宿主-病原体相互作用を研究するためのマウス前立腺オルガノイドモデルの生成

Summary

このプロトコルは、2Dで培養されたマウス前立腺オルガノイドモデルの生成を記述しています。この検査には、オルガノイド解離、細胞シーディング、分化、上皮の完全性評価、そして尿路病原性大腸菌による体外感染が含まれます。このモデルは頂端のアクセス性を提供し、宿主と病原体の相互作用の研究に適しており、従来の3Dオルガノイドシステムの制約を克服します。

Abstract

高齢男性は良性前立腺肥大、前立腺炎、前立腺がんなどの前立腺疾患に強く影響を受けます。これらの状態は合わせて、世界的な健康負担に大きく寄与し、男性の主要な病気の原因となっています。オルガノイドモデルは、上皮構造や機能の主要特徴をin vitroで再現可能にすることで、疾患モデリングを変革しました。しかし、オルガノイドの閉鎖的な腔構造は頂端表面への実験的アクセスを制限し、宿主と病原体の相互作用の研究を妨げています。これらの課題を克服するために、マウスの前立腺オルガノイド由来の細胞を二次元(2D)モデルとしてシッドする生理学的に関連性の高い培養システムを作成しました。この方法は、上皮の本質的な特性を維持しつつ、頂端表面への直接アクセスを可能にします。このステップバイステッププロトコルは、成熟マウスの前立腺オルガノイドの解離と、細胞の付着、増殖、分化を支援する最適な種子付け条件を説明します。免疫蛍光顕微鏡によりオルガノイドモデルにおける前立腺特異的マーカーの発現が確認され、前立腺組織の細胞組織の正確な表現が示されました。TEER測定、Fアクチンおよびタイトジャンクション染色により、細胞分化およびバリア形成がさらに確認されました。このモデルを尿路病原性大 腸菌 (UPEC)に感染させたことで、宿主と病原体の相互作用を調べる上で有用であることが示されました。このモデルは前立腺上皮生物学や疾患メカニズムを調査する貴重なプラットフォームを提供し、宿主と病原体の相互作用の研究や治療戦略の評価に特に適しています。

Introduction

前立腺は膀胱の下、尿道を囲む小さな器官です。これは男性生殖器の重要な器官であり、主な機能は前立腺液を産生することです。この液体は精子血漿の最大30%を占め、精子が女性の生殖器を通過する過程で栄養を養い保護する重要な役割を果たし^ます。前立腺炎、良性前立腺肥大症、前立腺がんなどの前立腺疾患は非常に一般的で、世界中の医療に大きな負担^{となっています。}良性前立腺肥大や前立腺がんは広く研究されていますが、前立腺炎、特に細菌性前立腺炎は比較的研究が不足しています。前立腺炎は世界中の男性の最大16%に影響を及^ぼし、細菌感染症は約10%を占めています。細菌性前立腺炎は有病率が高いにもかかわらず、まだ十分に理解されていません。大腸菌(E. coli)株、特に尿路病原性大腸菌(UPEC)は細菌性前立腺炎の主な原因^です。

前立腺感染症の分子メカニズムに関する研究は、生理学的に関連性の高いin vitroモデルの欠如により制限されています。前立腺疾患に関する多くの研究は、伝統的に細胞株や動物モデルに依存してきました。特に、LNCaPやRWPE-1のようながん性または形質転換細胞株は、前立腺疾患および治療反応のモデル化に広く用いられています 10,11,12,13。しかし、これらのモデルは細胞組成や健康またはがん性のある前立腺上皮の複雑さを欠いています。さらに、多くの研究では、主にマウスモデルを用いて前立腺感染、免疫反応、前立腺腫瘍の増殖、転移に関する異なる仮説を研究しています(^14,15,16,17)。これらのモデルはこれまでで最も高度で有益ですが、倫理的な懸念を生じさせ、多大な時間と資源を要し、費用も高額になることがあります。また、生体外組織エクスプラントや一次細胞培養も、薬物やがん発生に対する組織応答の短期研究に用いられています18,19,20。しかし、これらのモデルは寿命が限られており、新鮮なヒト組織の入手もしばしば限られています。

成人幹細胞由来の三次元(3D)オルガノイド培養は、in vitroで上皮組織をモデル化する有望な代替手段として浮上しています。従来の細胞株とは異なり、オルガノイドは細胞の異質性、組織特異的構造、機能的特徴など、元の上皮の重要な特徴を保持しています⁽21,22,23)。一次細胞培養や体外エクスプラントとは異なり、オルガノイド培養は長期間にわたって増殖・通過しても老化しません。これらの特性により、オルガノイド系は生理学的に関連性の高い文脈で疾患や宿主と病原体の相互作用を研究するのに特に適しています。前立腺オルガノイドは健康およびがん性のヒト組織やマウスモデルから生成され、主に前立腺^{がん研究で}利用^{されています。}それでも、感染研究においてオルガノイドの3D構造は大きな課題であり、主に腔内細胞表面へのアクセスが限られているためです。従来、完全な3Dオルガノイドは病原体を微量注射するか、病原体と培養する前に断片や単細胞に解離して感染させられ^{てきました。}ここでは、サイズや3D構造の変動が再現性やスループットに影響を与えることがあります。代わりに、頂点外出オルガノイドはルーメンのアクセス不能という制限を克服する方法を提供します。オルガノイドを懸浮液で培養することは、超低付着型組織培養板や非接着性界面活性剤でコーティングされた表面で行うことで、オルガノイド極性の反転を誘発します。その結果、頂端が外側を向いており、病原体感染研究のための直接アクセスが可能となります^27,28。しかし、これらの培養は長期的に維持できず、オルガノイドのサイズや細胞数の変動により感染多数(MOI)の判定が複雑になります。さらに、極性の逆転のメカニズムやオルガノイド細胞への影響はまだ完全には解明されていません。オルガノイドのin vitro感染モデルとしての限界を克服するため、胃、腸、肺などの臓器からオルガノイドを用いて頂端アクセス可能なオルガノイドモデルが開発^{されています。}これらのシステムは主要な上皮的特徴を保持し、病原体や薬物への操作、画像作成、制御された曝露を容易にします。しかし、細胞分化を可能にする培養条件は、オルガノイド培養から2次元培養モデルに変換されるとは限りません^31,32。

ここでは、マウスの前立腺オルガノイドを用いて頂端アクセス可能な前立腺上皮モデルを生成するプロトコルを説明します。このモデルは以前、当研究所で開発・検証されており、そこでその在来前立腺組織との強い類似性と、UPEC³²に関する感染症生物学的研究への関連性を実証しました。このシステムは前立腺上皮の細胞組成と極性を密接に模倣しつつ、実験的な操作のアクセス性を高めています。さらに、前立腺における宿主-病原体相互作用の研究にも応用可能であることを示し、in vivo モデルよりも扱いやすい代替手段と、従来の細胞株や3Dオルガノイドモデルよりも生理学的に関連性の高いシステムを提供します。

