クローン作成のための核ドナーとして、クローンのためにクローンを行うクライオ保存馬の精液から体細胞を分離するための簡易微小吸引技術

サマリー

このプロトコルは、凍結保存された馬の精液から生存可能な体細胞(SC)を分離するための簡単なマイクロ吸引技術を提示します。従来の手法とは異なり、この技術は長時間 のin vitro 培養を避け、精子汚染を克服するため、体細胞クローニングへの即時利用を可能にします。

要約

精液は複雑な液体であり、精子のほかに免疫細胞、未成熟の男性生殖細胞、上皮細胞、線維芽細胞など他の細胞群も含んでいます。これらの細胞は二倍体状態を共有しており、体細胞核移植(SCNT)クローニングの核ドナーとして適しています。これらの細胞を用いて、生存可能な胚や子孫の生成が実証されています。精液から分離する効果的な方法には遠心分離法や浸透圧勾配法があります。しかし、これらの単離細胞から一次培養を確立するには、長期の in vitro 培養期間が必要です。さらに、取得されたサンプルには大量の精子が含まれており、これは in vitro 培養の確立と維持を妨げています。これまでのところ、一次培養は新鮮な精液サンプルからのみ成功裏に確立されており、クリオ保存精液を用いた試みは一貫して失敗しています。この制限は、クリオ保存精液サンプルからクローンを生成する可能性を大きく制限しています。本研究は、凍結保存された馬の精液から体細胞を分離するための単純なマイクロ吸引を用いた方法を提案します。このアプローチにより、SCNTクローニング手順で即座に使用できる十分な細胞を迅速に回収できます。

概要

体細胞核移植クローン技術は、動物技術的および科学的関心を持つ個体の救済と増殖において非常に貴重なツールです。皮膚、筋肉、肉芽球、リンパ球、^尿細胞1,2,3,4など、多数の細胞株が核ドナーとして利用されてきました。興味深いことに、精液はクローン作成の核ドナーとして使う体細胞(SC)を集める新しい代替手段として登場^{しています。}この発見は、精液のみが保存されている個人の救済に特に重要です。しかし、凍結精液から分離されたSCからの一次培養の確立は成功せず、現在に至るまで^この産物からクローン動物を得る上での主な障害となっています^7,8,9。これらの細胞はおそらく腺上皮細胞や細管の内膜、精液分泌物、そして重要なのは尿による精液汚染から発生しており、後者は高増殖率かつ未分化電位を持つ体細胞のよく知られた供給源です^。

SCを精液から分離するためには、遠心分離⁵、浸透圧勾配^7、8、¹⁰、フローサイトメ^トリー11など、さまざまな方法が実装されています。しかし、これらの方法で単離された体細胞は、依然として付着、成長、増殖のために最適化された条件^{を必要とします8}。これらの細胞の特有の要件により、一次細胞培養の確立には長期の潜伏期間が必要であり、in vitro培養はより複雑^{になります。}さらに、サンプル中に存在する高濃度の精子は、これらの培養の開始と維持の両方に干渉^{します5。}

これまでに述べた手法とは異なり、この微小吸引技術はいくつかの明確な利点を提供します。サイズと形態に基づいて単核細胞(^SC)を選択可能にし、生存可能な細胞と非生存細胞の両方から核の回収を可能にします。この戦略は、凍結保護剤を使わない凍結組織¹³および凍結乾燥生殖細胞14,15,16で成功裏に実証されています。重要なのは、SCsが精液解凍直後に使用できるため、動物クローニングに用いられる一次体細胞の長期in vitro培養に伴う倍性エラーのリスクを低減できることである^17,18。具体的には、この技術はクライオ保存された馬の精液に焦点を当てており、SCNT¹²のために即座に使用できる十分な数のスカイトを採取することを可能にします。

マイクロピペットの製造やマイクロ吸引技術の開発は、近年大きく進展しています。これらのツールの使用により、配偶子、胚、その細胞構造の精密な操作が可能となり、生殖バイオテクノロジー(https://www.jove.com)分野に新たな可能性が生まれます。マイクロマニピュレーション技術は細胞の機械的特性の評価を可能にし、その生理的状態に関する貴重な洞察を提供します(^19,20)が、この分野はまだ比較的未開拓です。

これまでのところ、いかなるマイクロマニピュレーション手法の変種を用いて精液からSCを分離する効果的な技術を詳細に示した研究はありません。従来の分離法の限界を踏まえ、本研究は、低温保存された馬の精液からSCを分離するための実用的なマイクロ吸引ベースのプロトコルを提案し、採取後の体細胞クローニング手術での即時利用を可能にします。

