビューシールフォイルで覆う。
      注：イメージングデバイスを使用する場合、正しいプレートタイプを選択することが不可欠である。照明、積分時間、およびゲインの設定は、レポーター遺伝子によって異なる。最適なパラメータを決定するために、予備測定を行うことを強く推奨する。与えられた条件下でプロトコルを確立するために使用した初期の照明、積分、およびゲインの設定は、プログラム設定が詳細に説明されている Supplementary Figure 2 に記載されている。
    3. マルチモードリーダーを用い、イメージステッチング（1ウェルあたり 4x 倍率で 4 フィールド）を使用して、ウェル全体の画像を取得する。
    4. Texas Red フィルターキューブ（励起：586/15 nm、蛍光：647/57 nm）を使用して、赤色蛍光強度を測定する。
    5. 以下の設定を用いた DAPI チャネルにより、総細胞数を決定する（励起：377/50 nm、蛍光：447/60 nm）。
  2. 定量的画像解析（生データについては Supplementary Table 1 を参照）。
    注：蛍光測定にはマイクロプレートイメージングリーダーを使用した。このアッセイに使用した詳細なパラメータは Supplementary Figure 2 に記載されている。
    1. 適切なイメージングソフトウェアを使用して画像を処理する。
    2. データリダクションパネルで Image Stitching を選択し、DAPI チャネルと Texas Red チャネルを統合して、ウェルから単一の画像を作成する。
    3. Image Statistics を追加し、Texas Red Stitched チャネルの Total intensity を選択する。DAPI Stitched チャネルから背景ノイズを除去するために Image Preprocessing を適用する。
    4. 前処理済みの DAPI Stitched チャネルに対して Cellular Analysis を実行する。
    5. 各処理ウェルの平均蛍光から非感染・未処理のコントロールウェルの平均蛍光を差し引き、その結果を対応するウェルの総細胞数で割ることで、1細胞あたりの平均赤色蛍光強度を算出する。
  3. トラブルシューティング
    1. 測定中、特に長時間のイメージング測定や温度感受性プレートを使用する場合は、フォーカスの安定性をモニタリングする。
    2. フォーカスのドリフトが観察された場合は、オートフォーカスを有効にし、オートフォーカスの頻度を上げる。ドリフトが解消されない場合は、取得速度を下げるか、イメージング前にプレートを装置の温度に慣らす。
    3. 取得中のシグナル品質を一定に保つため、イメージンググレードのプレートを使用する。過剰な照明や長い積分時間を避け、ブリードスルーや過露光を防止する。
    4. シグナルの飽和が解消されるまで、励起強度を下げる、積分時間を短縮する、またはゲインを下げて調整する。蛍光色素チャネルが十分に分離していることを確認し、必要に応じてフィルター設定を調整する。
      注：DAPI と mCherry の間のブリードスルーは通常低いが、使用するレポーター構築物（例：GFP）によって異なる。
    5. 適切な感染キネティクスとアッセイ感度を維持するため、細胞の過剰コンフルエンシーを避ける。過剰コンフルエンシーが生じた場合は、測定前のインキュベーション時間を短縮する。
    6. 特に高濃度において、細胞生存率およびシグナル品質への染料関連の影響をモニタリングする。染料による毒性や背景の過飽和が観察された場合は、染料濃度を下げるかインキュベーション時間を短縮する。
    7. シグナルの安定性を維持するため、メーカーの推奨に従って染料を調製および保存する。

結果

本研究では、マルチウェルプレート形式の蛍光顕微鏡を用いてアルファウイルスの拡散をモニタリングし、抗ウイルス化合物（例：フリン阻害剤）を評価するための詳細なプロトコルを提示します。ウイルスレポーター発現に対する抑制効果の可視化を実証するため、以前に合成された3種類のフリン阻害剤（MI-1148、MI-1130、MI-1131）を選択し、aedine細胞株U4.4を用いて試験を行いました。実験ワークフローの概要を図1に示します。

抗ウイルス efficacy を評価する前に、ウイルス複製能の低下が化合物による細胞死に起因するものではないことを確認するため、細胞毒性を評価することが不可欠である。そこで、コンフルエンシー 90% の U4.4 細胞に、100, 50, 25, または 12.5 µM の阻害剤を処理した。未処理の細胞および水（溶媒コントロール）で処理した細胞を陰性コントロールとし、イオノマイシンを陽性コントロールとして用いた。細胞生存率は、処理 48 時間後に ATP 定量に基づくルミネッセンスアッセイを用いて評価した。テストした furin 阻害剤において、細胞生存率の有意な低下は見られなかった (図 2)。