Protocol

倫理的声明:すべての動物処置はヴュルツブルク大学の動物ケアおよび使用ガイドラインに準拠し、関連する機関および政府の規則の下で承認されています。本研究では、当研究所で他の研究グループによって独立した目的で安楽死されたWTマウスのみが使用されました。この作業のために特に動物を犠牲にすることはなく、3R原則(代替、削減、精製)に従って行われました。

注:ここで示すプロトコルは、著者³²によって発表された以前の研究に基づいています。ここに記載されたすべての手順は、該当する無菌技術と適切な個人用保護具を用いて、無菌のバイオセーフティキャビネット内で実施されなければなりません。マウス前立腺オルガノイドはC57BL/6マウスから生成され、3D培養で維持されました(前述の^通り25,26)。3R原則に従い、動物施設は未処理の未処理の未生物ウェストマウス(少なくとも6か月齢)からマウス前立腺を寄贈し、他の理由で生け贄にしました。簡単に言えば、マウスの前立腺はコラーゲナーゼとTrypLEエクスプレス酵素を用いて2段階で細かく刻み、消化されました。その後、細胞は細胞外マトリックス(ECM)の滴にシードされ、3Dオルガノイドが生成されました。培地は培養に加えられ、3日ごとに補充されました。3次元オルガノイド培養は週に一度パテリングされ、パッセージ3以降は2次元シーディングに使用されました。生後1週間のマウス前立腺オルガノイドを用いて、現在のプロトコルに従ってオルガノイドモデルを2次元表面にシードしました。このプロトコルでは組織培養プレートにECMタンパク質をコーティングする必要はありません。

1. 前立腺オルガノイドモデルの生成

1. 3次元オルガノイド分離
   1. 24ウェルプレートから3次元オルガノイドの望ましいウェル数から媒質を吸引します。1井あたり500μLのadDMEM/F12++に置き換えてください(材料 表参照)。
   2. P1000ピペットを使ってECMドロップを機械的に妨害してください。15mLの円錐形チューブに懸濁液を集めます。1本のチューブにつき最大2本の井戸しか採取しないでください。
   3. adDMEM/F12++で最大10mLまで補充してください。チューブを優しく3〜4回逆さんで混ぜます。遠心分離機で450 x g で5分間、4°Cで加熱します。
2. 3次元オルガノイド破壊による単一細胞への侵入
   1. 上清液を吸引してください。ペレットを予温(37°C)のTrypLEエクスプレス酵素2mLに10μM RHOKiを補足して再懸浮させます。
   2. 37°Cの水浴で15分間培養します。P1000ピペットを使って5分ごとに細胞懸濁液を混ぜてください。
      注意:4倍対物レンズを使って倒立顕微鏡で細胞懸濁液を確認し、細胞がほとんど単一であることを確認しましょう。2〜3個の小さな塊は許容範囲です。通常は15分の潜伏で十分ですが、必要に応じて延長することも可能です。
   3. さらにadDMEM/F12++を10mL追加してください。チューブを優しく3〜4回逆さんで混ぜます。遠心分離機で450 x g で5分間、4°Cで加熱します。
3. 単一セル懸濁のメッキ
   1. ペレットを乱さずに上澄液を吸引してください。細胞ペレットを10μM RHOKi(ステップ1.1.1で使用した3Dオルガノイドのウェルごとに300μLの培養培地)を補足した培養培地に再懸浮させます。
      注:培養培地は以下の成分です:Advance Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12、10 mmol L⁻¹ HEPES、1x GlutaMAX、1x B27、1 mM N-アセチルシステイン、10% Noggin 調整メディウム、10% R-スポンジン 1 調整メディウム、50 ng·^mL-1 EGF、1 nM 5α-ジヒドロテストステロン(DHT)、0.2 μM TGFβi、および100 ng·^mL-1 プリモシン(材料 表参照)。感染実験には、プリモシンを使わない培養培地を使用してください。
   2. ノイバウアー計数室を使って懸濁液内のセル数を数えます。
   3. 細胞懸濁液を培養培地に希釈し、10μMのRHOKiを添加して62,500細胞・^mL-1の濃度にします。48ウェルプレート(製造元から組織培養処理 済み、材料表参照)にシーディングするために1ウェルあたり200μLの細胞懸濁液を使用し、チャンバー付きμスライドでは1ウェルあたり300μLを使用します( 材料表参照)。プレートを細胞培養インキュベーターに37°C、_CO25%で置きます。
      注:ステップ1.1.1で使用される各3次元オルガノイドの井戸。通常、約200,000個の細胞を産出します。
   4. 1日後には、ほとんどの単一セルが2次元表面に取り付けられます。培地は2〜3日ごとに交換してください。合流は7日以内に達成されます。
      注意:RHOKiは初期シードのみに加え、その後の培地変更時には不要にしてください。
4. オルガノイドモデルの差別化。
   注意:以下の手順に従って、腔内細胞を豊富に含んだ分化したオルガノイドモデルを取得してください。
   1. 細胞懸濁液に10 nM DHTを加えます(ステップ1.3.3)。培地交換には10 nM DHTを補給した培地を2〜3日ごとに使用してください。
      注:細胞懸濁液にDHTが添加されない場合(およびその後の培地交換)、オルガノイドモデルは基底細胞で濃縮されます。

2. 経上皮電気抵抗(TEER)測定

1. オルガノイド細胞懸浮液を62,500セル・^mL-1の濃度で、8ウェルのPET μスライド(1.3.3で取得)を用いて、各ウェルに40電極を配置しました(材料 表参照)。細胞のないウェルの一つに、1.3.1で説明された300μLの培地を加えます。
   注:セルフリー井戸は測定のためのブランクとして使用されます。
2. μスライドをインピーダンスベースの細胞解析システム(材料 表参照)に接続し、16ウェルのステーションを組織培養インキュベーター内に設置します。TEERを400Hzで7日間測定してください。培地は2〜3日ごとに交換してください。

