免疫調節の強化のためのマウス骨髄由来間葉質細胞の標準化単離およびサイトカインプライミング

サマリー

ここでは、マウス骨髄由来の間葉間質細胞を単離するプロトコルと、BMSCsの免疫抑制効果を増幅するサイトカインプライミング法を示します。

要約

間葉間質細胞(MSC)は強力な再生および免疫調節機能を持っています。これらの特性により、MSCは複数の免疫疾患治療に強力な細胞内医薬品として機能しています。骨髄はMSCの主要かつ最も頻繁に利用される供給源です。マウスモデルを用いた前臨床的メカニズム研究は、ヒト臨床試験におけるBMSCの最適な薬物送達戦略の知識を得る上で極めて重要です。したがって、マウスMSCの製造プロセスの標準化も、より良い治療効果を得るために不可欠です。このプロトコルの中心的な目的は、制御されたインターフェロンガンマ(IFN-γプライミング)がBMSCの内在的な免疫抑制特性をどのように強化するかを示すことです。未処理またはIFN γ事前認可されたBMSCから調理媒体(CM)を生成する過程を記述し、一次腹膜マクロファージを用いてその生物学的活性を評価します。ELISAおよびフローサイトメトリメトリープロファイリングを通じて、プロトコルは特にIFN γプライム時にBMSC由来のセクレトームが、IL-10産生とM2関連表面マーカーの上昇を特徴とする抗炎症マクロファージ分極をどのように駆動するかを詳述しています。全体として、このプロトコルは機能的に一貫したマウスBMSCの製造と免疫調節能力の評価のための統一された枠組みを確立します。技術的ばらつきを減らし、視覚的・手順的な明確さを提供することで、前臨床MSC研究における再現性の向上を支援し、トランスレーショナル研究における最適化されたMSC展開戦略を促進します。

概要

骨髄由来間葉質細胞(BMSC)は、前臨床および臨床試験の両方で広く応用されています。その低い免疫原性、利用しやすい、多系統分化能力により、BMSCは細胞医薬品として臨床現場での利用に有望な候補となっています^1,2,3。その免疫抑制および再生特性は、移植片対宿主病(GVHD)⁴、敗血症⁵、炎症性腸疾患(^IBD)6などの炎症性疾患の治療に広く利用されています。骨髄間質ニッチは、多様な間質細胞群で構成されています。それにもかかわらず、すべてのMSCは国際細胞療法学会(ISCT)が定める基準を満たしており、その基準には、形成接着、表面受容体発現(ヒトではCD73、CD90、CD105)、マウスではCD29、CD44、CD90(造血または内皮マーカーの発現なし)が含まれます。CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a、HLA-DR、および脂肪形成能力、 軟骨性、または骨形成性分化⁷.

BMSCは、シトカイン、ケモカイン、成長因子、細胞外小胞、その他可溶性かつ接触依存性分子を含むパラクリン因子の放出によって機能を維持します(^8,9)。MSCのセクレトームは、先天免疫系の要素と双方向的に相互作用することでニッチを調節します。¹⁰。MSCsとマクロファージの相互作用で放出される因子は、マクロファージを炎症促進型または抗炎症性の表現型にシフトさせることがあります^11,12。逆に、MSCの機能状態も局所免疫細胞、特にマクロファージによってフィードバック機構を通じて調節されます¹¹。このMSCとマクロファージのクロストークは、MSCの免疫抑制機能に不可欠です。養子移植されたMSCは、マクロファージが存在する場合にのみ組織の炎症を減少させ、これは大腸炎マウスモデルで観察されています。対照的に、マクロファージがない場合にMSCがBリンパ球またはTリンパ球と相互作用することは、治療効果を発揮するには不十分です(¹³)。

