方法論記事

マウス胚性幹細胞における遺伝子間/遺伝子内エンハンサーRNA定量のための計算パイプライン

DOI：

10.3791/69400

⸱

2025年10月28日

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、初期のエンハンサー転写産物を定量化するための合理化された計算パイプラインを提供します。クロマチンアクセシビリティ、クロマチン特徴、転写データを統合することで、複雑な遺伝子内領域におけるエンハンサー活性の正確な検出と鎖特異的分析を可能にし、広範なバイオインフォマティクスのトレーニングを受けなくても研究者がアクセスできるようにします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エンハンサーとして知 られるコアシス調節要素は、多様な細胞機能や発生過程を制御する標的遺伝子の正確な転写調節を可能にする上で中心的な役割を果たします。これらのエンハンサーは多くの場合、両方向に転写され、エンハンサーRNA(eRNA)と呼ばれる長い非コード転写産物を生成します。eRNAの発現は、H3K27acや共活性化因子の動員などの活性クロマチンの特徴と密接に関連しており、標的遺伝子の転写活性化に機能的に寄与しています。それにもかかわらず、eRNAの検出と定量は、特に宿主遺伝子の転写と重複する場合、依然として困難です。これに対処するために、初期のRNAシーケンシングデータからエンハンサー転写を分析するための標準化されたユーザーフレンドリーな計算ワークフローを提示します。このプロトコルは、データの前処理、リードマッピング、品質管理、その後、シグナル割り当てが複雑な遺伝子内エンハンサー専用の手順を使用して、エンハンサー関連転写の鎖特異的定量化を通じてユーザーをガイドします。視覚化モジュールにより、ゲノムコンテキスト全体にわたるエンハンサー活性の明確な検査が可能になり、組み込みのオプションは遺伝子間エンハンサーと遺伝子内エンハンサーの両方の分析をサポートします。バイオインフォマティクスの専門知識が限られている研究者向けに設計されたこのワークフローは、エンハンサー転写の一貫性があり、再現性があり、スケーラブルな研究のための実用的なフレームワークを提供し、多様なシステムにわたるエンハンサー生物学のより広範な応用を促進します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エンハンサーは、クロマチンループを組織化し、転写機構を動員することにより、標的遺伝子の転写を制御するシス調節DNA要素です1,2,3。それらの組織特異的活性は、発生および系統コミットメント中の正確な調節を可能にします4,5,6,7,8。活性エンハンサーは、H3K4me1(ヒストンH3リジン4モノメチル化)やH3K27ac(ヒストンH3リジン27アセチル化)などの特徴的なクロマチン特徴を示し、通常、オープンクロマチン9、10、11、12をマークするDNase I過敏領域に見られます。これらの特徴により、転写因子とRNAポリメラーゼIIがDNAにアクセスし、エンハンサー遺伝子座13、14、15、16で初期転写を開始します。

この連続した生物学的プロセスは、双方向、非コーディング、および通常は非ポリアデニル化RNAであるeRNAと呼ばれるエンハンサー由来の転写産物を生成します13,14,15,16。eRNAはエンハンサー活性のマーカーとして機能し、それ自体がエフェクターとして機能します16,17,18,19,20,21,22,23,24。それらは、一時停止したRNAポリメラーゼIIから負伸長因子(NELF)を放出することにより生産的な伸長を促進し16,19,エンハンサープロモーターループ17,18,20を安定させるのに役立ちます。それらはまた、潜在的にm6A(N6-メチルアデノシン)修飾21,22,23を介して、転写凝縮物の形成をサポートします。

それでも、遺伝子体内の調節要素から開始される遺伝子内エンハンサー転写の機能については、依然として議論の余地があります。いくつかの研究では、遺伝子内エンハンサー由来のeRNAが、NELF放出と刺激依存性生産伸長を促進することにより、宿主遺伝子発現を増強することが報告されています2526,27。対照的に、他の研究は、この転写がRNAポリメラーゼIIの衝突または転写干渉を介して宿主遺伝子を妨害し、減衰または早期終了につながる可能性があることを示唆しています28,29。これらの相反する観察結果は、マーカーおよび調節因子としての eRNA の二重の役割とともに、慎重な定量化と機能解剖の必要性を浮き彫りにしています。しかし、遺伝子内eRNAはセンス鎖宿主転写産物13、25、26、30と重複することが多いため、遺伝子内eRNAの測定は困難です。エンハンサーがネストされた遺伝子または両方の鎖に転写が重複している領域に存在する場合、この課題は増幅され、エンハンサー特異的シグナルが不明瞭になります。