3. 免疫蛍光染色

注意:この方法では、細胞をチャンバー式μスライドにシードしていること を確認し、高解像度顕微鏡用途に対応しています。

1. 選択した時間点で培地を取り出し、1xPBSでセルを3回洗浄します。細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で15分間固定します(光の曝露は避けてください)。
   注意:4%パラホルムアルデヒドはアレルギー性皮膚反応や重篤な眼の損傷を引き起こす可能性があり、がんの原因と疑われています。必ず適切な個人用防護具(PPE)を着用してください。ほこり、煙、ガス、霧、蒸気、スプレーの吸入を避けてください。保護手袋を着用し、汚染された衣服は適切に除染されるまで検査室内に保管してください。内容物や容器は、認可された廃棄物処理施設を通じて処分してください。
2. 固定後は、細胞を1回のPBSで3回(各5分)洗浄します。0.5%のトリトンX-100(材料 表参照)で室温で15分間細胞を透過させます。
   注意:Triton X-100は皮膚の刺激や深刻な目の損傷を引き起こします。水生生物にとって非常に有毒で、長期的な影響が続き、環境中の内分泌をかき乱す可能性があります。取り扱い時には、保護用の手袋、目、顔の保護具を着用してください。内容物や容器は、認可された廃棄物処理施設を通じて処分してください。環境への放出を避けてください。
3. 細胞をPBS1回(各5分)で2回洗います。ブロッキングバッファー(PBS中の1% BSA、 材料表参照)で室温で30分間ブロッキングします。
4. 一次抗体をブロッキングバッファー(1% BSAを1x PBSに含む)で希釈し、細胞と共に4°Cの揺らい台で一晩インキュベートします。翌日は室温で1時間培養します。(抗体希釈については 材料表 を参照)
   注:ファロイジンによるF-アクチンの染色やCellMaskによる形質膜染色(材料 表参照)については、ステップ3.4を飛ばしてください。
5. 細胞をPBS1回(1回5分)で3回洗います。二次抗体であるファロイジンまたはCellMask(材料 表参照)をブロッキングバッファー(1% BSAを1x PBS)で希釈し、室温で細胞と1時間培養します。
6. 細胞をPBS1回(1回5分)で3回洗います。細胞を室温で15分間、1xPBSで希釈したHoechst(材料 表参照)で細胞を培養し、核を染色します。
7. 細胞を3回PBSで洗浄し(各5分)、細胞はPBSを1回残しておきます。保存温度は4°Cです。
8. レーザー走査型共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡でチャンバード・μスライドスライド(材料 表参照)を画像化してください。
   注:概観画像は蛍光顕微鏡の20倍対物レンズを用いて取得し、感染効率と分布を評価できます。40倍の水浸漬対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて、上皮細胞に付着または内部化した個々の細菌を可視化するために、高解像度画像を取得しました。蛍光色素は、使用される蛍光色素に応じて405、499、590、653 nmのレーザーラインで励起されました。発光は、Hoechstで415〜516 nm、GFPまたはAlexa 488で509〜573 nm、mcherryまたはAlexa 594で600〜651 nm、Alexa 647で663〜720 nmに設定することで検出されました。ステップサイズ0.5μmで上皮層の全厚を覆うZスタックが取得されました。画像は1024×1024ピクセルの解像度で取得され、スキャン周波数は400Hz、フレーム平均は4に設定されており、良好な画質を実現しています。レーザー出力と検出器利得は、同じ実験内のすべての条件下で一定に保たれました。レーザー出力、検出器利得、スキャン速度、平均化などのすべてのイメージングパラメータは、使用する共焦点顕微鏡に応じて最適化・調整されるべきです。

4. 尿路病原性 大腸菌 (UPEC)による細菌感染

注意:以下の手順は、プリモシンなしで7日間維持されたオルガノイドモデル(材料 表参照)を使用してください。

本研究では、プラスミドpFPV-mCherry(アンピシリン耐性)からmCherryタンパク質を一貫発現する尿路病原性大 腸菌 株UTI89が用いられました。

注意:感染性病原体(バイオセーフティレベル2)を扱う際は、手袋と適切な眼および顔の保護具を着用してください。必ずボタンを留めた白衣を着用してください。すべての手順は認定された生物学的安全性キャビネット内で実施してください。作業場の除染と、生物材料の取り扱い後は手を徹底的に洗ってください。BSL-2廃棄物は、オートクレーブに適した指定されたバイオハザード容器に収集してください。廃棄物は処分前にオートクレーブ処理やその他の適切な除染方法で除染します。

1. 感染実験の3日前に、対応する抗生物質(このプロトコルではアンピシリン100μg·^mL-1 を使用)を補足したLB寒天プレート上でUPEC株をストライクし、37°Cで16〜24時間培養します。
   注意:一部の抗生物質は接触時にアレルギー反応や刺激を引き起こし、適切に廃棄すると抗菌薬耐性の一因となる可能性があります。適切な個人用保護具(手袋や目の保護具)を着用し、生物学的安全キャビネット内で抗生物質を必ず準備し、追加してください。抗生物質を含む溶液は、認可された廃棄物処理施設を通じて化学廃棄物として処分してください。
2. 感染実験の2日前に、寒天プレートから単一のUPECコロニーを用いて、対応する抗生物質(アンピシリン100μg·^mL-1)をLBブロス3mLに接種します(ステップ4.1)。37°Cで静的培養12〜16時間。
3. 感染実験の前日に、ステップ4.2の細菌培養液をボルテックスし、そのOD₆₀₀を測定します。以下の式で、アンピシリン(100μg·^mL-1)を補足したLBブロス3mLを接種するために必要な体積を計算します。_OD600 は以下の式で計算します:体積(μL)=(0.05 × 3,000 μL) / 測定OD₆₀₀。ステップ4.2で計算された培養体積を加算します。新鮮なLBブロスに詰め、37°Cで24時間静的に培養します。
   注:ステップ4.2のオーバーナイト培養のOD₆₀₀ は1.7から2.2の間にあるはずです。
4. 感染当日、ステップ4.3の細菌培養をボルテックスし、_OD600を測定します。培養液からOD₆₀₀ 1を採取し、室温で12,000 x g で2分間遠心分離します。上清液を取り除きます。
5. DHTなしのプリモシンフリーオルガノイド培地1 mLに再懸浮します。MOIは100まで希釈してください。
   注:48ウェルプレートの各ウェルは、7日目時点で約150,000個のセルを持つと考えられています。この推定値は、感染前のウェル内の細胞数を複数の実験で数えることで得られました。MOIを正確に調整するために、感染前に細胞数を測定するために1つの追加シードウェルを植えることが推奨されます。必要な細菌懸濁体積(ステップ4.4)を算出するには、ウェルあたりの細胞数をMOIで掛けて1ウェルあたり必要な細菌総数を得、この数値を細菌濃度(8 × 10⁵ bacteria/μL)で割ってμL単位の体積を得ます。
6. オルガノイドモデルの培養培地を細菌を含む培地に置き換えます。培養面に応じて体積を調整してください。48ウェルプレートは1ウェルあたり200μL、μスライドは300μLを1ウェルあたり使用してください。細胞培養インキュベーターで37°C、_CO25%で1時間培養します。
7. 培養期間終了後、オルガノイドベースのモデルから細菌を含む培地を吸引します。細胞外細菌を除去するために、adDMEM/F12++で3回洗浄してください。
8. 細胞外細菌を殺すために50μg·^mL-1 ゲンタマイシンを含む培地を加えます。30分間孵化させます。
   注:ゲンタミシン濃度は使用する細菌株によって調整が必要になる場合があります。50 μg·^mL-1以上の濃度を使用する場合は、細胞毒性の検査が推奨されます。
9. 培地を取り出し、残りの感染期間は10μg·^mL-1 ゲンタミシンを補足した新しい培地に置き換えます。
   感染細胞を蛍光染色( セクション3)に処理し、フローサイトメトリーによる定量( セクション5)を行います。