細胞毒性が認められなかったため、次にこれらの化合物の抗ウイルス活性を評価した。このため、U4.4細胞にSFV-mCherryを1時間感染させた後、同濃度の同様のフリン阻害剤で処理した。感染させ未処理の細胞および感染させ水で処理した細胞を抗ウイルス活性の陰性対照とし、未感染かつ未処理の細胞をバックグラウンド蛍光の評価に使用した。処理後48時間で、蛍光顕微鏡を用いてウイルスレポーターの発現量を定量した。イメージングの前に、各ウェルに8 µLの細胞透過性核対比染色溶液を加え、30分間インキュベートして細胞核を染色した。処理済みの蛍光画像から、ウイルスレポーターの発現に対応する赤色蛍光信号と核の総数を定量した。テストした阻害剤の中で、MI-1148は強力な抗ウイルス活性を示し、用量依存的にウイルスレポーターの発現を有意に減少させた(図3)。対照的に、MI-1130およびMI-1131は、テストしたどの濃度においてもウイルスレポーターの発現に対する顕著な抑制を示さなかった。抗ウイルスアッセイの生データおよび解析結果は、付録表1に記載している。

代表的な結果は、MI-1148で見られたレポーターシグナルの大幅な減少に示されるように、本プロトコルが抗ウイルス活性を持つ化合物を確実に同定できることを実証しています。対照的に、阻害剤であるMI-1130およびMI-1131はレポーターの発現を減少させませんでした。これは、ピコモルレベルの阻害定数に反映される強力なfurin阻害能があっても、今回の条件下では抗ウイルス活性に結びつかなかったことを示しています（図 4）。これらの知見は、活性化合物と不活性化合物を区別し、強力かつ適切なリード構造の同定を支援する本アッセイの能力を強調するものです。

抗ウイルススクリーニングプロセス；細胞培養、ウイルス感染、化合物処理；データ解析チャート。
図1: 実験ワークフロー。aedine細胞株U4.4におけるフリン阻害剤の抗ウイルス活性を評価するために用いられた実験手順の概略図。ワークフローには、化合物の調製、細胞の播種、mCherryタグ付きセミリキフォレストウイルスの感染、化合物処理、リアルタイム可視化のための蛍光顕微鏡観察、およびウイルスレポーター発現の定量化が含まれる。このイラストはBioRenderを用いて作成された。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

細胞生存率の棒グラフ、薬剤濃度の比較。MI-1148、MI-1130、MI-1131処理。
図2: U4.4細胞におけるフリン阻害剤の細胞毒性効果。 合流度が約90%に達したU4.4細胞に、100、50、25、および12.5 µMのMI-1148、MI-1130、およびMI-1131を処理した。未処理の細胞および水で処理した細胞を陰性対照とし、イオノマイシン (100 µM) を陽性対照とした。処理から48時間後に、ATP定量により細胞生存率を評価した。データは未処理の対照群に対して正規化し、パーセント (%) で表示した。平均細胞生存率 (n=3) を示し、エラーバーは変動係数を表す。点線は80%に設定した細胞毒性のカットオフ値を示す。n.d. = 検出限界以下。データ作成にはGraphPad Prism v9.5.1を使用した。こちらのリンクから、本図の拡大版をご覧いただけます。

細胞の赤色強度と薬剤濃度の棒グラフ。MIシリーズ化合物の統計解析。
図 3: aedine細胞株U4.4におけるmCherryタグ付きセムリキフォレストウイルス（SFV）に対するフリン阻害剤の抗ウイルス活性。 合流度が約90%に達した時点で、細胞をSFV-mCherryで1時間感染させ、続いてMI-1148、MI-1130、およびMI-1131を100、50、25、および12.5 µMで処理した。処理後48時間で、蛍光顕微鏡を用いてウイルスレポーターの発現を定量化した。イメージングの前に、細胞透過性核対比染色溶液 8 µLを各ウェルに添加し、30分間インキュベートして細胞核を染色した。蛍光画像は、ウイルス信号にTexas Redフィルターを、核にDAPIフィルターを使用して取得した。画像解析を行い、総赤色蛍光強度（ウイルス複製を示す）とウェルあたりの総細胞数を定量化した。データ（n = 4）は、細胞あたりの総赤色強度（総ウイルス信号 / 総細胞数）として提示している。エラーバーは標準偏差を表す。SFV感染コントロールと比較した統計的有意性は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびDunnettの多重比較検定を用いて算出した：**** = P<0.0001; ns = P>0.05。データの提示および統計解析はGraphPad Prism v9.5.1を用いて行った。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