これらの課題を克服するために、特に遺伝子内領域に焦点を当てて、エンハンサー関連転写産物を検出、定量、視覚化するバイオインフォマティクスパイプラインを開発しました。このパイプラインは、シーケンシング(ATAC-seq)、クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)、グローバルランオンシーケンシング(GRO-seq)、およびゲノムアノテーションを使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイを統合し、複雑なゲノムコンテキストでもエンハンサーレベルの分解能を達成します。

パイプラインは、4つの主要なステップからなる:(i)前処理、アライメント、ピーク呼び出し、および信号生成31;(ii)クロマチン特徴を用いたエンハンサーの同定。(iii)特に遺伝子体内の鎖配向の割り当て。(iv)新生エンハンサー転写産物の定量化と視覚化。このフレームワークは、本研究で解析したマウス胚性幹細胞など、高解像度のシーケンシングデータを持つシステムに特に有用であり、適切なデータセットが利用可能であれば、他の生物にも拡張することができます。このワークフローは、既存のパイプラインでは不十分なエンハンサー固有の定量を可能にすることで、さまざまなゲノムコンテキストにわたる遺伝子内 eRNA 転写のベンチマークと研究のための実用的なツールを提供します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:ワークフローで使用されるすべての生データセットを 表1に示します。バイオインフォマティクスツールの詳細は 、材料表に記載されています。このパイプラインで使用されるスレッドの数は、各スクリプトの先頭で定義されている THREADS 変数を変更することで調整できます。ユーザーは、ユーザーのCPUリソースに応じて、分析を高速化するために数を増やすことができます。
各ステップの後、ログ ファイルが生成されます。迅速な障害チェックには、 cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt &; echo "ERROR found.次のステップの前に修正してください。」 ||echo "OK: no ERROR markers"です。エラーが表示された場合は、そのステップを失敗として扱い、最初に解決します。

1. GitHubリポジトリからの完全な分析パイプラインのダウンロード

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. 使用するオペレーティングシステムに適したコマンドラインインターフェイス(CLI)を起動します。
    1. Windows: Windows Subsystem for Linux (WSL) を使用して Linux 環境を設定します。32 に進む前に、公式の指示に従って WSL をインストールして構成します。
    2. macOS: macOS は Unix ベースであるため、追加の設定なしで続行します。ターミナル33を開くには、公式ガイドを参照してください。
    3. Linux ユーザー、特に Ubuntu を使用しているユーザー: 参照されている手順34 で説明されているようにターミナルを開きます。
  2. ターミナルで wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   を実行して、エンハンサー同定とエンハンサー RNA 定量用のパイプラインをダウンロードします。
  3. ターミナルに unzip ~/pipeline.zip -d ~/ と入力します。これにより、必要なすべてのファイルがホームディレクトリに抽出されます。
  4. rm ~/pipeline.zip を実行し、mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization と入力して、アーカイブを削除し、抽出したフォルダーの名前を変更します。
  5. cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/と入力し、chmod +x scripts/* を実行して、"scripts/" ディレクトリ内のすべてのスクリプトを実行可能にします。

2. 解析パイプライン用の mamba/conda 環境の設定

  1. bash scripts/Step1_conda_environment_formation.shと入力して、mamba 仮想環境を作成して実行します。実行中にプロンプトが表示されたら、「Y」と入力し、Enter キーを押してパッケージのインストールを確認します。macOS の場合は、手順 2.1.1 に従います。Mamba または Conda がすでにインストールされているシステムの場合は、手順 2.1.2 に従います。
    1. MacOS: スクリプトを開き、miniconda ダウンロード リンクを macOS バージョンに置き換えます。
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      次に、手順 2.1 に従います。
    2. プロンプトに (enhancer-env) が表示されたら、 bash scripts/Step2_package_installation.sh と入力して、ダウンストリーム分析に必要なパッケージをインストールします。 Y と入力し、インストール中にプロンプトが表示されたら Enter キーを押します。
    3. 手順 2.2 を実行した後、ターミナル出力にエラー メッセージがないか確認します。問題を解決します。次に、ステップ2.2を再実行します。
    4. (オプション) mamba list を実行して、 材料表 内のすべての mamba 管理パッケージがインストールされていることを確認します。HOMER は手動でインストールされ、マンバ リストには表示されません。「~/homer/」ディレクトリが存在することを確認して、HOMERを確認します。