5. フローサイトメトリーによる感染定量化

1. 培地を吸引し、細胞を1倍PBSで3回洗浄します。100μLのトリップLE発現酵素を使って細胞を剥離します。すべての細胞が剥離されるまで5〜10分間潜伏します。
   注:条件ごとに48ウェルプレートからの井戸で十分です。
2. セルの懸濁液を集め、96ウェル板(円錐形底)のウェルに移します。上にフローサイトメーターバッファー100μL(1xPBS、10% FBS、5mM EDTA)を加えてTrypLE発現酵素を不活性化します。
3. 96ウェル板を450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清液を取り除き、ペレットを150μLのフローサイトメーターバッファーに再懸浮させます。
4. フローサイトメーター(材料 表参照)を用いて感染細胞を取得・定量します。
   注:フローサイトメトリーは、mCherry陽性細胞の検出のために488 nm励起レーザーと615/20 nmの発光フィルターを用いて実施されました。データは高流量(66μL·min⁻¹)で取得され、サンプルあたり少なくとも10,000件のイベントを収集し、前方散乱高80,000を超えるイベントのみを含みました。感染細胞は、残骸や二重線を除外した後、mCherry蛍光と非感染(未感染)対照群と比較して同定されました。生存マーカー(例:ヨウ化プロピジウムやその他の生死染色)をゲーティング戦略に組み込み、細胞の生存可能性を評価することができます。これは、細胞解離が細胞に悪影響を及ぼさないことを初めてモデルで扱う際に特に有用です。

Results

このプロトコルは、マウスの前立腺上皮のオルガノイドモデルの生成を記述し、ネイティブ組織の上皮区画の細胞型と転写発現を再現します。このモデルは、成体マウスの前立腺組織から生成された3D成人幹細胞オルガノイドを用いて生成されます。これらのオルガノイド培養は培養内で維持され、週ごとに伝達されます。オルガノイドベースのモデルでは、ワークフローの最初のステップ(図1A)は7日前の3Dオルガノイドを使用します。この期間は、2次元表面にシードされるために必要な適切なサイズと細胞密度に達するために必要です。経過後、小型のオルガノイド断片(図1B、Day 0)がECMに播種され、成長させられました。時間が経つにつれて、7日目には明確な内腔を持つ大きな球状構造に成長します(図1B)。7日齢のオルガノイドを単一細胞に解離した後、細胞は3次元オルガノイド培養と同じ培地(1nM DHT)を用いて組織培養処理プレート(図1C、Day 0)にシードされ、単分子膜を形成しました。1日目には、癒着細胞が増殖し始めました。その後数日間で単層は拡大し、ブライトフィールド顕微鏡で観察されたように、3日目から5日目の間に合流に達しました(図1C)。形態の変化を時間経過で特徴づけ、オルガノイドモデルが合流に達する時刻を監視するために、CellMaskで細胞膜を染色し、複数の時点で蛍光イメージングを実施しました(図1D)。

アンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達は前立腺における細胞分化の重要な調節因子であり、オルガノイド培養培地中のテストステロン(DHT)濃度を調節することで幹細胞が基^{底細胞または}腔内細胞への定向分化が示されたため、培養培地中のDHTレベルを調整し、腔内細胞(DHT 10 nM)または基底細胞(DHTなし)のいずれかの濃縮を促進しました。 制御;方法1、図2A)。図2(B-F)に示されているように、細胞の成長や収縮度に大きな違いは観察されませんでした。予想通り、対照条件(DHTなしオルガノイド培養培地)では、ほとんどの細胞が前立腺基底幹細胞のマーカーであるサイトケラチン5(KRT5)を発現しました(図2B,E)。対照的に、分化した管腔前立腺細胞のマーカーであるCD24aの低レベルを示す細胞はごくわずかでした(図2B,F)。

先に述べた³²個の1 nM DHTを補給すると、基底細胞と腔内細胞の両方を含む混合集団が得られました。しかし、CD24aの発現は低く、腔内細胞への不完全分化を示しました(図2C,F ³²)。DHTを10 nMに増やすことで、7日間培養後も一部の基底細胞を維持しつつ、腔腔細胞の完全な分化を促進しました(図2D-F)。オルガノイドモデルの区別は明視野顕微鏡法を用いて評価することもできます。細胞が稀薄な場合(Day 0 - 5、図1C、補足図1A)では条件の違いはあまり明確ではありませんが、細胞の形態や外観は7日目に明視野顕微鏡で3つの培養条件下で明確かつ目立つようになります(図1C、補足図1A,B)。DHTがない場合、細胞はより平坦で不規則な形状に見えましたが、10 nM DHTでは細胞は多角形の配置で密に詰め込まれ、石畳の形態に似ていました(補足図1B)。

特筆すべきは、異なるDHT濃度で培養した際にも形態学的変化を遂げることです。具体的には、線量依存的なオルガノイドサイズの増加が観察され、最大のオルガノイドは10 nM DHTの存在下で形成されました(図1B、 補足図2A,B)。これらの結果は、AR経路が細胞分化だけでなく、マウス前立腺オルガノイドの成長動態の調節にも重要であることを示しています。

