方法論記事

クローン作成のための核ドナーとして、クローンのためにクローンを行うクライオ保存馬の精液から体細胞を分離するための簡易微小吸引技術

DOI：

10.3791/69404

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2025年12月19日

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1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

責任著者： José Ernesto Hernández Pichardo <ehernan@correo.xoc.uam.mx>

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、凍結保存された馬の精液から生存可能な体細胞(SC)を分離するための簡単なマイクロ吸引技術を提示します。従来の手法とは異なり、この技術は長時間 のin vitro 培養を避け、精子汚染を克服するため、体細胞クローニングへの即時利用を可能にします。

要約

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精液は複雑な液体であり、精子のほかに免疫細胞、未成熟の男性生殖細胞、上皮細胞、線維芽細胞など他の細胞群も含んでいます。これらの細胞は二倍体状態を共有しており、体細胞核移植(SCNT)クローニングの核ドナーとして適しています。これらの細胞を用いて、生存可能な胚や子孫の生成が実証されています。精液から分離する効果的な方法には遠心分離法や浸透圧勾配法があります。しかし、これらの単離細胞から一次培養を確立するには、長期の in vitro 培養期間が必要です。さらに、取得されたサンプルには大量の精子が含まれており、これは in vitro 培養の確立と維持を妨げています。これまでのところ、一次培養は新鮮な精液サンプルからのみ成功裏に確立されており、クリオ保存精液を用いた試みは一貫して失敗しています。この制限は、クリオ保存精液サンプルからクローンを生成する可能性を大きく制限しています。本研究は、凍結保存された馬の精液から体細胞を分離するための単純なマイクロ吸引を用いた方法を提案します。このアプローチにより、SCNTクローニング手順で即座に使用できる十分な細胞を迅速に回収できます。

概要

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体細胞核移植クローン技術は、動物技術的および科学的関心を持つ個体の救済と増殖において非常に貴重なツールです。皮膚、筋肉、肉芽球、リンパ球、尿細胞1,2,3,4など、多数の細胞株が核ドナーとして利用されてきました。興味深いことに、精液はクローン作成の核ドナーとして使う体細胞(SC)を集める新しい代替手段として登場しています。この発見は、精液のみが保存されている個人の救済に特に重要です。しかし、凍結精液から分離されたSCからの一次培養の確立は成功せず、現在に至るまでこの産物からクローン動物を得る上での主な障害となっています7,8,9。これらの細胞はおそらく腺上皮細胞や細管の内膜、精液分泌物、そして重要なのは尿による精液汚染から発生しており、後者は高増殖率かつ未分化電位を持つ体細胞のよく知られた供給源です

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プロトコル

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液体窒素で19年以上保存されたクライオ保存精液サンプルは、メキシコの公式基準NOM-027-ZOO-1995に準拠し、メキシコの関連獣医当局により認可された商業販売業者から入手されました。この標準は家畜の精液の動物衛生プロセスを規定しています。使用済み・分析に不適切であろうと、すべての精液サンプルは不活化され、メキシコにおける生物感染性廃棄物管理に関するNOM-087-ECOL-SSA1-2002を含む機関のバイオセーフティプロトコルおよび適用規則に従って廃棄されました。残留フッ化水素酸(HF)は、フームフードの下でプラスチック容器にゆっくり移し、発泡が止まるまでCaCO3またはCa(OH)2を少量添加することで安全に中和され、不溶性CaF2が形成されました。中和された懸濁液のpHは、無機化学廃棄物として管理される前に6から8の間で確認されていました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 体細胞分離のためのマイクロピペット針の製造

  1. 一部のホウケイ酸ガラス毛細血管(外径1.0mm×内径0.78mm×100mm)。
  2. マイクロピペットプラーを使って細かい毛細血管を作り出します。先端の直径を変えるために切断点を調整してください。
  3. 毛細管を....

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結果

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表1は 、マイクロスアプリーション技術がクライオ保存された馬の精液から体細胞を効率的に回収し、3頭の種牡馬で捕獲率が317.7±9.60から424.7 ± 33.65細胞/時間に及びます。スタリオン#03は最も高い収率を持ち、長期保存サンプルでもこの方法の有効性を示しました。データは、この技術が一貫して効果的に体細胞を精液から分離し、平均捕獲率と標準偏差が効率と一貫性の定量的指標を提供し、体細胞核移植への応用を支持していることを示しています。

各体細胞の分離には大きな吸引力は必要ありませんでしたが、一部の細胞は過程でマイクロピペットの先端に付着する傾向がありました。操作中に観察された特徴は、分離細胞の剛性と低い変形性でした。

ホウケイ酸ナトリウムガラスの使用により、細胞吸引時のすべての動きを監視でき.......

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ディスカッション

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細胞や配偶子のマイクロ操作により、複雑な補助生殖技術が簡素化されることが可能になりました。例としては、Hand Made Cloning21による体細胞クローニング、アシストハッチング22、細胞質内精子注入(ICSI)23、受精卵24における核前顕微注射などがあります。

精液から体細胞を分離する効果的な方法の開発は、現代の動物繁殖技術にとって非常に貴重なツールです。しかし、多くの生物学的側面は未解決のままであり、さまざまな技術的要因が体細胞クローニングなどのバイオテクノロジーにおけるこれらの細胞の利用を引き続き制限しています。遠心分離5や浸透圧勾配に基づく従来の報告された分離法とは異なり、

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開示事項

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著者たちは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

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著者らは、メトロポリタナ自治大学(UAM-X)農業・畜産部門繁殖管理研究所の技術的および物流支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2ベータメルカプトエタノールシグマM7522体細胞培養
DPBS1台GIBCO参照番号-21600010体細胞操作
絶対エタノールハイセルエル・クリソル 50181-1L73ピペットの製造用
抗生物質-抗マイコティック 100倍インビトロSA。MéXICO体細胞培養
ホウケイ酸塩毛細血管(外径1.0mmおよび時間;内径0.78mmおよび時間:長さ100mm)ハーバード装置、アメリカEC1-30-0035ピペットの製造用
BSAシグマA3311体細胞培養
DMEM/F12 ミディアムGIBCOリファレンス-12500-062体細胞培養
馬のクライオ保存精液サンプルクリオ保存された精液サンプルは商業流通業者から入手され、液体窒素で19年以上保存されていました。すべての凍結馬精液サンプルは、メキシコの公式基準NOM-027-ZOO-1995「家畜精液の動物衛生プロセス」に従い、メキシコの関連獣医当局が認可した商業販売業者から取得されました。
接眼レンズレティクルピペット製造用の工具必要な装備
胎児用牛血清GIBCO参照番号26140-079体細胞培養
ヒドロフル酸シグマ・オルドリッチ339261ピペットの製造用
逆立光学顕微鏡エクリプス、TE 200ニコン体細胞の微小操作
研究所 ドライオーブンピペット製造用の工具必要な装備
マイクロフォージピペット製造用の工具必要な装備
逆立顕微鏡用マイクロマニピュレーターセット細胞のマイクロマニピュレーション必要な装備
マイクロピペットプラーP-97、サター計器ピペット製造用の工具以下の設定をご利用ください。ヒート:720;プル:30;速度:50;時間:220分;圧力
ミネラルオイルシグマM8410体細胞操作
ナンクロン 細胞培養皿、直径および時間;H 35 mm & 時間;10mmヌンクロンナンク153066
PVAシグマP8136体細胞培養
PVPシグマP5288体細胞培養
トリパンブルー溶液 0.4%GIBCO参考文献 - 15250061細胞染料

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi,....

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