研究記事

コラーゲンベースの合成皮膚モデルを用いた創傷病原体抑制のためのブルーライトLEDデバイスの研究

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DOI：

10.3791/69403

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2026年2月24日

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1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College, 2Cofan Thermal/Violumas

この記事について

サマリー

405nmのブルーライトLEDデバイスは、コラーゲンベースの合成皮膚モデルで評価したことで、幅広い創傷病原体に対して抗菌効果を示します。この簡略化された in vitro アプローチは、光を用いた抗菌療法の初期評価において再現性が高く倫理的に実現可能な代替手段を提供します。

要約

従来の創傷管理は、抗菌薬耐性の増加と従来の薬剤の細胞毒性副作用によりますます挑戦されています。光線療法、特にブルーライト(BL)を用いたものは、有望な非侵襲的かつ非接触的な代替手段を提供します。本研究では、コラーゲンベースの合成皮膚モデルを用いて、405nm BL-LEDデバイスの抗菌有効性と安全性を幅広い医学的に重要な創傷病原体に対して評価し、光を用いた抗菌検査にこのプラットフォームを応用する新規性を強調しました。この合成皮膚は、人間の皮膚の構造や地形を模倣し、よりリアルな環境を提供します。光の均一性マッピングでは、直径10cm(30.14 ± 0.78 mW/cm²)にわたって一貫した放射量が示されました。この装置は、フルエンス依存性微生物ログ減少率を最大3.5、27 J/cm2で達成し、類似の研究で報告されたものよりもはるかに高い有効性を示しました。ESKAPE病原体および カンジダ・アルビカンに対して広域スペクトル活性が確認されており、多元細菌創傷感染症の管理において大きな利点となっています。重要な発見は種ごとの感受性の違いであり、 クレブシエラ 肺炎が最も高い感受性を示し、 黄色ブドウ球菌 が最も耐性を示しました。これは微生物の包絡構造や感性分子含有量の変動が活性酸素種(ROS)に影響を与えるためと考えられます。光透過実験および表面対埋め込み型コロニー解析では統計的有意性は示されず、BLが皮膚下の病原体を阻害する可能性を示唆しました。赤外分光法により、BL曝露は高いフルエンス(108 J/cm²)でも、殺菌性UV-C制御で観察された損傷とは異なり、コラーゲンマトリックスの化学的または立体構造的な分解を検出しないことが確認されました。最後に、エアロゾルチャンバーでの独自の評価により、BL処理が表面の微生物沈着を95%以上減少させることが示され、院内感染の緩和に寄与する可能性が示されました。これらの発見は、皮膚模倣基質が前臨床試験におけるBL評価の代替手段として適していることを示し、動物モデルの必要性を排除しました。

概要

創傷感染は、世界の医療システムに持続的な課題と重大な負担をもたらし、患者の生活の質に影響を与えています。創傷治癒は、皮膚創傷の閉鎖を遅らせる微生物感染によって複雑化することが多いため、主に高齢者や糖尿病患者に病変や慢性的な傷が発生します。従来の創傷管理戦略は、抗生物質、消毒薬、化学薬品、そして主に創傷を引き起こす微生物を抑制する天然のバイオアクティブ剤に依存しています。これらの伝統的な方法は炎症細胞を減らし線維芽細胞の数を増やすことで治癒を早める効果がありますが、多くの副作用が伴います。創傷ドレッシングに使用される多くの局所抗菌薬は一般的に肌に優しくなく、皮膚の脱水、組織の刺激、創傷治癒に必要な細胞への細胞毒性などの望ましくない影響を引き起こす可能性があります2。抗菌薬耐性(AMR)は、主に全身的な抗生物質使用の過剰使用により広く報告されており、既存の薬理学的治療の長期的な有効性を脅かしています。既存の臨床実践の限界を踏まえ、特に非接触で痛みのない光線療法のような、より安全で持続可能な創傷ケアの代替手段の必要性が強調されています。

可視光スペクトルを利用する光線療法は、さまざまな皮膚科的および治療的応用における有望な非侵襲的かつ非薬理学的介入として徐々に注目を集めています。その応用範囲は、一般的な肌若返り4 や美容改善から、ニキビやアンチエイジング療法などの標的治療まで幅広くカバーされています。可視光波長(400〜760 nm)の中で、青色光は通常400 nmから480 nmの範囲であり、その多面的な治療効果から科学的および臨床的に大きな関心を集めています。紫外線(UV)放射線、特にUV-Cバンド(100-280nm)は殺菌性を持つため表面消毒に広く用いられていますが、DNA損傷、発がん、皮膚がんのリスクがよく知られていますが、ブルーライトは非電離放射線に分類されます。この根本的な違いにより、ブルーライトは細胞DNAを直接損傷したり変異原性を引き起こすエネルギーを持たないため、人間の組織にとって本質的により安全です。