モデルの上皮完全性と分極を評価するため、DHTを無または10 nM DHTで培養したオルガノイドモデルで経上皮電気抵抗(TEER)測定を行いました。TEER値は両疾患で時間とともに増加しましたが、10 nM DHTが存在する場合(図3A)では著しく高くなり、上皮バリア機能の強化を示しています。これらの結果は、通常、腔内前立腺上皮細胞の細胞間接合部で頂端環状に組織されているアクチンフィラメントのファロイジン染色によって支持されました。10 nM DHT条件下では、アクチン環が対照条件下よりも明確に見え、細胞極性および上皮組織の増加と一致しました(図3B)。さらに、ゾヌラ閉塞1(ZO-1)の免疫染色により、10 nM DHT条件下のタイトジャンクションの増加が確認され(図3C)、強化された上皮バリアの完全性と腔明化表現型への分化がさらに支持されました。直交投影により、10 nM DHTで培養されたオルガノイドは明確に定義された上皮極性を示すことが示されています(補足図3A)。基底のKRT5⁺細胞は底部に位置し、腔内CD24a⁺細胞は上皮層に沿って分布し、先端側に向かってより強い染色強度を示します。この構造はマウスの前立腺組織で観察されるものと類似しています(補足図3B)。注目すべきは、ヒトプロテインアトラスのデータによると、これらのマーカーはヒト前立腺組織において類似の局在を示しており、KRT5⁺基底細胞はCD24a⁺腔層の下にあり(補足図3C)³³。対照下または1 nM DHT条件下で培養された細胞は、基底マーカーと腔内マーカーの間に明確な空間的分離が見られず、細胞高は10 nM条件下よりもかなり低くなっていました(補足図3A)。これは、10 nM DHT補給が2Dモデルにおいて、前立腺上皮の自然な分化と分極を促進し、その効果を本来の前立腺上皮に匹敵させることを示しています。10 nM DHTで培養されたオルガノイドモデルは、マウスの在来の前立腺上皮に非常に似ているため(図2D、 補足図3A、B)、宿主と病原体の相互作用を調査するための重要なプラットフォームとして機能します。モデルの適用可能性を示すために、UPEC感染、特に泌尿生殖器分野で最も一般的に使われているUPEC株の一つであるUTI89株を例に挙げました。 図4Aに示すように、細菌はLBブロスで24時間培養(方法4に記載)され、細胞と共に1時間培養されました。その後、細胞外細菌はゲンタミシンで殺菌され、侵入と細胞内複製を定量化しました。オルガノイドモデルの感染後、UPECは大量に上皮細胞に付着しました(0 hpi; 図4B、左パネル; 図4C)。その後、ゲンタミシン処理(1 hpi)後、細胞外細菌の死によりUPEC陽性細胞の数が有意に減少しました(図4B、中央パネル; 図4C)。24 hpiでは感染細胞の数は変化しませんでした(図4C)が、共焦点顕微鏡撮影では細胞内細菌が複製を続け、膀胱上皮で以前に記述されたものに似た群集状構造を形成していることが示されました(図4B、右パネル)。感染細胞は、非感染(ナイーブ)対照を基準にmCherry蛍光法で同定し、残骸や二重株を除外しました(補足図4)。

図1:前立腺オルガノイドおよびオルガノイドモデルのワークフローと形態的進化の概要。 (A) 実験ワークフローの回路図(方法1)。(B) 前立腺オルガノイドの形態的発達を示す明視野画像で、1 nM DHTを補完し、0日目、1日目、3日目、5日目、7日目に撮影(左から右へ)。スケールバー:200μm(n = 3)。(C)オルガノイドベースのモデルのブライトフィールド画像で、1 nM DHTを補足し、0日目、1日目、3日目、5日目、7日目に撮影(左から右へ)。スケールバー:200μm(n = 3)。(D) オルガノイドモデルを1 nM DHT補足し、CellMask(赤色)で染色した代表的な免疫蛍光顕微鏡画像(左から右へ)を1、3、5、7日目に提供。核はHoechst 33342(青)でカウンターステインされました。スケールバー:50μm(n = 3) この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図2:DHTはオルガノイドモデルにおける系統分化を調節します。 (A) 微分に用いられるさまざまな条件の回路図的表現。(B-D)オルガノイドベースのモデルの代表的な免疫蛍光顕微鏡画像を、(B)DHTが(B)欠如(Ctrl)または(C)1 nMまたは(D)10 nMの存在下で7日間培養したもの。画像は1日目、3日目、5日目、7日目(左から右へ)に撮影されました。オルガノイドモデルはCD24a(腔内細胞マーカー、緑)とKRT5(基底細胞マーカー、マゼンタ)で染色されました。核はHoechst 33342(青)でカウンターステインされました。スケールバー:50 μm(n = 4)。(E、F)DHT(Ctrl)、1nM、または10nMを用いて培養したオルガノイドモデルにおける(E) KRT5⁺および(F) CD24a⁺細胞の画像定量化。データは視野あたりの正セルの割合で示されています。統計検定:Tukeyの事後検定を用いた一元ANOVA。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:10 nM DHTで分化したオルガノイドモデルは対照群よりも細胞分極が強い。 (A) DHT(10 nM、緑色)が存在しない場合、(Ctrl;ピンク)が存在した状態で7日間培養したオルガノイドモデルのTEER解析。誤差バーはSD(n = 3)を表します。統計検定:Tukeyの事後検定を用いた一元ANOVA。(B,C)オルガノイドベースモデルの代表的な免疫蛍光顕微鏡画像で、(Ctrl;上)または10 nM DHT(下)を除いて7日間培養し、(B)F-アクチン(赤色)および(C)ZO-1(赤色)を染色したもの。核はHoechst 33342(青)でカウンターステインされました。スケールバー:50μm(n = 3) この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図4:オルガノイドベースモデルにおける感染動態の解析。(A) 感染プロトコルの概略的表現(第4節)。(B) 感染後0、1、24時間(hpi、左から右へ)における感染オルガノイドモデルを示す代表的な免疫蛍光顕微鏡画像。UPECは赤色で示されています。核はHoechst 33342(青)でカウンターステインされました。スケールバー:50 μm(n = 3)。(C) UPEC陽性細胞(mCherry陽性、感染細胞)の0、1、24 hpiでのフローサイトメトリー解析。ゲート戦略は 補足図4に示されています。誤差バーはSEM(n =3)を表します。統計検定:Tukeyの事後検定を用いた一元ANOVA。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:オルガノイドモデルの形態的進化。 (A,B)オルガノイドモデルの明示界画像は、(A)10 nM DHTが存在しない場合(Ctrl)、(B)に撮影され、0日目、1日目、3日目、5日目、7日目(左から右へ)撮影されました。スケールバー:200μm(n = 3) このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図2:DHT濃度は3次元前立腺オルガノイド増殖に影響を与える。 (A) オルガノイドモデルの明示界画像で、10 nM DHTが存在しない場合(下)で、0日目、1日目、3日目、5日目、7日目に撮影(左から右へ)。スケールバー:200μm(n = 3)。(B) 3つの異なる条件下で成長した7日目の3次元オルガノイドサイズの定量化:DHTなし(Ctrl;ピンク)、1 nM DHT(紫)、10 nM DHT(緑)。統計的検定:Tukeyのポストホック検定(n =3)を用いた一方向ANOVA。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図3:前立腺オルガノイド形態および上皮極性の特徴付け。 (A) 異なるDHT濃度(Ctrl、1 nM、10 nM DHT)下での上皮組織および頂端から基底極性を示す共焦点zスタックの直交投影。基底細胞ではKRT5(マゼンタ色)、腔細胞にCD24a(緑色)を染色しました。スケールバー:50 μm.(B) OCT埋め込みマウス前立腺組織の免疫蛍光染色で、基底(KRT5、マゼンタ)および腔内(CD24a、緑色)上皮マーカーを示す。核はDAPI(青)でカウンターステインされます。スケールバー:50μm。簡単に、マウス組織片を4%のPFAで固定し、30%ショ糖で一晩脱水し、OCT埋め込み³²を施しました。スライドはPBSで10分間再水和され、セクション3の後に免疫染色されました。(C) ヒト前立腺組織におけるCD24aおよびKRT5タンパク質発現の免疫組織化学解析(パネル C はヒトプロテインアトラスデータベース(バージョン25.0)から抽出;ヒトプロテインアトラス proteinatlas.org)、Uhlén, M.ら(2015)³³、https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate)。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図4:感染細胞を特定するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。 細胞は最初に側面散乱高(SSC-H)と前方散乱高(FSC-H)に基づいてゲートされ、その後SSC-Hと側面散乱面積(SSC-A)でゲートが適用され、単一セルを選定しました。その後、Counts vs PE-Texasの赤-H蛍光(ヒストグラム)を用いてmCherry陽性(感染)細胞を特定しました。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