3. SRAから公開されているChIP-seq、ATAC-seq、およびGRO-seqデータセットをダウンロードします(Sequence Read Archive)

  1. cp scripts/Step{3..12}_*.sh./ を実行して、生の読み取り処理に必要なシェルスクリプトをコピーします。
  2. bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1と入力し、Enterキーを押して、SRAから生のシーケンスデータをダウンロードして処理します。
    注:このスクリプトは、分析用の公開シーケンシングデータのダウンロードと準備を自動化します。「MATERIAL/」の下に標準化されたフォルダー構造を作成し、アッセイタイプと複製(生物学的:rep1/rep2、技術:trep1/trep2)ごとに整理します。SRA アクセッション番号の組み込みリストにより、プリフェッチ (v3.2.0) による取得、fasterq-dump (v3.2.0) による FASTQ への変換 (paired-end: --split-files)、およびストレージを削減するための pigz (v2.8) による圧縮が促進されます。処理は、prefetch、fasterq-dump、pigzに従い、出力は対応する「00.Rawdata/」ディレクトリに書き込まれます。

4. 品質管理と生リードのトリミングを実行する

  1. bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 と入力して、生の FASTQ ファイルの読み取りトリミングと品質管理を実行します。
    注:このスクリプトは、GRO-seq、ATAC-seq、およびChIP-seq(H3K27ac、H3K4me1)からの生のFASTQファイルを、対応する入力コントロールとともに処理します。生のリードでFastQC(v0.12.1)35 を実行し、アッセイ固有のパラメータを使用してTrim Galore(v0.6.10)36 でアダプターをトリミングします。GRO-seqの場合、最初にNextSeq Gテールと非常に短いリード(--nextseq 20、--length 20)を削除し、次にCutadapt(v5.1)37 を使用して、20ヌクレオチド( -a A{15}、-m 20)よりも長いリードを保持しながら、長いポリAトラクトを剥がします。ATAC-seq の場合、ペアエンドライブラリを処理し、Tn5/Nextera アダプター (--paired, --nextera) をターゲットにします。H3K27acおよび対応する入力の場合、ペアエンドのChIP-seqライブラリ(--paired)を処理します。H3K4me1 とその入力では、標準のシングルエンド トリミング (デフォルト) を実行します。FastQC は、トリミングされた読み取りで再度実行されます。出力は各アッセイの「01.Clean/」ディレクトリに書き込まれ、中間のGRO-seqアダプタートリミングファイルは削除されます。

5. Bowtie2 参照インデックスを準備する

  1. 以下の2つのオプションのいずれかを選択して、mm10(Mus musculus)リファレンスゲノムのBowtie2(v2.5.4)38ゲノムインデックスを準備します。
    1. bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1 を実行して、開発者が提供する事前構築済みの Bowtie2 インデックスを使用します。
    2. 走る バッシュStep5_2_download_reference_make_index_with_
      2>&1 bowtie2.sh > Step5_2_log.txt       生のMM10ゲノム配列をダウンロードし、手動でインデックスを構築します。
      注: どちらの方法も、"reference_index/" ディレクトリへのインデックス ファイルを生成し、標準配置と機能的に同等です。

6. トリミングされたリードをmm10リファレンスゲノムにアライメントする

  1. bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1と入力して、各アッセイのリードを参照してBAMファイルを生成します。
    注:このステップでは、各アッセイのリードを以前にインデックス化されたmm10リファレンスにマッピングします。H3K27ac ChIP-seqおよび対応する入力は、デフォルトの感度でバランスの取れた精度(-1、-2)のためにペアエンドマッピングを使用します。H3K4me1 ChIP-seqおよび対応する入力は、デフォルト設定(-U)でシングルエンドマッピングを使用します。ATAC-seqは、高感度マッピングを使用して、ペアエンド入力(-1、-2)を持つ可変で長いTn5由来フラグメント(--very-sensitive、-X 2000)に対応します。GRO-seq は、高感度マッピングを使用して、シングルエンド入力 (-U) で短いトリミングされたリード (--very-sensitive) をより適切に配置します。SAM ファイルは BAM に変換され、samtools (v1.22.1)39 ビューでフィルタリングされ、ChIP/入力には中程度の MAPQ (-b, -q 10) を使用し、ATAC-seq と GRO-seq (-b, -q 30) にはより厳しいしきい値を使用します。最終的な BAM ファイルは、各データセットの "02.Align/" ディレクトリに書き込まれます。