同種のBMSCを用いた最初の第III相臨床試験は、米国のOsiris Therapeuticsによってステロイド難治性GVHD^{(NCT00366145)}1の治療のために完了しました。それ以来、多くの前臨床および臨床試験が実施されましたが、臨床試験の成功は前臨床結果に基づく期待を裏切っていません。MSCベースの臨床試験の成功率を向上させるためには、薬剤展開戦略の最適化が不可欠です。最適な送達経路、治療用細胞の投与量、ケア現場の細胞の生理的状態を理解することは極めて重要です。例えば、 生体内 大腸炎マウスモデルでは、低温保存MSCや静脈内投与は最適でない投与方法であることが研究で示されています¹⁴。

サイトカイン事前ライセンス、遺伝子組み換え、低酸素前調整などのさまざまなアプローチが、MSCのin vivo持続率と治療効果の向上に広く研究されています¹⁵。マウス後肢虚血モデルでは、低酸素前調整(2%_O2)により、熱衝撃タンパク質である78-kDグルコース調節タンパク質(GRP78)の発現増加によりMSCの増殖および移動能力が改善されました¹⁶。IL-1β(インターロイキン1ベータ)は、MSCが好中球、単球、リンパ球、好酸球を利用できるようにします¹⁷。生体内投与後、MSCは活性化されたTおよびNK細胞由来のIFNγにさらされ、^MSC18によるインドレアミン2,3-ジオキシキゲナーゼ(IDO)産生を促進します。IDOはMSCの分泌物に不可欠な成分であり、T細胞の増殖速度を低下させます。興味深いことに、MSCはマウス由来のTリンパ球と共培養すると免疫抑制能力が低下します¹⁹。研究では、IFN-γ事前ライセンスが凍結保存MSCにおけるT細胞介性アポトーシスの発生率を低下させることが確認されています^13,20。IFNγプライミングはBMSCsの治療効果を向上させる¹³。これらすべての証拠は、より強力な免疫抑制性MSCの産生においてIFNγが不可欠な役割を果たすことを示しています。

MSCの最も効果的な送達方法を決定するために、動物モデルは倫理的なアクセス性のために広く活用されています。前臨床転帰のばらつきを減らすためには、MSCの製造プロセスにおいて高収量、細胞生存率、時間経過の一貫性を保証する最適化された方法を確立することが極めて重要です²¹。MSCの通過は、さまざまな治療効果を生み出す重要な変数です。 in vitro 培養中、パスケージングはMSCの特徴付けや有効性を調節し、一定回数のパステージ後には細胞が老化状態^{になります。}したがって、臨床試験や前臨床研究においては、MSCの伝道番号の使用を一貫させることが極めて重要です。同様に、MSCの隔離に関する特定のプロトコルとの整合性も、MSC使用の結果の再現性を達成するための重要な要素です。多くのアプローチの中で、抗体ベースの細胞選別法²³、ネガティブ選択法²⁴、酵素による消化法²⁵ がMSCの分離に人気があります。しかし、これらの方法の適用可能性は供給源によります。なぜなら、不適切な使用は収量、有効性、三系性の分化能力を低下させるからです。

ここでは、BMSCの分離および特性評価のための標準化されたプロトコルを提示し、推奨されるパッセージ番号、凍結保存技術、BMSC由来の状態培地収集を重視します。また、IFNを媒介γ MSCプライミングのプロトコルを提供し、最後に腹膜マクロファージが正常またはIFNをγの事前認可済みBMSCに対してどのように異なる反応するかの比較研究を実証しました。

プロトコル

本研究は、ICMR-国立生殖・児童健康研究所(IAECプロジェクトNo.09/23)およびウィスコンシン大学マディソン校施設動物ケア・利用委員会の承認とガイドラインのもとで実施されました。本研究では、特定の病原体フリー(SPF)条件下で繁殖・飼育された6〜8週齢の雌C57Bl/6Jマウスを用いました。

注:in vivo または in vitro 試験の作業中、機関バイオセーフティ委員会(IBSC)が定めたバイオセーフティプロトコルに従いました。簡単に言うと、動物実験ではストレスと怪我のリスクを減らすために優しい取り扱いを続けました。安全メガネ、手袋、実験用コート、マスク、使い捨てのブーファンキャップなど、適切なPPEを使用しました。DMSOのようなバイオハザード化学試薬については、化学物質を扱うためにバイオセーフティキャビネットを使用しました。特定の廃棄物容器を使って、バイオハザード試薬や鋭利な物を捨てました。