Discussion

良性前立腺過形成、前立腺炎、前立腺がんなど、さまざまな疾患が前立腺に影響を与えることがあります。これらの疾患は非常に多く、患者の生活の質に大きな影響を与えています^。これらの疾患が医療に大きな影響を与えているにもかかわらず、特に非がん性疾患における基礎的なメカニズムや宿主応答についての理解は限られています。これは主に生理学的に関連性の高い実験モデルが不足していることに起因しています。一方で、不死化細胞株は正常な前立腺上皮の複雑さや分化状態を捉えきれません。一方で、主に齧歯類を中心とした動物モデルは倫理的な懸念を抱え、コスト効率が良くありません。別のアプローチとして、ヒト一次細胞や患者由来組織エクスプラントの使用があります。しかし、新鮮な前立腺組織の入手が限られているため、その広範な応用は制限されています。これらの制約は、生理学的に関連性があり、使いやすく、実験的に管理可能な他の体外内システムの必要性を示しています。この文脈で、成人幹細胞オルガノイド技術は疾患モデルを変革しました。これらの3D培養は自己組織化能力を持ち、上皮のアイデンティティと上皮細胞多様性を保持します 23,34,35,36,37,38。3Dアーキテクチャにより、がん研究、薬物試験、再生医療への応用が可能になりました(23,34,35,36,37,38,39,40,41)が、頂端が内側を向く密閉構造は、特にin vitroでの実験アクセスに実用的な課題をもたらします感染モデル。頂端アウトオルガノイドは上皮の極性を反転させることでこの制限を解消し、直接感染研究のために頂端表面を露出させます(^27,28)。しかし、感染モデルとしての効果は、サイズのばらつき、病原体への曝露の不均一さ、長期感染時の脆弱性によって制限される可能性があります。

ここでは、マウスのオルガノイドベースモデルを生成するプロトコルを提示します。これにより、マウスの上皮細胞組成と転写プロファイルを再現しつつ、根端表面への容易なアクセスを提供します。前回の研究³²で最適化されたこのモデルは、シーディング密度、刺激への均一な曝露、定義された細菌対細胞比(MOI)、および従来の3Dオルガノイドシステムでは標準化が難しい高スループットイメージングパラメータなどの主要な実験変数を正確に制御することを可能にします。

動物^実験の3Rs原則(置き換え、還元、精錬)に従い、このモデルの一次細胞源として用いられるオルガノイドは、繁殖など無関係な目的で生贄にされた野生型の未熟マウスから派生しています。前立腺は近隣の動物施設からの寄付によって入手されるため、このプロトコルのために追加の動物を犠牲にする必要が減ります。

オルガノイドおよびオルガノイドベースのモデルの堅牢かつ信頼性の高い分化は、ネイティブ組織の細胞組成や機能特性を忠実に再現し、in vitroモデルとしての関連性を確保するために極めて重要です。オルガノイド内の細胞分化は、培養培地の特定の組成、特に成長因子や薬理学的薬剤(すなわち薬物阻害剤)の正確な濃度に強く影響されます。これらの因子を操作することで、さまざまなオルガノイド系で示されているように、特定の細胞系統への直接的な分化が可能になります。例えば、腸内オルガノイドでは、WNTの除去が腸細胞の分化を促進し、インターフェロンガンマ線によってさらに増強されることがあります(³⁸ページでレビュー)。ゴブレット細胞への分化は、p38阻害剤とニコチンアミドの除去、またはDAPT/DBZによるノッチ阻害によって達成されます(³⁸ページでレビュー)。IGF-1およびFGF-2は分泌細胞強化培養の長期拡張を支持することも示されています⁴³。さらに、IL-22はパネス細胞の分化を促進し、腸内分泌細胞はNotchやBMP³⁸を含む経路の阻害を通じて生成されます。同様に、胃オルガノイドおよびオルガノイド系モノレイヤーは、WNTを培養培地から抽出するとピット細胞に向かって分化し、ニコチンアミドを培地に加えると細胞はグランド表現型(首および主任細胞)に誘導されます31,44,45。

前立腺では、アンドロゲン受容体(AR)が組織の恒常性維持に重要な役割を果たします(46,47,48,49)。精巣のレイディヒ細胞によって産生されるテストステロンは、前立腺上皮細胞で5α還元酵素によってDHTに変換されます。DHTはARを活性化し、ARは二量体化し、核に転座し、アンドロゲン応答要素に結合して細胞分化や恒常性に関わる遺伝子を調節^します。過去の研究では、3Dマウスの前立腺オルガノイドに1 nMを補給すれば、細胞が腔内細胞への分化を達成するのに十分であることが示されています⁵¹。また、ビタミンD(特に1,25-ジヒドロキシビタミンD)の補給が、標準的なWNT活性を抑制し、WNTファミリーのDKK3を抑制することでヒト前立腺オルガノイドの成長を促進し、分化を加速させることも示^{されています。}しかし、これらの研究では3次元オルガノイドのみが使用されました。私たちの前回の研究³²および他の⁵³では、3次元オルガノイドにおける10 nM DHTの補給だけでは完全な分化が得られないことが示されました。これに対し、ここで説明する2Dモデル、すなわち細胞に10 nM DHTを2次元にシードすることで、モデルを^{ネイティブ組織に}類似した状態に分化するのに十分である。この3Dモデルと2Dモデルの違いを理解するにはさらなる研究が必要ですが、システム間の異なる機械的・物理的手がかりや、3Dモデルに成長因子を含むECMが存在することによって説明できる可能性があります。