ブルーライトの抗菌活性はグラム陽性6菌およびグラム陰性7菌の両方に対して報告されています。いくつかの臨床試験では、ブルーライト療法が一般的な感染症や疾患に対する有効性を検証しています。例えば、9期のニキビを引き起こすプロピオニバクテリウムの抑制や、ヘリコバクター・ピロリによる胃感染症10の治療などです。しかし、創傷感染の抗菌効果を調査した臨床試験は報告されていません。近年のin vitro研究では、紫青色光(400-420nm)が哺乳類細胞に対する細胞毒性を最小限に抑えつつ、複数のESKAPE病原体を不活化できることが示されています11。最近では、410〜430nmの範囲の青色光が線維芽細胞活性やコラーゲン沈着を調節し、細胞増殖を促進し、炎症反応を調節し、内因性ポルフィリン励起によって活性酸素種(ROS)を生成することが示されており、これは細菌細胞を破壊する効果があります。これにより、創傷治癒の応用に有望な候補となっています。

しかし、創傷治癒の複雑さは、個々の差異、創傷の種類、生理学的および既往病的状態など複数の変数によって決まり、研究において大きな課題を伴います。創傷治療の直接 的な生体内 試験は、生物学的多様性、倫理的配慮、創傷環境の複雑さから依然として複雑です。動物モデルは一般的に使われますが、人間の皮膚生理を正確に再現できておらず、厳しい規制要件によって制限されています13。臨床試験を含む創傷治癒研究は稀であり、サンプル数が小さいため代表性が低いことが多いため、大規模な統計サンプル、堅牢な対照、厳格な倫理的承認が必要です。これらの障壁を克服するために、人間の皮膚特性を再現した in vitro モデルが初期スクリーニングの効果的なプラットフォームとして登場しました。VITRO-Skinのようなコラーゲンベースの合成皮膚システムは、人間の皮膚のpH、保湿性、表面質感を模倣し、制御された条件下での外部介入の試験に最適です15。いくつかの研究では青色光の広域抗菌効果が示されていますが、ほとんどはブロス培養、寒天プレート、動物モデルを用いており、皮膚状基質への応用は限定的です。

ブルーライトの実証された可能性と in vitro モデルの利点を基に、本研究はピーク波長405 nmで動作する発光ダイオード(LED)デバイスの一般的な創傷病原体抑制の有効性を検証することを目的としています。私たちは、コラーゲンベースの合成皮膚に適用した簡略化されたマイクロバイオームモデルに基づく、創傷治癒効果を評価する新しい評価手法を導入します。また、抗菌効果と、発光ダイオード生成青色光(LED-BL)が殺菌性UV-Cフルエンスと皮膚の地形に与える影響を比較しています。この方法は生物学的システムの複雑さには及びませんが、実用的なアプローチを採用しており、in vivo 試験や臨床試験に伴う変動性や倫理的複雑さを回避し、高度に管理され再現性の高い実験を可能にし、類似の新規治療介入の予備評価と初期スクリーニングを加速させます。本研究の中心的な革新は、コラーゲンベースの皮膚モデルを再現可能かつ制御可能なプラットフォームとして青色光の抗菌効果を評価するプラットフォームとして適用し、光学浸透性、均一性、FTIRに基づく安全性解析を組み合わせたことにあります。

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プロトコル

1. 合成皮膚サンプルの調製

コラーゲンベースの合成皮膚モデル(VITRO-Skin)シートが、バイオセーフティキャビネット内で無菌条件下で5.0cm×2.5cmの長方形のスウォッチにカットされました。各スワッチは滅菌されたペトリ皿に入れられ、使用まで4°Cで保存されました。接種前に、サンプルは室温に平衡され、製造元の指示に従って湿度チャンバーで水分補給され、人間の皮膚の水分レベルを模倣しました。