異なる濃度でSFVに感染させた細胞培養の顕微鏡画像。感染レベルを示している。
図 4: アエディネ細胞株U4.4における、mCherryタグ付きSemliki Forest virus (SFV)に対するフリン阻害剤の抗ウイルス活性を示す代表的な蛍光画像。 コンフルエンシーが約90%の細胞にSFV-mCherryを1 h感染させた後、100, 50, 25, および 12.5 µMの濃度のMI-1148, MI-1130, および MI-1131で処理した。感染させ未処理の細胞および感染させ水で処理した細胞を陰性対照とし、未感染かつ未処理の細胞をバックグラウンド対照とした。レポーターシグナルは、処理後48 hにTexas Redフィルターを用いてmCherryシグナルをキャプチャする蛍光顕微鏡により評価した。スケールバー = 2000 µm。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足表1：ウイルス信号の総強度および細胞数の生データ。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図1：代表的な結果を得るためにイメージングリーダーで使用した手順ステップ。 まず、U4.4細胞の培養条件に合わせた温度設定（赤）を行う。次に、DAPI、Texas Red、および明視野の測定を行うための3つの独立した画像アクションステップ（オレンジ）を実行する。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図2：代表的な結果を得るためにイメージングリーダーの手順ステップで使用した画像設定。 最初に変更する設定は、倍率（4x）および画像サイズ（Full WFOV）です。測定する蛍光色素を選択し、照明（Illumination）、積分時間（Integration time）、およびゲイン（Gain）のパラメータを適宜変更する必要があります。最後に、イメージモンタージュ（2x2）およびオーバーラップ（30 µm x 30 µm）を選択します。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図3：代表的な結果を得るためにイメージリーダーで用いられたデータ削減ステップ。 最初のステップは、DAPIおよびTexas Redチャネルの画像ステッチング（青）である。次に、画像統計（紫）により全強度の測定値が得られる。その後、DAPIチャネルから背景ノイズを除去するために画像前処理ステップ（緑）が必要となる。最後に、前処理済みのDAPIステッチ画像に対して細胞解析（黄）が行われる。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

付随図4：代表的な結果に用いられたイメージリーダーのデータ削減ステップにおける画像ステッチング。最も重要な設定は最終画像のダウンサイジング（80%）であり、この値が低いと画像の解像度に影響し、その結果、パラメータの最終測定値に影響を与えるためである。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図5：代表的な結果のイメージリーダーに使用されたデータ削減ステップにおける画像統計。 正しいチャネル（Stitched: Fluorophore）を選択し、最小しきい値（2500）を設定し、最後に測定パラメータ（Total Intensity）を選択することが重要です。より正確な測定を行うには、Image Plugを作成することが可能です。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図 6：代表的な結果を得るためにイメージリーダーで用いたデータ削減ステップにおける画像前処理。 最も重要な設定はローリングボールパラメータ（30 µm）であり、微細な結果を優先しています。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図7：代表的な結果を得るためにイメージリーダーで使用したデータ削減ステップにおける細胞解析。 画像の前処理が済んでいるチャンネルを選択することが重要です。「接触しているオブジェクトを分割する」および「マスクで穴を埋める」を選択してください。オブジェクト選択の適切な範囲（5-50 µm）。最後に、精緻な結果を得るために、イメージプラグを作成することができます。 こちらをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。

補完図 8：aedine細胞株U4.4におけるmCherryタグ付きセミリキフォレストウイルス（SFV）に対するフリン阻害剤の抗ウイルス活性。 細胞が約90%のコンフルエンシーに達した時点で、SFV-mCherryを1時間感染させ、続いてMI-1148、MI-1130、およびMI-1131を100、50、25、および12.5 µMで処理した。処理後24時間（赤色のバー）および48時間（緑色のバー）において、蛍光顕微鏡を用いてウイルスレポーターの発現量を定量化した。エラーバーは標準偏差（n = 4）を示す。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

アルファウイルスの複製をリアルタイムで観察できる能力は、従来のエンドポイント試験に対して、逐次的かつ累積的な視点を提供します。このマルチタイムライブセルイメージングプロトコルは、ウイルスの拡散を観察するためのダイナミックなプラットフォームを提供するため、アルファウイルスの研究における有用なモデルとなります。