7. H3K27ac ChIP-seqデータのテクニカルレプリケートをマージする

  1. bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 を実行して、H3K27ac ChIP-seq のテクニカル レプリケートと対応する入力 BAM ファイルをマージします。
    注: このスクリプトは、sambamba (v1.0.1)40 ソートを使用してテクニカル レプリケートの BAM ファイルをソートし、H3K27ac ChIP-seq と対応する入力レプリケートを sambamba マージを使用して統合 BAM にマージします。ユーザーのデータセットにテクニカル レプリケートが含まれていない場合は、この手順をスキップして、個々の BAM ファイルで続行します。

8. 重複染色体と必須ではない染色体を削除する

  1. 重複を削除し、ChIP-seqおよびGRO-seqのマッピングされたリードをソートします。
    1. bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1と入力して、ヒストンChIP-seqデータセットから重複を削除し、ChIP-seqとGRO-seqの両方の出力BAMをソートします。
      注:このスクリプトは、sambaba markdup(-r)でPCRの重複を削除し、sambaba sortでcoordinate-sortを削除します。H3K27ac の場合、処理はマージされたテクニカル レプリケートからの BAM をターゲットにし、ChIP と入力を個別に処理します。H3K4me1 の場合、各反復入力と一致した入力は個別に処理されます。GRO-seq の場合、重複削除はスキップされ、座標ソートのみが適用されます。出力は、各データセットの「02.Align/」ディレクトリに保存されます。
  2. 重複を削除し、ATAC-seqからミトコンドリア染色体マッピングされたリードをフィルタリングします。
    1. bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1と入力して、PCRの重複を削除し、ミトコンドリアリード(chrM)をフィルタリングし、ATAC-seq BAMをソートします。
      注: このスクリプトは、ATAC-seq データ処理の ENCODE パイプラインの推奨事項を参照します。まず、sambamba sort (-n) で名前のソートを実行し、samtools fixmate (-m) を使用してメイトペア情報を固定します。この手順により、重複をマークする前に合致情報が適切に割り当てられるようになります。その後、PCRの重複は、sambamba markdup(-r)を使用して削除されます。ミトコンドリアの読み取りは、samtools idxstats からキープリストを生成し (chrM と * を除く)、samtools ビュー (-b) でリストされた参照のみを保持することによって削除されます。最終的な座標ソートはサンバンバソートで行います。クリーンアップされた BAM は、各レプリケートの "02.Align/" ディレクトリに書き込まれます。

9. データセットごとにピーク呼び出しを実行する

  1. bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 と入力してステップ 9 スクリプトを実行し、ChIP-seq および ATAC-seq データのピーク呼び出しを実行します。
    注:このスクリプトは、ATAC-seqおよびChIP-seq(H3K27ac、H3K4me1)のMACS3(v3.0.3)41 でピークコールを実行します。ATAC-seq は、すべての複製 BAM をシフト/拡張 (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01) のモデルなしモードで信号として供給することにより、ピークを生成します。H3K27acは、入力が一致したマージされたテクニカルレプリケートからブロードピークを呼び出します(-f BAMPE、--broad)。H3K4me1は、シングルエンドブロードモード(-f BAM、--broad)で一致した入力を使用して各複製を個別に処理し、ベッドツール(v2.31.1)42 が交差すると重複するピークが得られます。出力は各データセットの「peak_calling/」ディレクトリに書き込まれ、「peak_calling/overlapped_peak/」の下に信頼度の高いH3K4me1ピークが記録されます。