1. 小鼠骨髄間葉間質細胞の単離

注:後肢採取後、残りの手順は組織培養層流フードと無^菌無菌技術で行うべきです。

1. マウスは子宮頸部脱臼で安楽死させ、その後70%エタノールで徹底的にすすいでください。眼用鉗子を使い、マウスの股関節の間の腹部皮膚を優しくつまみ、ハサミで慎重に皮膚を切ります。
2. 足元に優しく引っ張って皮膚を剥がします。股関節と足首を切り下げて後肢を解放します。
3. 後肢を氷のように冷たいDMEMで素早く移し、1xペニシリン/ストレプトマイシンと2%FBSを補足して、さらなる解剖まで組織損傷を防ぎます。
4. 後ろ肢を氷のように冷たい培地を入れたペトリ皿に入れます。骨の骨幹を優しくこすり取り、大腿骨と脛骨から筋肉と結合組織を慎重に剥がしてください。清めた骨を氷のように冷たい培地を入れた新しいペトリ皿に移します。
5. 大腿骨と脛骨を切り離し、骨髄腔のすぐ下の脛骨と大腿骨の端に切開します。大腿骨と脛骨の解離手術中は、骨髄腔を最大限に保護してください。
6. 1mLの滅菌注射器に21Gの針を使い、ペトリプレートから培地を抽出します。滅菌鉗子で切除した大腿骨を保持し、針を優しく骨髄腔に挿入します。骨髄を洗浄して骨髄を採取してください。この工程を骨が白くなるまで繰り返します。脛骨も同じように流してください。
7. ピペットを優しく出し入れして、ペトリ皿内の細胞塊を分散させます。70mmのフィルターメッシュを使って、細胞の懸濁液をろ過して骨粒子を除去します。ろ過液を集め、室温で230 x g で5分間遠心分離します。
8. 上澄液を廃棄し、完全な培地(DMEM、10% FBS、5% L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン)でペレットを再懸浮させます。トリパンブルー排除法とヘモサイトメーターによるカウントで細胞の収量と生存率を測定します。
9. 細胞を75 cm² の組織培養処理フラスコで、細胞密度5000 cells/cm² の完全な^DMEM培地にシードします。培養48時間後に非接着型造血細胞を培地を変えて除去します。メディアは3〜4日おきに新しいメディアに交換してください。
   注意:汚染を避けるために、皿の代わりに細胞培養フラスコを使用してください。細胞の成長を妨げるため、インキュベーターから頻繁にフラスコを取り出して細胞をチェックしないでください。
10. 接着細胞を剥離するには、細胞をPBSで1回洗浄し、0.25%トリプシン-EDTAを加え、細胞を5分間トリプシン中に置いたままにします。これによりセルが井戸から切り離されるのを助けます。
11. 培地全体を加え、再懸濁し、230 x g で室温で5分間遠心分離します。上清液は捨てる。完全なDMEM培地をペレットに加え、再懸浮液を使い、5,000 cells/cm^²の密度で再シードします。
12. 培地を3〜4日ごとに交換して、細胞を週に一度通過させてください。3回目の検査後、ステップ6で説明したフローサイトメトリ分析によるMSC培養のアッセイを行います。実験にはパッセージ3〜5の細胞を使ってください。
    注:将来の実験利用のために細胞をクライオ保存するには、所定の体積で遠心分離し、凍結培地に再懸浮させ、1 x 10⁶ 個の細胞を1 mLの冷凍培地に-80°Cの低温で一晩保存し、その後長期使用のために窒素に移してください。
    凍結培地の組成:DMEM 70%、FBS 20%、DMSO 10%。

2. 培養MSCから調製培地の調製

1. セルを5000セル^/cm² の密度で6ウェルプレートにまきます。MSCを80%まで培養します。
2. 細胞培養プレートから調度された培地を230 x g の遠心分離機で室温で5分間採取し、ろ過して処理に使用します。