成人の前立腺組織には、管腔細胞、基底細胞、神経内分泌細胞の3つの主要な上皮細胞タイプが見られます。これらのうち、これまでに発表されたオルガノイドモデルには管胞細胞と基底細胞のみが存在しています。希少な神経内分泌細胞の欠如は、現在のオルガノイドプロトコルが完全に最適化されていない可能性を示唆しています。腔内細胞と基底細胞の間には、前立腺中間細胞集団が、腔内(すなわちCD24a)と基底(すなわちSCA-1)マーカーの両方を発現する遷移状態としても記述されています^18,51。このサブポピュレーションはしばしば尿道周辺の前立腺領域に見られ、そのため尿道周囲腔室細胞(⁵⁴)と呼ばれることが多いです。これは特定の分化またはシグ^{ナル伝達条件下}で一部の3次元オルガノイド系で報告^{されていますが、}我々のシステム³²ではルミナル細胞と中間細胞の明確な分離は観察されていません。一つの可能な説明は、3次元オルガノイド生成の際に異なる前立腺領域を区別できず、尿道細胞の汚染を避けるために尿道前立腺のすぐ隣接組織を除去していることです。したがって、近位部や尿道に隣接する領域から得られるオルガノイド培養は、中間細胞の生成能力が高いと考えられます。

バリアの完全性は成熟し分化した上皮の特徴とされ、毒素や微生物が基部組織に到達するのを防ぐ保護バリアを提供します。タイトジャンクション(ZO-1タンパク質が豊富)⁵⁶は、細胞外透過性の調節と上皮バリアの完全性維持に重要な役割を果たします⁵⁷。上皮細胞が分化するにつれて、これらの細胞間接合部の成熟はバリアを強化します⁵⁸。したがって、バリアの完全性の評価はin vitro 上皮モデルにおいて重要な指標です。本プロトコルでは、障壁の完全性を評価するための3つの補完的な方法を示します:TEER測定、ZO-1免疫染色、Fアクチン染色です。これら3つの方法はすべてバリアの完全性を効果的に評価しますが、必要な機器や資源には大きな違いがあります。TEER測定は定量的な値を時間とともに追跡できるため、障壁機能の動的な洞察を提供します。しかし、この技術にはすべての研究室で利用可能なわけではない特殊なハードウェアやソフトウェアが必要です。対照的に、抗ゾロイディン抗体やファロイジンによる染色は時間とコストの面ではるかに管理しやすいです(例:ファロイジン染色は約3時間で行われます - セクション3)。

このプロトコルは、3Dマウスの前立腺オルガノイドを使って頂点にアクセス可能な2Dモデルを生成する方法を説明しています。複数のレビューで、宿主-病原体相互作用の研究におけるオルガノイドおよびオルガノイドベースのシステムの利点と欠点が概説されています 23,36,59。感染研究では、病原体と宿主上皮の自然な相互作用場所を考慮することが重要です。前立腺では、腔内細胞が通常最初の接触点であるため、感染動態を正確にモデル化するためには頂端面へのアクセスが不可欠です。従来の3D前立腺オルガノイドでは、頂端面がオルガノイド腔に面しており、直接アクセスできません。これらの方法では、マイクロインジェクションによる病原体曝露が可能で、これは低スループットで技術的に難しい方法であり、オルガノイドを破壊することで上皮の極性を損ない、非生理的な^{相互作用部位を}生じさせることができます。対照的に、このプロトコルで提示される頂点アクセス可能な2Dモデルは、光明表面への直接アクセスを提供します。これにより、病原体への制御された生理学的に重要な曝露、MOIの正確な調節、そして高スループット・高解像度またはライブセルイメージングプラットフォームとの互換性が可能となります。ここでは、UPECのリファレンス株UTI89を用いて、このモデルを体外感染システムとして利用した様子を紹介^します。UTI89は細菌性前立腺炎9の主要な細菌種を表す広く使われているリファレンスです。しかし、このモデルは腸球菌(Enterococcus faecalis)や緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)など他の前立腺病原体の研究にも容易に応用できるため、前立腺の感染生物学における多用途なプラットフォームとなっています。

3Dオルガノイドの解離は、オルガノイドモデルの確立に成功するための重要なステップです。3Dオルガノイドを完全に解離できず、大きな断片が残ると細胞の培養表面への接着が低下し、解離試薬に30分以上長時間曝露すると細胞の生存率が低下します。さらに、解離と種子付与の約7日前に一定の通過間隔を維持することが不可欠であり、オルガノイドの生理的状態が付着や分化能力に強く影響します。前立腺オルガノイドモデルの開発に成功するもう一つの重要な変数はシーディング密度です。ここで用いられたシーディング濃度は、7日間の分化に最適化されています。この濃度を増減すると、異なる分化時間が生じる可能性が高いです。さらに、プレート前の細胞再懸濁が不十分だと、ウェル間で細胞の分布が不均一になり、細胞密度が変動し、それが増殖と分化の両方に影響を与えます。さらに、他のオルガノイドモデルと同様に、異なるECMや成長因子のバッチによって成長や分化能力に影響を与えることがあります。したがって、成長因子のバッチ数やロット番号の変更後でも、オルガノイドモデルが一貫した表現型を保つことを確認することが重要です。

オルガノイドベースのモデルが確立された後は、感染パラメータも慎重に最適化する必要があります。細菌株や選択した測定値に応じて、堅牢で再現性の高い感染レベルを達成するためには異なるMOIが必要になることが多いです。UPEC株UTI89(ここで使用、³²で使用)および複数の前立腺炎分離株³²では、MOIが100で癒着、浸潤、複製の各時点で信頼できる感染細胞数を得られました。しかし、細胞と細菌の培養期間を1時間以上延長する必要がある場合は、培地内でのUPECの細胞外過剰増殖とそれに伴う細胞への毒性を防ぐために、より低いMOIを用いるべきです。このプロトコルでは、感染を評価する方法が2つありました。I) 感染細胞の割合を定量化するフローサイトメトリー、II) 細菌の局在性を評価する共焦点顕微鏡法。しかし、他にもいくつかの手法が用いられます。例えば、コロニー形成単位アッセイによる細菌³²の測定、免疫染色による宿主や細菌の^{マーカー32}の検出、または宿主反応をプロファイリングするためのトランスクリプトミクス解析などです。