10. ChIP-seqおよびATAC-seq BAMファイルの生物学的複製をマージして、ダウンストリームシグナル解析を行います。

  1. bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 を実行して、ATAC-seq と H3K4me1 ChIP-seq の生物学的複製から BAM ファイルをマージします。
    注:このスクリプトは、ATAC-seq、H3K4me1 ChIP-seq、および対応するH3K4me1入力のsambamba mergeとレプリケートBAMを組み合わせます。マージされたBAMは、ダウンストリーム分析(bigWig信号の生成、正規化など)をサポートします。出力 BAM は、各サンプル パスの下の "merge/02.Align/" ディレクトリに保存されます。

11. タグディレクトリを生成し、マップされた読み取りからbigWigファイルを通知する

  1. bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 を実行してタグディレクトリを作成し、各データセットのマッピングされた読み取り用の bigWig シグナルファイルを生成します。
    注:このスクリプトは、makeTagDirectoryを使用してHOMERタグディレクトリを構築し、HOMER(v5.1)43およびucsc-bedgraphtobigwig(v482)44パッケージを使用してmakeUCSCfileコマンドでbigWig信号トラックを生成します。すべてのシグナルトラックは、UCSC Genome Browser(https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/)の染色体サイズファイルを使用して作成されます。GRO-seq は、鎖固有の信号トラック (-style rnaseq、-strand + / -, -bigWig) を生成します。ATAC-seq は、マージされた BAM (-bigWig) から正規化されていないトラックを生成します。ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) は、擬似カウントが 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1) の入力正規化されたトラックを生成します。出力は「03.TagDir/」と「04.bigwig/」の下に整理されています。

12. エンハンサー同定のためのファイルを準備する

  1. ターミナルに bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 と入力して、エンハンサー識別に必要なファイルと参照を準備します。
    注:このステップでは、エンハンサーの識別に必要なすべてのファイルを「ATAC/」、「Histone/」、および「Annotation/」フォルダに整理された「01.E_identification/material/」に収集します。ピークファイル(ATAC-seq、H3K27ac、H3K4me1)を適切なディレクトリにコピーします。GENCODE M23アノテーションファイル(mm10)が自動的にダウンロードされ、ENCODEブラックリスト45 (mm10-blacklist.v2.bed)や染色体サイズファイル(mm10.chrom.sizes)などの参照ファイルが定義済みのパスからコピーされます。

13. アノテーションからプロモーター候補と遺伝子体を特定する

  1. cd 01.E_identification/と入力して作業ディレクトリに入り、cp .を実行します。/scripts/Step{13..20}_*.sh ./ を使用して、エンハンサー識別スクリプトをコピーします。
  2. bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 を実行し、GENCODE アノテーションを使用してプロモーター領域、遺伝子体、およびタンパク質コード遺伝子 (PCG) の BED ファイルを生成します。
    注:このスクリプトは、ダウンロードしたGENCODE M23遺伝子転送フォーマット(GTF)を処理して、プロモーター候補、すべての遺伝子体、およびPCG体のBEDファイルを作成し、出力を「material/Annotation/」に保存します。プロモーターは、ベッドツールスロップ(-b 2000、-g mm10.chrom.sizes)を備えた各転写産物のTSS(転写開始部位)の周囲の2 kbのウィンドウとして定義されます。遺伝子およびタンパク質コード体は、遺伝子として注釈が付けられたGTFエントリに由来し、タンパク質コードエントリはさらに「gene_type = protein_coding」によってフィルタリングされます。

14. エンハンサー同定のためのプロセスピーク

  1. bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1 を実行して、エンハンサー同定のために ATAC-seq およびヒストン ChIP-seq ピークファイルを前処理します。
    注: このスクリプトは、エンハンサー呼び出しのピークセットを前処理します。ATAC-seq の場合、ベッドツール減算 (-A) でブラックリスト領域と重複する領域を削除し、ベッドツール減算 (-A) でプロモーター候補と重複するピークを除外します。ヒストンマーク(H3K27ac、H3K4me1)の場合、ベッドツールスロップ(-b 1000 -g mm10.chrom.sizes)で各ピークを両側で1 kbずつ対称的に拡張し、ベッドツールでプロモーターの重複を減算して除去します。