3. 培養MSCからIFNγプライム調整培地の製剤

1. 細胞を6ウェルプレートに5000セル/cm^²の密度で播種します。細胞を25 ng/mLのIFNγで48時間処理します。IFNγがMSCsに与える最適な効果を得るために、用量依存的研究を実施してください。この実験では、5、10、25、50、100 ng/mLのIFNγ濃度の範囲を選択して、MSCの事前ライセンスを取得します。5 ng/mLおよび10 ng/mL濃度はマクロファージ分極において有意に効果が低く、最適濃度は25 ng/mLと特定されました(補足図1)。
2. IFN γを含む媒体をデカントした後、井戸をPBSで2回洗浄し、IFN γを完全に除去します。残留IFN-γは研究結果に干渉する可能性があります。
3. 細胞を通常のDMEM培地で37°Cでさらに24時間キュベートします。 24時間後に、ステップ2の調整済み培地を採取します。

4. 腹膜腔由来のマクロファージの単離および培養

1. マウスの腹腔に氷のように冷たいPBS(3%FBSを含む)5mLを注射し、その後腹部を優しくマッサージします。
2. PBS溶液は滅菌注射器で回収します。10mLのチューブに採取してください。溶液を300 x g で5分間遠心分離します。
3. 上清液を取り除きます。ペレットを完全なRPMI培地(RPMI、10% FBS、1xペニシリン、ストレプトマイシン)に溶かします。細胞を5000細胞/^cm2でプレートします。
4. 24時間後に非接着細胞を除去し、合流するまで培養します。必要に応じて細胞を実験的な手順として使用してください。

5. 酵素結合免疫吸着アッセイ

1. BMSCs-CM処理マクロファージ由来のIL-10を検出するには、以下の手順に従ってください。
   1. マクロファージをBMSCs-CMで24時間治療し、翌日に上清液を採取します。
   2. IL-10の量は製造元の指示に従ってIL-10 ELISAキットで測定してください。
2. BMSCまたはIFNγ処理BMSC由来のCCL2検出には、メーカーの指示に従ってCCL2 ELISAキットを使用してください。

6. MSCsおよびマクロファージ表現型解析のフローサイトメトリー解析

1. セルを6ウェルプレートにシーディングし、コンフルにします。PBS(1 mL)で1回洗い、その後トリプシン化を行います。0.25%のトリプシンを加え、トリプシンで5分間キュベートして細胞を完全にプレートから取り除きます。
2. トリプシン活性を無効化するためにメディアを追加してください。細胞を10mLの発泡スチロールチューブに採取します。マクロファージの場合は300 x g で4°Cで5分間、BMSCの場合は230 x g で4°Cで5分間、
3. 上清液を除去し、細胞を2mLの染色バッファー(氷のように冷たいPBSに2%FBSと0.05%アジドを含む)で再懸濁させます。230 x g で7分間回転します。ペレットをデカントして破壊しろ。Ghost Red 780生存性染料1 mLとFACSバッファー50 mLを加え、再懸濁してフローチューブに入れます。暗闇で30分間ステインをつける。
4. 30分後に1mLの染色バッファーで細胞を洗浄します。ペレットをデカントして破壊しろ。抗体またはアイソタイプコントロールの希望量を加えます。暗闇の中でさらに30分間孵化させてください。染色バッファーで細胞を洗浄し、デカントしてから400mLの染色バッファーに再懸浮します。サンプルチューブの採取準備完了。
5. 生死染色制御の準備として、トリプシン化と遠心分離の後、ペレットを2 mLの染色バッファーに溶かします。別のマイクロ遠心分離機管で1mLを取り出し、そこに10mLのDMSOを加えて細胞を殺します。ボルテックスして10分間抱卵します。次に、これを他の1mLの細胞含有溶液とフローチューブで混ぜます。
6. 染色バッファー1mLを加え、230 x g で7分間回します。ペレットをデカントして破壊しろ。Ghost Red 780生存性染料1 mLとFACSバッファー50 mLを加え、再懸濁してフローチューブに入れます。暗闇で30分間ステインをつける。30分後に1mLの染色バッファーで細胞を洗浄します。ペレットをデカントして破壊しろ。400mLのステインバッファーに再懸浮させてください。生死体が染まったサンプルは採取準備が整った。
   注意:マウスマクロファージ染色の場合、標準染色プロトコルの前に追加の染色工程を追加する必要があります。フローデータの不正確さを避けるために、FC受容体の遮断は重要なステップであり、非特異的抗体が細胞上のFc受容体に結合するのを防ぎます。Fc受容体を阻害するには、細胞懸浮液に1mLのFc阻害試薬(精製抗マウスCD16/CD32抗体)を加え、室温で15分間培養します。残りのフロー抗体染色工程は、Fcブロッキング試薬を洗い流さずに行います。
7. 流れデータを解析するには、まず前方散乱および側散乱パラメータに基づいて単一セルを選択する必要があります。この工程は、ゴミや細胞の集合体を除去するために非常に重要です。その後、単一細胞は生死染色に基づいてゲートされます。生細胞集団に基づいてさらに解析を行います(補足図2)。