2. 微生物培養の調製

アメリカタイプ培養コレクション(ATCC)の参照株には 、ブドウ球菌 (ATCC 25923)、大 腸菌 (ATCC 25922)、 エンテロバクター・エアロジネス (ATCC 13048)、 プセウドモナス・アエルギノーサ (ATCC 27853)、 アシネトバクター・バウマンニイ (ATCC 19606)、 クレブシエラ・ニューモニアエ (ATCC 13883)、 カンジダ・アルビカンス が含まれます(ATCC 10231)が使用されました。単一コロニーは無菌条件下で5mLのトリプティック大豆ブロス(TSB)に接種されました。細菌培養は35°Cで24時間、真菌培養は22°Cで5日間培養されました。培養後、抗菌アッセイのために滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて濁度を0.5マクファーランド標準(約1.5 × 10⁸ CFU/mL)に調整しました。

3. 合成皮膚モデルの接種

各水分補給された合成皮膚切片には100μLの微生物懸濁液が接種され、滅菌使い捨てスプレッダーで均等に広げられました。接種面は無菌チャンバーで15分間、実験室環境下(22-24°C、60%-70%相對湿度)で自然乾燥させられました。サンプルは3つのグループに分けられました:未処理対照群(グループA)、光源(青色光LED、405nm)、照射(グループB)、UV-C LED(265nm)照射(グループC)。 図1 は合成皮膚モデルを用いた光源の抗菌有効性を評価する実験の概略図を示しています。

4. 光源構成と照射

405nmの青色光LEDデバイスはアルミニウム製ヒートシンクに取り付けられ、熱の蓄積を防ぎ、合成皮膚スウォッチの熱安全照射を確保しました(図2)。照射度は、センサーの厚さを考慮してプローブの高さを調整した校正済みの光パワーメーターを用いて、正確な処理面で測定しました。LEDの射速距離を調整して、作動放射度は30 mW/cm²に標準化されました。

処理フィールド全体の照明均一性は、均等に配置された16点での放射度を測定することで検証され、平均30.14±0.78 mW/cm²となりました(図3)。殺菌効果の基準比較として、265nmのLED光源を用いて20cmの距離で3mW/cm²を2分間照射し、UV-C処理を実施しました。

フルエンスは 露光時間×放射度 として計算され、青色光は27 J/cm²(900秒×30 mW/cm²)、UV-Cは3.6 J/cm²に対応しました。

抗菌アッセイでは、微生物懸濁液を接種した水分合成皮膚スウォッチを無菌ペトリ皿(蓋を外した状態で)に入れ、青色光LEDの真下に置きました。照射グループ(グループB)に割り当てられたサンプルは、目標のフルエンスに達するまで連続的に曝露されていました(15分)。15分の曝露期間(27 J/cm²)は、種間で一貫した抗菌効果を示し、臨床や現場での応用に適した曝露期間を示す予備的な時間殺菌実験に基づいて選定されました。各スワッチの温度は、非接触型赤外線温度計で5分ごとに監視され、照明中に顕著な加熱が発生していないことが確認されました。温度監視により、ブルーライト照射中に表面温度(>2°C)の測定可能な上昇は見られず、観察された抗菌効果が非熱的であることが確認されました。

5. 青色光LEDおよびUV-Cの創傷病原体に対する抗菌効果

治療後、各合成皮膚スウォッチは9.0 mL PBS(pH 7.4)を含む無菌15 mLチューブに移されました。チューブは表面に付着する微生物を1分間優しく渦巻きさせました。連続の10倍希釈を準備し、細菌用はトリプティック大豆寒天(TSA)および菌類用はサブローデキストロース寒天(SDA)に100μLのアリコートをプレートしました。プレートは培養され(細菌は35°Cで24時間、真菌は22°Cで5日間)、コロニー形成単位(CFU)が計測されました。微生物還元は以下の式を用いて定量化されました。

対数還元 = log10(A) - log10(B)

パーセント削減 = ((A - B)/A) × 100

ここでA = CFUは制御からカウントされます。B = 処理済みサンプルからのCFUカウント。

陰性対照は培地のみのプレートとPBSで不稔性を検証し、未処理の接種スウォッチを用いて治療効果を比較しました。陽性コントロールプレートは、培養生存可能性を確認するために接種されたATCC微生物懸濁液で構成されていました。すべての実験工程は無菌条件下で実施されました。

6. ブルーライト照射の時間依存的な抗菌効果

フルエンス依存効果を評価するために、ブルーライトの曝露時間は2分、5分、10分、15分、20分、30分に設定されました。抗菌活性は前述のCFU列挙によって評価され、用量依存関係の解析が可能となった。