15. エンハンサーの同定と分類

  1. bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1 を実行し、クロマチンピークデータを使用してエンハンサーを定義および分類します。
    注:このステップでは、ベッドツールを使用してエンハンサーを定義し、注釈を付けます。ATAC-seqピークとスロップ展開H3K4me1ピークの間のオーバーラップは、交差(-wa、-u)で得られ、隣接したH3K27acピークとも重なる領域は、交差(-wa、-u)を持つ活性エンハンサーとして分類されます。非活性エンハンサーは、減算で完全なエンハンサーセットから活性領域を削除することによって導き出されます。各エンハンサーセットが重なるATAC-seqサミットは、交差(-u)で収集され、次にサミットは遺伝子体に対して交差(-v または -u)を伴う遺伝子間および遺伝子内に分割されます。エンハンサー間隔は、交差(-u)とのピークの関連する頂上に基づいて、最終的に遺伝子間/遺伝子内クラスに割り当てられます。すべての結果は、"01.allE/"、"02.interE/"、"03.intraE/"の下の"01.E_identification/"に保存されます。

16.遺伝子内エンハンサーに一時的な鎖情報を割り当てる

  1. bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1と入力して、一時的な鎖情報を遺伝子内エンハンサーBEDに割り当てます。
    注:このステップでは、ベッドツール交差(-wa、-wb)を使用してエンハンサー間隔を遺伝子体と重ねることにより、遺伝子鎖標識を遺伝子内エンハンサーに割り当てます。列 1、2、3、4、5、16 は awk で保持され、レコードはソートされ、重複排除されます。出力は「03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed」として保存されます。

17.両方の鎖遺伝子が重複するエンハンサーの鎖割り当てに優先順位を付ける

  1. bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1をタイプして、遺伝子内エンハンサーの鎖方向を解決します。
    注:このスクリプトは、PCGのオーバーラップを優先することにより、両方の鎖で遺伝子を重複させる遺伝子内エンハンサーの鎖のあいまいさを解決します。両方の鎖に存在するエンハンサーが最初に単離され(chrom/start/end/id/strandによるawkグループ化)、同じ鎖上のPCGオーバーラップケースはbedtoolsが交差し(-s、-wa、-u)で選択され、非PCGケースはbedtoolsが交差(-v)で保持されます。選択されたセットと保持されたセットは連結され、順序付けられます。出力: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed"。

18. PCG優先順位付け遺伝子内エンハンサーと重複する遺伝子の鎖特異的Reads Per Kilobase Per Million Mapped Reads(RPKM)値を計算します

  1. bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 と入力して、同じ鎖上のエンハンサーが重複する遺伝子の鎖特異的 RPKM を計算します。
    注:このステップでは、ステップ17の「ES_E_intragenic_PCG_priority.bed」を使用しますが、これには、(i)1本の鎖でPCGを重ねて鎖を受け取った、(ii)両方の鎖でPCGを重ねてあいまいなままである、または(iii)PCGのオーバーラップがなく、両方の鎖を保持するエンハンサーが含まれています。同じ鎖が重なる遺伝子は、ベッドツールが交差する(-s、-wa、-u)で選択され、awkを介してGTFに変換され、featureCounts(v2.1.1)46 鎖特異的カウントモード(-s 1、-t遺伝子、-g gene_id、-O、--画分)を使用してGRO-seqから定量化されます。マッピングされたリードの合計はsambamba flagstatで取得され、RPKMは遺伝子の長さ、カウント、および合計から計算されます。出力は「03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/」に書き込まれます。

19. 重複する遺伝子の遺伝子発現(RPKM)に基づく最終鎖の割り当て

  1. bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 を入力して、遺伝子内エンハンサーの鎖割り当てを完了します。
    注:このステップでは、ステップ18の遺伝子発現サポートを使用して、鎖を遺伝子内エンハンサーに割り当てます。エンハンサー(ES_E_intragenic_PCG_priority.bed)と遺伝子間の同じ鎖の重複は、ベッドツールが交差する(-s、-wa、-wb)で見られます。遺伝子RPKM値は、awk/sort/joinを介して遺伝子間隔に結合され、遺伝子RPKM BEDが生成されます。エンハンサーごとに、RPKMが最も高い重複する遺伝子が選択され、エンハンサーはその遺伝子の鎖を継承します。結果は「03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed」に保存されます。