結果

全体の実験回路図は 図1に示されています。マウス骨髄は大腿骨と脛骨の両方から採取され、種子化、通過、フローサイトメトリーの特性評価が行われました(図1A)。BMSCの条件培地(BMSCs-CM)をIFNγ事前認可の有無にかかわらず収集し、BMSCs-CMのバイアルは将来の実験用に-80°Cで保管されました(図1B)。

骨髄由来の細胞はヘモサイトメーター(図2A)で数えられ、完全なDMEM培地中に5000細胞/cm^²の密度でシードされました。48時間後、最初の培地を交換し、その後は3〜4日ごとに培地を交換し、完全に合流するまで続けました。細胞が80%の合流度に達した時点で胚胎継代を行いました(図2B)。4番では、MSC特異的マーカー発現に基づいて細胞を特徴付けました。細胞はCD44、CD29、CD90陽性、CD45、CD11b、CD34は陰性でした(図2C)。BMSCは脂肪形成系統、骨形成系統、軟骨起源系統に分化できます 14,27,28,29。これは国際細胞療法学会のアイデンティティガイドラインを維持しています。

MSCs-CMの免疫抑制効果を理解するために、腹膜腔由来マクロファージ(PMφ)を治療し、BMSCs-CMで処理しました(図3A)。BMSCs-CM処理マクロファージのフローサイトメトリー解析を行いました(図3B、C)。腹膜腔に常駐する培養適応マクロファージは、M1およびM2特異的表面マーカーで染色されました。細胞マーカーの染色前に、マクロファージを精製した抗マウスCD32/CD16(マウスFc Block)でインキュベートし、染色抗体を加えることで非特異的抗体結合を防ぎました。M1特異的マーカーであるCD86およびiNOS、およびM2特異的マーカーであるCD206およびCD163の発現が研究されました。細胞は最初に造血マーカーCD45.2(C57BL6の場合)に基づいてゲートが特定されました。IL-10はM2表現型のシグネチャーサイトカインです。MSCs-CM処理マクロファージから放出されるIL-10はELISA試験で測定されました(図3D)。LPS/IFNgはM1^偏極を誘導するため、この処理は陰性対照群として機能しました。

CCL2はMSCのセクレトームで同定されるシグネチャーサイトカインの一つであり、マクロファージ分極を誘発します^。MSCによって放出されたCCL2はELISA(図3E)によって検出されました。マクロファージ分極におけるCCL2の役割を確認するため、マクロファージをCCR2阻害剤で前処理し、その後MSC-CM処理を行い(図3F)、再びIL-10 ELISA研究でマクロファージ分極を検出しました(図3F)。

我々の結果は、MSCのセクレトームが抗炎症性マクロファージ分極を誘導できることを明確に示しており、これは条件付け培地処理後の腸由来マクロファージにおけるIL-10産生の増加によって示されています(図3)。