プロトコル

液体窒素で19年以上保存されたクライオ保存精液サンプルは、メキシコの公式基準NOM-027-ZOO-1995に準拠し、メキシコの関連獣医当局により認可された商業販売業者から入手されました。この標準は家畜の精液の動物衛生プロセスを規定しています。使用済み・分析に不適切であろうと、すべての精液サンプルは不活化され、メキシコにおける生物感染性廃棄物管理に関するNOM-087-ECOL-SSA1-2002を含む機関のバイオセーフティプロトコルおよび適用規則に従って廃棄されました。残留フッ化水素酸(HF)は、フームフードの下でプラスチック容器にゆっくり移し、発泡が止まるまで_CaCO3またはCa(OH)₂を少量添加することで安全に中和され、不溶性CaF₂が形成されました。中和された懸濁液のpHは、無機化学廃棄物として管理される前に6から8の間で確認されていました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 体細胞分離のためのマイクロピペット針の製造

1. 一部のホウケイ酸ガラス毛細血管(外径1.0mm×内径0.78mm×100mm)。
2. マイクロピペットプラーを使って細かい毛細血管を作り出します。先端の直径を変えるために切断点を調整してください。
3. 毛細管をプラーに挿入し、しっかりとロックしてください。
4. 引き抜いた後は慎重にマイクロピペットを取り外し、マイクロフォージに水平に置いてください。
5. ヒーターとマイクロピペットを顕微鏡の視野内に整列させます。
6. 接眼レンズの照準点(図1A、B)を使って切断点を特定します。
7. マイクロピペットの先端をガラスビーズ(ヒーターフィラメントの上)に接触させます。
8. 先端がビーズに溶けるまで徐々に火を強めます。
   1. ヒーターを止めて。
   2. 先端がビーズにくっつくのを待って分離します。
      注意:マイクロピペットを曲げる必要はありません。直線でも使えます。しかし、演算子が好む場合は角度を形成することも可能です(図1C)。
9. 先端を滑らかにしないでください。この工程は手順には不要です。
10. ピペットの先端を、各先端を連続して~10秒ずつ浸して洗浄します:
    1. 20%フッ化水素酸(HF)。
       注意:フッ化水素酸は非常に有毒で腐食性があります。サプライヤーが示した個人用防護具を使用してください。目や顔の保護具、手袋、実験用コートの使用を強調し、常に煙のフードで作業してください。
    2. 滅菌の二重蒸留水だ。
    3. 絶対エタノールです。
       注意:ピペットチップ洗浄を容易にするために、上記の溶液は15mLの無菌コーニングチューブで準備してください。
11. マイクロピペットを50°Cのオーブンで乾燥させます。
12. マイクロピペットは滅菌容器に保管してください。

2. 微小吸引装置

1. マイクロスピュレーションシステムが正常に動作しているか、マイクロスティックがコントロールパネルの中央にあるか確認してください。
2. 油を使うシステムでは、システム内に気泡がないか確認してください。気泡は動きの精度に影響を与える可能性があります。
3. 操作者の利き手側にあるホールディングマニピュレーターに体細胞吸引マイクロピペットを挿入します。
   注意:体細胞採取中にチップが詰まった場合は、マイクロピペットを新しいものに交換してください。

3. クライオ保存された馬精液の解凍と希釈

1. 液体窒素からストローを取り出し、空気に10秒間さらし、37°Cで30秒解凍します。
2. 最初の精液希釈:解凍した精液(250 μL)からサンプルを採取し、1.0 mLのDMEM/F12培地に10%胎児用牛血清、0.1 mg/mLの牛血清アルブミン、12.5 μM β-メルカプトエタノール、1%抗生物質・抗菌剤を加えて希釈します。
   1. 混合物を37°Cで30分間孵化します。
3. 2回目の精液希釈:最初の希釈から25μLを取り、1xDPBSを975μLに薄め、0.1 mg/mLのポリ(ビニルアルコール)(PVA)またはポリビニルピロリドン(PVP)を補足して1.5 mLのマイクロ遠心分離管に浸し、優しく混ぜます。
   1. この混合物は細胞採取過程で37°Cに保たれます。

4. SCsの収集用食器の準備

1. 直径35mmの培養皿から2つの蓋を使ってサカロイを採取します。
2. 最初の蓋を以下のように準備します(蓋#1、 図2A)。
   1. 2回目の精液希釈液100μLを取り、蓋の中央に堆積させます( 図2A参照)。
   2. 1滴目の上に1倍のDPBSを1滴目に、0.1 mg/mLのPVAまたはPVPを補足した2滴目(10 μL)を作ります( 図2A参照)。
   3. 蒸発を防ぎ、SCの吸引時の温度安定性を維持するために、両方のマイクロドロップをパラフィンオイルで完全に覆います。
3. 細胞の破片とそれに伴う精子を除去するために、2つ目の蓋を準備します(蓋#2、 図2B)。
   1. まぶた中央に30〜50μLの1x DPBSを3滴、0.1 mg/mLのPVAまたはPVPを補足します。ミネラルオイルで覆わないでください。
      注意:この培養皿は、空気曝露によるDPBS溶液の物理化学的性質の変化を防ぐために、すべての体細胞が選定された後にのみ準備してください。
4. すべての微小吸引工程は、室温の逆立顕微鏡の下で実施します。急激な温度変化は避けてください。