20.遺伝子内エンハンサーとエンハンサーサミットに鎖情報を割り当てる

  1. bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1と入力して、決定された鎖情報をすべての遺伝子内エンハンサーと各サミットに割り当てます。
    注:このステップでは、ベッドツールを使用して、遺伝子内エンハンサーとマッチングサミットの鎖割り当てを最終決定します。反対側の鎖間隔は減算(-S)で削除され、鎖で指定されたエンハンサーは交差(-wa、-u)を使用してアクティブセットと非アクティブセットと交差し、サミットファイルは交差(-wa、-wb)を介して鎖で指定されたエンハンサーと重なり合うサミットによって再注釈が付けられ、awkで鎖を取得します。結果は「03.intraE/final_strand_IntragenicE/」とその「summit/」サブフォルダに保存されます。

21. エンハンサーの検証、eRNAの定量化、および視覚化のための入力ファイルを準備します

  1. cd と入力します。/ または cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization を使用してパイプラインルートに移動し、 cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ と入力して、ダウンストリーム分析の準備用のスクリプトをコピーします。
  2. bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1を実行して、エンハンサー凝集、GRO-seqシグナル処理、およびeRNA定量に必要なすべてのファイルを準備します。
    注:このステップでは、エンハンサーの検証、eRNAの定量化、およびシグナルの視覚化のために、入力ファイルとディレクトリ構造を「02.E_visualization_quantification/」で準備します。サブフォルダーは、bigWigファイル、エンハンサーBED、BAM、信号行列、カウント、およびプロット用に作成されます。サミットBED、bigWigs、エンハンサーリスト、GRO-seq BAMなどの主要な入力は、適切な場所にコピーされます。

22. エンハンサー検証用の集計プロットを生成する

  1. cd 02.E_visualization_quantification/と入力して作業ディレクトリに入り、cpと入力します。/scripts/Step{22..24}_*.* ./ ダウンストリーム解析に必要なスクリプトをコピーします。
  2. bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1 を実行して、エンハンサーサミットの各タイプの周囲のクロマチンシグナルの集約プロットを生成します。
    注:このステップでは、deepTools(v3.5.6)47のcomputeMatrixとplotProfileを使用して、エンハンサーサミットを中心とした平均クロマチンシグナル濃縮を視覚化します。定義されたエンハンサー セットごとに、computeMatrix reference point (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) は、ATAC-seq、H3K27ac、および H3K4me1 の bigWig ファイルを使用して、エンハンサー サミット周辺の 10 kb ウィンドウ内の信号密度を計算します。出力行列は plotProfile に渡され、エンハンサー グループ間の比較のための信号集約曲線が生成されます。集計プロットは「01.Profiling/04_1.aggregation/」ディレクトリに保存されます。

23. エンハンサーRNA発現の定量化と可視化

  1. bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1を実行し、featureCountsを使用してGRO-seqからのeRNA発現レベルを定量します。
    注:このステップでは、GRO-seqを使用して、定義されたエンハンサー領域からのeRNA転写を鎖特異的な方法で定量します。遺伝子間エンハンサーは、非鎖モード(-s 0、-tエンハンサー、-g gene_id、-O、--画分)でfeatureCountsでカウントされ、遺伝子内エンハンサーはアンチセンスモード(-s 2)で定量化され、重複する遺伝子転写からシグナルを除外します。BED領域は、カウントする前にawkでGTFに変換されます。マップされた読み取りの合計は sambamba flagstat から取得され、カウントはエンハンサーの長さ、読み取りカウント、およびマップされた読み取りの合計を使用して RPKM に正規化されます。出力は「02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/」の下に「inter/」と「intra/」で整理されます。
  2. Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcriptを実行します。R > Step24_log.txt 2>&1 を使用して、R を使用してエンハンサー群間の eRNA 発現レベルを視覚化および比較します。
    注:Rスクリプトは、ggplot2(v3.5.2)48 およびcowplot(v1.2.0)49 パッケージを使用して、RPKM値に基づいてアクティブエンハンサー発現と非アクティブエンハンサー発現を比較するバイオリンおよび箱ひげ図を生成します。視覚化と統計テストのために、RPKM 値はログ2 (RPKM + 1) に変換されます。統計的有意性は、ウィルコクソン順位和検定を使用して評価されます。サマリープロットとp値テーブルの両方が、下流の解釈のために「03.eRNA_visualization/」に保存されます。
    注: このパイプラインのいずれかのステップが失敗し、再実行後も継続する場合は、https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to ビジュアライゼーション/問題で問題を報告してください。失敗したステップを明確に記載し、ログファイルを添付することで、正確なトラブルシューティングサポートが保証されます。