このプロトコルの成功は、いくつかのパラメータに依存します。まず、細胞死による偽陽性の結果を排除するために、抗ウイルスアッセイの前に化合物の細胞毒性を評価することが重要です。細胞毒性効果の評価が完了した後、化合物の抗ウイルス活性を評価することができます。本試験化合物では、細胞毒性は観察されませんでした。MI-1130およびMI-1131はウイルスレポーターの発現に有意な影響を与えませんでしたが、ポジティブコントロールとして使用したMI-1148はこれを効果的に抑制しました。さらに、細胞播種に対する感染のタイミングが極めて重要です。過剰増殖を避けつつ、再現性のある感染を確実にするために、細胞が適切なコンフルエンシーに達している必要があります。また、細胞生存率を損なうことなく緩やかな感染を観察するために、細胞株に応じて感染多重度（MOI）を最適化することも重要です。最後に、大きな飛躍なく緩やかなウイルスレポーターの発現を可視化できるように、画像取得の頻度を慎重に決定する必要があります。ほとんどのアプリケーションにおいて、例えば8時間ごとに画像を取得することで、時間的な詳細さとサンプルの完全性の間で効果的なバランスを得ることができます。

本プロトコルの最大の長所はその適応性の高さにあります。本実験では、SFV-mCherryとU4.4細胞を用いて、フリン阻害剤による処理後のウイルスレポーター発現のモニタリングおよび抑制を実証しました。しかし、このプロトコルは、GFPなどの異なるレポーターマーカーを持つ他のウイルスの蛍光分析や、初代細胞や分化細胞株を含む他の宿主細胞タイプに合わせて最適化することが可能です。本プロトコルは感染後の化合物処理に焦点を当てていますが、抗ウイルス作用のメカニズムをさらに探索するために、前処理、共処理、感染直後の処理、または遅延処理などの添加タイミング試験（time-of-addition experiments）にワークフローを容易に適合させることもできます。本プロトコルは、当初C6/36細胞とU4.4細胞のRNAi機構の機能性を比較するために使用されました14。その後、ウイルスを直接標的とするdsRNAがどのようにウイルスレポーター発現を抑制するかを検討するためにさらに拡張されました15。

本プロトコルの実施において、いくつかの潜在的な課題が生じる可能性があります。レポーターウイルスは、in vivo29およびin vitro30の数多くのアプリケーションで非常に有用ですが、毒性が低下したり31、レポーター遺伝子の遺伝的不安定性が生じたりすることがあります32。また、細胞が過剰にコンフルエントになると細胞剥離が起こり、明確な可視化やイメージングが妨げられるため、細胞数に影響を及ぼす可能性があります。生細胞染料（核染色のためのHoechst 33342など）への長時間曝露は、細胞の挙動や生存能を変化させる恐れがあります15。さらに、CHIKVなどの病原性の高いアルファウイルスを用いる実験では、より高度なバイオセーフティ対策と、それに合わせたプロトコルの調整が必要となる場合があります。加えて、プレートの個体差や異なる種類のプレートの使用により、焦点ドリフトが観察されることがあります。例えば、透明な細胞培養プレートでは、蛍光信号がウェルから隣接するウェルへ漏れ出すことがあり、白プレートでは過剰曝露が生じることがあります。いずれの場合も、蛍光信号の測定精度に影響します。

このプロトコルは、従来のウイルス学的アッセイに比べていくつかの利点があります。例えば、プラークアッセイやTCID50アッセイは、ウイルスタイターのエンドポイントデータを提供します12。また、qPCRはウイルスRNAの高感度な検出が可能ですが、複製能を持つウイルスと、非感染性のウイルス粒子または残留核酸を区別することはできません。対照的に、このような蛍光ライブイメージングを用いることで、同一の細胞集団におけるウイルスの進行、拡散、および治療効果を、非侵襲的に経時的に評価することが可能です。

本プロトコルは、抗ウイルス化合物としてのフリン阻害剤の検討以外にも、他の用途に適応させることが可能です。特に抗ウイルス薬のスクリーニングに適しており、さまざまな化合物に対する用量依存的な反応を定量化できます。また、ウイルスの侵入、複製、および拡散のタイミングや局在を含む、宿主と病原体の相互作用を研究するためのプラットフォームとしても活用できます。さらに、レポーターウイルス間、異なる株間、あるいは異なるアルファウイルス間の比較にも利用可能です。加えて、siRNAやdsRNAを用いた遺伝子ノックダウンなどの手法と組み合わせることもできます。したがって、本システムはウイルス複製における重要な標的や抗ウイルス化合物の同定および検証に有用です。ただし、この蛍光ベースのアッセイは初期スクリーニングの手法であり、単独で確定的な手法となるものではありません。スクリーニング結果を立証するためには、野生型ウイルスを用いたアッセイを含むさらなる検証が必要です。