図1:研究フローチャート。 (A) C57BL/6匹のマウスが安楽死されました。骨髄は大腿骨と脛骨の両方から洗浄され、遠心分離され、培地を3日ごとに交換しながら1週間培養されました。MSCはパセジングされ、4番目のパスではフローサイトメトリーおよび脂肪形成解析で特徴づけられました。(B) 4つのパスを6ウェルプレートにシードし、1セットは25 ng/mL濃度のIFNγを加え、もう1セットは未処理で保管しました。48時間後、通常の新しい完全なDMEMメディアに交換してください。24時間後に、プレート、遠心分離機、フィルターから媒体を採取します。状態のメディアは-80°Cで保存し、将来使用します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:表現型の特徴付け。 (A) 種子授種前にヘモサイトメーターで骨髄由来の細胞を数えました。(B) 細胞は各通過前に80%の合流率まで成長させました。(C) 4番のパステージはマウスMSC特異的マーカーを用いたフローサイトメトリー解析で特徴付けられました。スケールバーは100 mMを表しています。 図2C は¹⁴から修正されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:BM-MSCセクレトーム解析。 (A) 実験の回路図。(B) MSC-CM処理PMφの代表的なプロット・フォーフローサイトメトリー解析。腹膜由来の細胞は造血マーカーのCD45.2陽性集団に基づいてゲートが特定されました。選定された集団は、M1特異的マーカーCD86またはiNOS、M2特異的マーカーCD206またはCD163、さらにCD11bの二重染色でそれぞれ染色されました。(C) 細胞のM1またはM2集団の割合を定量化した。LPS/IFNγで処理された細胞集団が陰性対照として機能しました。(D) MSC-CM処理PMφによって放出されたIL-10を定量するためにELISAを実施しました。ELISAは、MSC-CMによって放出された(E)CCL2、PMφによって放出された(F)IL-10を定量するために実施されました。図に示されているように、1セットの実験はCCR2拮抗薬の存在下で行われました。誤差バーはSEM±平均を表しています。データは3つの独立した実験、各グループに3つのMSCサンプルを代表しています。学生のt検定を用いてすべての実験の統計解析を行いました。∗p < 0.05、∗∗p < 0.01、∗∗∗p < 0.001、∗∗∗∗p < 0.0001。図3B-Fは¹³から修正されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1: BMSCは0、5、10、25、50、100 ng/mLのIFNgで事前認可されていました。マクロファージはIFNγで事前認可されたMSCs-CMで処理されました。ELISAはMSC-CM処理PMφによって放出されるIL-10の定量のために実施されました。誤差バーはSEM±平均を表しています。データは3つの独立した実験、各グループに3つのMSCサンプルを代表しています。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図2: (A-C)単一細胞は前方散乱および側散乱パラメータに基づいて選定されました。(D) 単一細胞は生死染色に基づいてゲート化されていました。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

マウス骨髄由来の間葉質質細胞の単離は、 生体内 動物モデルにおけるMSCの内在的な免疫抑制および再生特性を理解する上で重要な技術です。この方法は一見簡単で従いやすいように見えますが、細菌汚染を防ぎ最適な細胞収量を確保するためには、いくつかの手順を正確に実行する必要があります。処置の各段階は、超クリーンな環境で無菌的に行うべきです。

細胞の収率が低くなるため、6〜8週齢のマウスを選びます。大腿骨と脛骨の端を切る際は、骨髓腔をできるだけ保護し、洗浄はしっかりとしながらも優しくして、完全に骨髄を抜く必要があります。分離された細胞は適切なCO₂濃度と加湿条件下で培養されるべきです。培地交換時には、汚染された造血細胞を除去するために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を優しく洗浄してから培地を交換することが重要です。造血細胞の汚染を防ぐため、再通過時のトリプシン化は5分を超えないようにします。初期の経過では培地の交換があまり速くならないようにしましょう。頻繁な培地交換は細菌汚染を引き起こす可能性があるためです。