7. 院内環境を模倣したエアロゾル化チャンバーでのブルーライトLEDの有効性

カスタマイズされたアクリルエアロゾルチャンバーを、管理された環境条件下で使用し、院内空気中曝露をシミュレートしました(図4)。ネブライザーを用いてエアロゾル化微生物懸濁液(~1.5 x 106 CFU/mL)を導入し、合成皮膚スウォッチを30分間露出させました。青色光は露光中ずっとスウォッチに向けられました(10 μW/cm²、20 cmの距離)。対照実験では同じ露出条件が適用されましたが、BL-LEDデバイスは引き続きオフのままでした。エアロゾルチャンバー内の微生物細胞密度は、曝露前に寒天プレートをチャンバー内に置くフォールアウト活性測定を用いて監視しました。合成皮膚スウォッチ(2 cm x 2 cm)に付着した生存微生物細胞は、上記の標準プレートカウント解析を用いて定量化しました。この低い放射度(10 μW/cm²)は、連続的な高強度照射が不可能な医療現場での実際の環境照明条件を模倣するために選ばれました。

8. 光透過および埋め込みコロニー試験

  1. 合成皮膚基質を通じた光透過
    合成皮膚を通る青色光の浸透を定量化するため、照射面に位置する校正済みの光パワーメーターを用いて照射度を測定しました。BL強度(405 nm、30 mW/cm²)は、LEDと検出器の間に水平に配置された水和合成皮膚スウォッチの有無にかかわらず記録されました。透過率(%)は、皮膚を含む透過放射度と入射照射(皮膚なし)の比率として計算されました。
    水域条件下での透過率はUV-VIZ分光光度計を用いて評価されました。水分補給された合成皮膚のストリップが、脱イオン水を詰めた標準的なポリスチレンキュベットに垂直に挿入されました。水で満たされたキュベットだけが空白の役割を果たしました。405 nmでの吸収が記録され、透過率は%T = 10(-A) × 100で計算されました。
  2. 埋め込みコロニーアッセイを用いた機能検証
    表面および埋め込みコロニー微生物還元アッセイは、伝播の機能的相関として実施され、スウォッチは片面に接種され、反対側(下側)から照射されて皮膚表面下に存在する微生物を模倣しました。CFUは上記の抗菌有効性のセクションで定量化されました。

9. 青色光およびUV-C曝露後の合成皮膚劣化のためのFT-IR分光法

光曝露によるコラーゲン系合成皮膚マトリックスの化学的・構造的変化を評価するために、フーリエ変換赤外線(FT-IR)分光法が実施されました。合成皮膚スウォッチ(2cm×2cm)は、製造者の指示に従って水分補給され、微生物還元アッセイで使用されたスウォッチと同一でした。水和されたサンプルは、405 nmの青色光(30 mW/cm²)または265 nmのUV-C(3 mW/cm²)に15分間(標準露光、27 J/cm²)、または60分(最悪の応力条件下)にさらされました。照射後、サンプルは表面水分を優しく除去し、すぐにFT-IRで分析されました。

10. ATR-FTIR測定

スペクトルは互換性のある解析ソフトウェアを搭載した赤外分光光度計を用いて取得されました。すべての試料は減衰全反射率(ATR)iD7モジュールを用いて分析されました。照射に起因するスペクトル変化を分離するために、(1)未処理対照と照射試料間で直接スペクトル比較が行われました。(2) 未処理の対照スウォッチを背景参照として使用し、照射サンプルをスキャンする前にベースライン減算比較を行い、新たに見られたピークや変化したピークのみを可視化しました。

この二重方式により、トポグラフィカルノイズを低減し、アミド領域や指紋領域の微妙な変化の検出が向上します。水和度、スウォッチの厚さ、配向はすべてのサンプルで標準化され、スペクトルの変動を低減しました。各露光条件(対照、BL-15分、BL-60分、UV-15分、UV-60分)は三重にスキャンされました。

11. 統計解析

特に記載がない限り、すべての実験は独立した生物学的三重化を用いて実施されました。データは図の凡例に示されているように、平均±標準偏差(SD)または95%信頼区間(CI)付き平均として示されています。データ分布の正規性はシャピロ・ウィルク検定を用いて評価されました。2つのグループ間のペアワイズ比較(例:ブルーライト対UV-C、表面と埋め込みコロニー)は、ペアリングされていない両側Student氏t検定を用いて実施されました。複数の条件や時点が関与する比較には、一方移動分散解析(ANOVA)と適切な事後検定が適用されました。各比較に用いられる具体的な統計検定は、対応する図の凡例に示されています。p値<0.05は統計的に有意とされました。