開示事項

著者に利益相反はありません。

謝辞

pCMV-SFV6-2SG-mCherryをご提供いただいたエストニアのタルトゥ大学のAndres Merits教授、およびドイツのミュンヘン工科大学のAndreas Pichlmair教授に感謝いたします。C6/36細胞をご提供いただいたドイツのハノーファー獣医大学のStefanie Becker教授に感謝いたします。フーリン阻害剤をご提供いただいたドイツのマールブルク大学のTorsten Steinmetzer教授に感謝いたします。本研究は、ヘッセン州高等教育・研究・芸術省のLandes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer ExzellenzプログラムのLOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG)（資金コード：LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52）、およびBMFTR （Project ASCRIBE-Grant Number 01KI2024）による支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ血清アルブミン 分画V、pH 7.0SERVA電気泳動11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
BHK-21細胞CLS Cell Lines Service GmbH, ドイツ、エッペルハイム603126
細胞培養フラスコ、50 mL、25 cm2, PS, 赤色フィルター付きスクリューキャップ, 透明, CELLSTAR, TC処理, 滅菌済みGreiner Bio-One690175
細胞培養用マイクロプレート、24ウェル、PS、F底（チムニーウェル）、透明、CELLSTAR、TC、結露防止リング付き蓋、滅菌済みGreiner Bio-One662160
細胞培養マイクロプレート、96ウェル、PS、F-ボトム（チムニーウェル） µ透明、黒、CELLSTAR、TC、結露防止リング付き蓋、滅菌済みGreiner Bio-One655090
細胞培養マイクロプレート、96ウェル、PS、F底、（チムニーウェル）、透明、CELLSTAR、TC処理、結露防止リング付き蓋、滅菌済みGreiner Bio-One655180
細胞培養マイクロプレート、96ウェル、PS、V底、透明Greiner Bio-One651101
セルスクレーパーVWR734-2602
CellTiter-Glo 発光細胞生存率アッセイPromegaG7573
Cytation 5 細胞イメージング・マルチモードリーダーBiotek
DAPIフィルターキューブ 1225100Biotekex: 377/50 nm; em: 447/60 nm
ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM GlutaMAX）Thermo Fisher ScientificA4192102
ウシ胎児血清Fisher Scientific11550356
フリン阻害剤 MI-1130本研究
フリン阻害剤 MI-1131本研究
フリン阻害剤 MI-1148Hardesら（2015年）  申し訳ございませんが、ご提示いただいたのはDOI（デジタルオブジェクト識別子）のみであり、翻訳対象となる具体的なテキストが含まれておりません。 翻訳が必要な英文のテキストをご提供いただければ、ご指示いただいた専門的なガイドライン（JoVEの科学的・教育的なスタイル、学術的なレジスター、正確な用語集の使用など）に基づき、研究者や臨床医、学生向けに適切に翻訳いたします。 
Gen5 Prime ソフトウェアBiotek
イオノマイシンカルシウム塩, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
ライボビッツL-15培地、GlutaMAXサプリメント Thermo Fisher Scientific31415029
Lipofectamine 3000 トランスフェクション試薬Thermo Fisher ScientificL3000001
MEM 非必須アミノ酸 (100倍)Thermo Fisher Scientific11140050
マイクロプレート、PS、96ウェル、Fボトム（チムニーウェル）、ブラック、Fluotrac、中結合Greiner Bio-One655076
NucBlue Live ReadyProbes試薬 (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryAndres Merits教授（エストニア・タルトゥ大学）およびAndreas Pichlmair教授（ドイツ・ミュンヘン工科大学）
Texas Redフィルターキューブ 1225102 Biotek励起波長：586/15 nm、蛍光波長：647/57 nm
トリプトソ・リン酸塩ブイヨン Thermo Fisher Scientific18050039
U4.4細胞フリードリヒ・レーフラー研究所、連邦動物衛生研究センター、ドイツ、グライフスヴァルト
Viewseal Sealer、クリアGreiner Bio-One676070

参考文献

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

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