各通過時に、一貫性と利用可能性を維持するために複数回のバッチに分けてクライオプリザードする必要があります。IFN-γプライミングについては、MSC調整された媒体の最も効果的な事前ライセンス条件を決定するために線量依存実験を行うべきです。実験では、5、10、25、50、100 ng/mLといった範囲のIFNγ濃度を試験し、MSCの事前ライセンスを取得しました。次に、最適濃度として25 ng/mLが特定されました。

データの完全性を保つために、特定のパッセージ番号の細胞はすべての実験アッセイで一貫して使用されるべきです。MSCのフローサイトメトリー特性評価には、表面受容体発現の信頼できる検出を確保するために、3回以上のパセージの細胞を使用するべきです。フローサイトメトリー染色時の生死細胞識別は、偽陰性の可能性を減らすために不可欠です。

この結果は、外因性に投与されるBMSCが大腸炎中の腸の炎症を軽減する重要なメカニズムを示しています。IFN-γプライミングは、MSC条件付け培地がマクロファージ分極に作用する効果を高めます。BMSCsから放出されるCCL2は、マクロファージに作用してM2分極を誘導する重要なケモカインです。私たちの先行の研究では、CCL2およびCXCL12ケモカインがマクロファージに協力して作用し、その分極を促進していることが示されました。このイベントは、T細胞およびB細胞の表現型の調節を通じて抗炎症シグナル伝達を伝播させるために不可欠です¹³。

本研究では、MSCの塑性付着特性に基づくBMSC分離の簡単なプロトコルを特に適用しました。フローサイトメトリーソーティングや免疫磁気ソーティングを用いて、MSC特異的表面マーカーに基づくBMSCを分離できます。しかし、これらの方法の両方において、試料準備中に多くの細胞を失う可能性があります。マウスの骨髄は非常に少ないMSCの数(骨髄細胞の約0.001%から0.08%と推定)を含んでいるため、標準的なプラスチック付着性特性に基づく分離法を好みました。しかし、この方法にはいくつかの欠点があります。主なリスクは造血細胞の汚染であり、MSCの治療能力を低下させる可能性があります。したがって、MSC特異的表面受容体を発現する細胞群がかなり多い特定の通過番号を特定することが重要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
垂直層流を持つ細胞培養フード、UV光とnbspを備え、
滅菌外科用はさみ
25/75 cm2フラスク
5/10mL注射器に27Gの針を使った
6ウェル培養皿
アキュターゼ	コーニング	#AT104
アンニットマウス F4/80 装甲兵員輸送車	バイオレジェンド	#123116
アンチマウスCD 11b PE	BD ファルミンゲン	#557397
アンチマウスCD 45.2 APC	BD ファルミンゲン	#558702
アンチマウスCD163 Percp eFluor710	eバイオサイエンス	#46-1631-80
アンチマウスCD206 PE	バイオレジェンド	#141706
アンチマウスCD86 FITC	BD ファルミンゲン	#553691
アンチマウスiNOS PE-Cy7	eバイオサイエンス	#25-5920-80
CCL2 ELISAキット	インビトロジェン	#554722
CCR2の敵役(RS 102895)	シグマ	#R1903
遠心分離機およびnbsp;
DPBS	コーニング	#21-031-CV
ダルベッコの変形鷲の中質(DMEM)	コーニング	# 10-013-CV
胎児用牛血清	シグマ	#F8067
フィルターメッシュ(70mm)
ゴーストレッド780バイアビリティダイ	トンボ・バイオサイエンス	#13-0865-T100
IL-10 ELISAキット	インビトロジェン	#88-7105-88
L-グルタミン	コーニング	#25-005-CI
位相差装置を備えた顕微鏡
マウスIFN&γ;	R&Dシステム	#485-MI-100
ペニシリン・ストレプトマイシン	コーニング	#30-002-CI
ラット抗マウス CD16/CD32	BD ファルミンゲン	#553142
RPMImedium	コーニング	#10-040-CV
無菌外科用鉗子(直線かつ湾曲)
温度・ガス組成制御インキュベーター
トリプシン	コーニング	#25052-cl
温度制御付きの水浴