前立腺オルガノイドベースのモデルは生理学的に関連性の高いシステムを提供しますが、感染研究に適用する際にはいくつかの制限を考慮する必要があります。このモデルの大きな制約の一つは、居住免疫細胞や末梢免疫細胞が存在しないことで、感染に対する宿主応答(例:免疫細胞の募集や免疫媒介による除去)を完全に捉える能力が制限されます。モデルに欠けている他の重要な要素としては血管、間質、神経があり、これらは宿主と病原体の相互作用に影響を与える可能性があります。間質線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞などの追加の細胞タイプを取り入れることで、より完全な組織微小環境の再現が期待できます。高度な共培養システムやマイクロ流体型オルガンオンチッププラットフォームは、複雑な細胞相互作用をさらに支援し、感染の動的研究を可能にします。さらに、動物モデル由来のオルガノイドを使用する場合は、特にヒト特異的病原体を研究する際に種特異的な違いを考慮する必要があります。我々の前回の研究³² は、マウス前立腺オルガノイドモデルの発見がヒト組織でも再現可能であることを示しましたが、遺伝子調節、受容体発現、ホルモン応答の種間変異は、モデルのヒト生理学への直接的な関連性を依然として限定する可能性がある。可能であればヒト由来のオルガノイドを取り入れることで、ヒト特異的病原体の相互作用と応答の研究を可能にし、翻訳価値を高めるでしょう。これらの追加は、オルガノイドベースのモデルを前立腺生物学、感染病因、治療法の開発研究に強力なツールとして強化する可能性がありますが、私たちが提示する純粋な上皮モデルは、単純化され区画化されたシステムを提供します。これにより、他の組織成分からの干渉なしに、上皮特異的な宿主-病原体相互作用の集中的な調査が可能になります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48ウェルプレート	サーステット	83.3923	底面の形状:平ら
5&α;-アンドロスタン-17&β;-ol-3-1 ジヒドロテストステロン	シグマ・オルドリッチ	A8380	それはDHTと呼ばれていました。ストック解10&μ;Mは100%エタノールに溶けています
8ウェルPETスライド(1ウェルあたり40電極)およびnbsp;	応用生物物理学	8W10E+	TEER測定に使用されるスライド
96個のウェルプレート	サーステット	82.1583	底面形状:円錐形
前進、ダルベッコ改良型イーグル中型/F12	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	12634028	10 mmol L&minusを補給するとadDMEM/F12+/+と指定されました。HEPES1錠とグルタMAX1錠
アンピシリン	ロス	K029.2	濃度ストック 100 mg/mL
抗CD24a抗体	プロテインテック	10600-1-AP	一次抗体;1xPBS 1%BSAでの希釈1:100
抗サイトケラチン5 Alexa fluor 647抗体	アブカム	AB193895	一次抗体;1xPBS 1%BSAでの希釈1:100
抗ウサギIgG、Alexa、フルオロ488 抗体	インビトロジェン	A21441	二次抗体;1倍PBS 1%BSAでの希釈1:500
抗ZO-1ポリクローナル抗体	プロテインテック	21773-1-AP	一次抗体;1xPBS 1%BSAでの希釈1:750
B27、50倍	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	12587010
Bovines 血清アルブミン(BSA)フラクションV、NZ-Origin	ロス	8076.3	1x PBSで1%で使用されるブロッキングバッファの成分
チャンバード&マイクロスライド8ウェル	イビディ	80806	表面改造:ibiTreat
円錐形チューブ(15 mL)	シグマ・オルドリッチ	T1943	平らな底は小さなペレットには適しています。
ジナトリウムエチレンジアミネテトラアセテート2H2O(EDTA)	ロス	8043.2	自家製:400 mLの水に93.0 g、pHを8.0に調整、H2Oで最大500 mLまで体積を調整;0.5 M EDTA;フローサイトメーターバッファーのコンポーネント
ダルベッコのバランス塩溶液(DPBS)	ギブコ	14190-144	PBS
ECHO回転顕微鏡	エコー
ECIS Z-シータ - インピーダンスベースのセル解析システム	応用生物物理学	ECIS Z-シータ	システムには以下が含まれます:16井戸および/または96井戸ステーション;外部制御モジュール;ノートパソコン;ECIS制御、取得、表示ソフトウェア;自動セル移動および電気穿孔のための高架フィールドモジュール
胎児牛血清(FBS)スーペリア	シグマ・オルドリッチ	S0615	フローサイトメーターバッファーの成分;293T細胞株の培養培地成分;培養培地HEK293T細胞株の構成要素
フラッシュ・ファロイディン レッド 594	バイオレジェンド	424203	希釈1:250を1xPBS 1%BSAで使う
フローサイトメーターバッファー			PBS1回、FBS10%、5mM EDTA
ゲンタミシン	シグマ・オルドリッチ	G1272
グルタMAX	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	35050-038	L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、adDMEM/F12+/+ の成分;
ハーバード・バイオクロム・ウルトロスペック10セル密度計	フィッシャー・サイエンティフィック	10704417
HCS CellMask 深紅ステイン	ライフ・テクノロジーズ	H32721	1倍のPBS 1%BSAでの希釈1:1,000
マウスHEK293T Noggin-Fc発現ベクターをトランスフェクトした細胞株	クレバーズ教授の細胞株		ノギンを生産するために使われていました。培養培地:500ml DMEM、高グルコース、グルタMAX、ピルビン酸(Gibco Life Technologies, 31966)+ 50ml FBS;Farinら 消化器病学 143巻6号(2012年):1518-1529
HEPES	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15630056	adDMEM/F12++ の成分;
ホエスト 33342	ライフ・テクノロジーズ	H3570	1倍PBSでの希釈1:5,000
ヒト表皮成長因子(EGF)とnbsp;	ペプロテック	AF-100-15	集中ストック500 & マイクロ;g/mL
接種ループ	サーステット	86.1567.010
接種チューブ	サーステット	62.515.006
ライカ ステラリス 5 共焦点顕微鏡	ライカ
ルリア・ベルターニ・ブロス(LBブロス)	ロス	X968.1
マトリゲル	コーニング	356231	細胞外マトリックス(ECM)
N-アセチルシステイン	シグマ・オルドリッチ	A9165-25G	濃縮ストック 500 mM
ノギンCM
NovoCyte Quanteon	アジレント		フローサイトメーター
パラホルムアルデヒド(PFA)	シグマ・オルドリッチ	P6148	1xPBSで4%使用、4%ショ糖で使用されます
プリモシン	インビボジェン	アント-pm-1
Q-VETTESセミマイクロ	Ratiolab	2712120
RHOKi(Y-27632)	アブモール	M1817	RhoA/ROCK阻害剤;濃縮ストック 10 mM
R-スポジン1 CM
R-スポンディン1が293T細胞株を発現	シグマ・オルドリッチ	SCC111	R-spo1 CMの製造に使用;培養培地:500ml DMEM、高グルコース、グルタMAX、ピルビン酸(Gibco Life Technologies, 31966)+ 60ml FBS
TGFβi(A-83-01)	トクリス	2939	ALK4/5/7阻害剤;濃縮ストック5m
トリトン X-100	シグマ・オルドリッチ	T9284	PBSで希釈した0.5%を1回使用しました
TrypLE発現酵素	ギブコ	12605028	3Dマウス前立腺オルガノイドを消化するための酵素細胞解離剤
尿路病原性大腸菌 株UTI89	ドブリント教授からのWT株		pFPV-mCherry(追加遺伝子#20956)で形質転換