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結果

創傷病原体に対するブルーライトLEDおよびUV-Cの抗菌効果
青色光LEDデバイス(405nm)は、30 mW/cm²の強度で15分間動作し、合成皮膚モデルの試験されたすべての創傷病原体に対して有意な抗菌効果を示しました(図5)。検査対象の中で、 Klebsiella pneumoniae は青色光に対する感受性が最も高く、生存細胞数の平均ログ減少が3.4でした。逆に、 黄色ブドウ球菌 は反応が最も低く、比較的低いものの、依然として有意な(>1 log10 CFU減少)微生物減少を示しました。比較すると、UV-C照射(265 nm、3 mW/cm²、2分の曝露時間)は陽性対照群として機能し、すべての試験生物でより高い微生物ログ減少をもたらし、その確立された殺菌効果と一致しました。

青色光およびUV-C照射の抗菌スペクトルは、医学的に重要な代表種を用いてさらに示...

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ディスカッション

本研究は、コラーゲンベースの合成皮膚モデルで臨床的に関連する創傷病原体パネルに対して、405nmブルーライトLED(BL-LED)デバイスの重要な抗菌潜在力を示しました。BL-LED曝光量27 J/cm²での曝光は、微生物負荷を最大3.5ログ減少させました(図6)。これは、青色光(405470 nm)を用いた同様の流体力で病原体不活化を用いた複数の初期研究6、7、17、18、19で報告された抗菌性能を上回るものでした。Daiらによるレビュー8では、特に光感作剤を使用しなかった場合に抗菌効果の効果が控えめな結果しか報告されていない研究がいくつかある

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開示事項

著者たちには利益相反はありません。

謝辞

この研究はカナダのセンテニアルカレッジにある「応用研究、イノベーション、起業サービス(ARIES)」から資金提供を受けました(W24-21)。微生物用品とBSL-2施設は、カナダのセンテニアルカレッジ「応用生物・環境科学(ABES)」によって提供されました。著者らは、FT-IR分光法に関するアンドリュー・ベアー氏とジリアン・ゴーリング氏の指導、そして培地準備と滅菌の協力に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アシネトバクター・バウマニー <も>ATCC グローバルバイオリソースセンターATCC 19606
ブルーライト - 光を放出するダイオード ヴィオルマ該当なしBL-LEDはプロトタイプであるためカタログ番号は持たない。
<エム>カンジダ・アルビカンズ <も>ATCC グローバルバイオリソースセンターATCC 10231
エンテロバクター・エアロゲネATCC グローバルバイオリソースセンターATCC 13048
<エム>大腸菌ATCC グローバルバイオリソースセンターATCC 25922
フーリエ変換赤外線 (FT-IR)分光光度計ニコレ iS5サーモ・サイエンティフィックIQLAADGAAGFAHDMAZA分析にはOMNICソフトウェアが使用されます
FT-IR ニコレ iS5 iD1 ダイレクトビーム送信モジュール(ベースアダプター)サーモ・サイエンティフィックIQLAADGAAGFAJAMAYX
FT-IR ニコレ iS5 iD7 ダイヤモンド減衰内部屈折モジュールサーモ・サイエンティフィックIQLAADGAAGFAJAMBFN
インキュベーター パーシバル・サイエンティフィック 9330.01.06L
赤外線サーロモメーターサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック  06-664-254
<>クレブシエラ肺炎 <も>ATCC グローバルバイオリソースセンターATCC 13883
リン酸塩緩衝生理食塩水サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック  AM9624PBSカタログ番号(サーモフィッシャー・サイエンティフィック)およびnbsp;
<エム>緑膿菌ATCC グローバルバイオリソースセンターATCC 27853
サブローデキストロースアガーBD ディフコ DF0109-17-1SABカタログ番号(BD Difco)
黄色ブドウ球菌 <も>ATCC グローバルバイオリソースセンターATCC 25923
トリプティック大豆寒天BDディフコDF0369-17-6TSAカタログ番号(BD Difco)
トリプティック大豆ブロスBD ディフコ DF0370-17-3TSBカタログ番号(BD Difco)
UV-LEDヴィオルマ該当なしUV-LEDはプロトタイプであるためカタログ番号は持たず、
UV-VIZ分光計(Genesys 10 UVスキャン)サーモ・サイエンティフィック 335907P
ビトロスキンメデリンクSKU24000ビトロスキン

参考文献

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