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結果

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エンハンサー転写物定量パイプラインの概略的なワークフロー
公開されているChIP-seq(H3K27ac、H3K4me1)、ATAC-seq、およびGRO-seqデータセット(表1)は、主に検証用に設計された標準化されたパイプラインで処理されました。アダプターのトリミングと品質フィルタリングをTrim GaloreとCutadaptで行い、続いてBowtie2を使用してmm10リファレンスゲノムにアライメントしました(プロトコルステップ6で詳しく説明)。ChIP-seqおよびATAC-seqでは、MACS3でピークを同定し、HOMERおよびucsc-bedgraphtobigwigを使用してシグナル強度トラック(bigWigファイル)を生成し、下流の可視化と定量分析を行いました(図1A)。この一貫した前処理により、データの互換性が確保され、アッセイ固有のバイアスが最小限に抑えられ、下流のエンハンサー定量のための信頼性の高いフレームワークが提...

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ディスカッション

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エンハンサー由来の転写産物13,14,15の発見に続いて、特にeRNAが宿主遺伝子転写産物と重複することが多い遺伝子内コンテキストでは、eRNAを正確に定量することは依然として大きな課題です。この重複により、鎖の割り当てとシグナルの帰属が複雑になり、本物のエンハンサー転写をバックグラウンド遺伝子発現と区別することが困難になります13,25,26,30。eRNAはエンハンサー活性の機能的指標としてますます認識されていますが、この分野にはエンハンサー転写物を定量するための標準化されたアクセス可能なフレームワークが不足しています。このニー...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、韓国忠南国立大学 [2022-0582-01 (S.-K.K.) および 2023-0545-01 (S.-K.K.)] の研究資金によって支援されました。 図 1 は、BioRender (https://biorender.com/) を使用して作成しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ベッドツールユタ大学クインラン研究所およびnbsp;v2.31.1BEDファイルの編集用ユーティリティ
蝶ネクタイ2ジョンズ・ホプキンス大学ラングミード研究所v2.5.4リファレンスゲノムにリードをマッピングするためのマルチスレッドアライナー
カウプロットテキサス大学ウィルク研究所v1.2.0ggplot2ベースの図を組み合わせて整列するためのツール
カットアダプト科学生命研究所、ストックホルム大学v5.1アダプターとポリA/Gテールトリマー
ディープツールズマックス・プランク研究所バイオインフォマティクス施設v3.5.6定義されたゲノム領域内のリードを定量化するためのリードカウントツール
FASTQCバブラハム・バイオインフォマティクス、バブラハム研究所v0.12.1シーケンスリードの品質管理
featureCounts(サブリード)シラボ、モナシュ大学v2.1.1指定されたゲノム領域に対する生のリードカウントツール
ホーマーカリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)ベナー研究室v5.1ChIP-seq、ATAC-seq、および新生RNA解析のためのツールキット;タグディレクトリの作成と信号プロファイリングが含まれています
MACS3チャン・ザッカーバーグ・イニシアティブv3.0.3ChIP-seqおよびATAC-seqデータセットのピーク呼び出し
ピグズ.v2.8gzip圧縮ファイルを生成するマルチスレッド圧縮ツール
サンバンバペテルブルク国立大学v1.0.1マルチスレッドSAM/BAMファイル処理ツールキット
サムツールズウェルカムトラスト・サンガー研究所v1.22.1SAM/BAMファイルの処理および操作のためのツール
SRAツールズ国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)v3.2.0NCBI SRAデータベースからSRRファイルのダウンロード
タイディバースポジットPBCv2.0.0データ操作および可視化のためのRパッケージの収集
トリム・ガロアアルトス研究所、ケンブリッジ科学研究所v0.6.10アダプターとマルチスレッドによる低品質のベーストリミング
Ubuntu 20.04パイプラインの開発と試験
UCSC-bedgfåttobigwig カリフォルニア大学サンタクルーズ校ケント研究所V482bigWig信号トラックを生成するためのツール

参考文献

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GRO seq ATAC seq H3K27

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