5. 冷凍保存された馬の精液からSCを分離するための微小吸引法

1. 最初の蓋(蓋#1、 図2A)を顕微鏡ステージに置き、SCの採取準備を整えます。
2. 適切な直径のマイクロピペットを選び、SCを収集し、機械式吸引システムに接続します。
3. マイクロピペットを慎重にマイクロドロップに挿入し、皿の蓋の底に合わせます。ピペットが培養培地を吸引したら、個別のスカイクの捕獲を開始します。
4. 皿の底部には様々な細胞形態が見えるはずです(図3)。
5. マイクロピペットの先端を各SCの隣に位置させ、負圧で吸引します。全ての球体や細長い細胞を吸引してください。吸引量はSCの捕獲によって異なります。
6. 10個の細胞を捕捉した後、上にあるマイクロドロップ(10μL)に沈着させます(図2A)。このステップを繰り返し、クローン実験に必要な数のSCが得られるまで続けます。
7. 採取過程中は、このマイクロドロップ内に捕獲したすべての体細胞を保持してください。
8. クローニングに必要な数のSCが得られたら、マイクロドロップを用いた簡単な洗浄手順を行い、付随する精子、細胞残渣、微生物汚染物質を除去します。
9. 2つ目の皿の蓋を取り、SCs(蓋#2、 図2B)を3段階で順に洗います。
   1. 体細胞をマイクロピペットで捕捉し、慎重に最初の滴の表面に沈着させます。3〜5分間静止させます(図2B;ドロップ#1)。
   2. ステップ5.9.1を繰り返し、2番目のドロップに投げ入れます(図2B;ドロップ#2)です。
   3. ステップ5.9.1を繰り返し、体細胞を3滴目に沈着させます(図2B;ドロップ#3)。
10. 最終段階として、分離した体細胞を最終マイクロドロップに沈着させ、その後体細胞の核移植手順で使用するために準備します(図4D)。
    注意:各再捕獲時には、精子、ゴミ、微生物汚染物質を最小限に抑えるため、可能な限り最小の中容量のSCを吸引してください。

結果

表1は 、マイクロスアプリーション技術がクライオ保存された馬の精液から体細胞を効率的に回収し、3頭の種牡馬で捕獲率が317.7±9.60から424.7 ± 33.65細胞/時間に及びます。スタリオン#03は最も高い収率を持ち、長期保存サンプルでもこの方法の有効性を示しました。データは、この技術が一貫して効果的に体細胞を精液から分離し、平均捕獲率と標準偏差が効率と一貫性の定量的指標を提供し、体細胞核移植への応用を支持していることを示しています。

各体細胞の分離には大きな吸引力は必要ありませんでしたが、一部の細胞は過程でマイクロピペットの先端に付着する傾向がありました。操作中に観察された特徴は、分離細胞の剛性と低い変形性でした。

ホウケイ酸ナトリウムガラスの使用により、細胞吸引時のすべての動きを監視でき...

ディスカッション

細胞や配偶子のマイクロ操作により、複雑な補助生殖技術が簡素化されることが可能になりました。例としては、Hand Made Cloning²¹による体細胞クローニング、アシストハッチ^ング22、細胞質内精子注入(ICSI)²³、受精卵²⁴における核前顕微注射などがあります。

精液から体細胞を分離する効果的な方法の開発は、現代の動物繁殖技術にとって非常に貴重なツールです。しかし、多くの生物学的側面は未解決のままであり、さまざまな技術的要因が体細胞クローニングなどのバイオテクノロジーにおけるこれらの細胞の利用を引き続き制限しています。遠心分離^5や浸透圧勾配に基づく従来の報告された分離法とは異なり^、

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2ベータメルカプトエタノール	シグマ	M7522	体細胞培養
DPBS1台	GIBCO	参照番号-21600010	体細胞操作
絶対エタノール	ハイセル	エル・クリソル 50181-1L73	ピペットの製造用
抗生物質-抗マイコティック 100倍	インビトロSA。MéXICO		体細胞培養
ホウケイ酸塩毛細血管(外径1.0mmおよび時間;内径0.78mmおよび時間:長さ100mm)	ハーバード装置、アメリカ	EC1-30-0035	ピペットの製造用
BSA	シグマ	A3311	体細胞培養
DMEM/F12 ミディアム	GIBCO	リファレンス-12500-062	体細胞培養
馬のクライオ保存精液サンプル			クリオ保存された精液サンプルは商業流通業者から入手され、液体窒素で19年以上保存されていました。すべての凍結馬精液サンプルは、メキシコの公式基準NOM-027-ZOO-1995「家畜精液の動物衛生プロセス」に従い、メキシコの関連獣医当局が認可した商業販売業者から取得されました。
接眼レンズレティクル		ピペット製造用の工具	必要な装備
胎児用牛血清	GIBCO	参照番号26140-079	体細胞培養
ヒドロフル酸	シグマ・オルドリッチ	339261	ピペットの製造用
逆立光学顕微鏡	エクリプス、TE 200	ニコン	体細胞の微小操作
研究所 ドライオーブン		ピペット製造用の工具	必要な装備
マイクロフォージ		ピペット製造用の工具	必要な装備
逆立顕微鏡用マイクロマニピュレーターセット		細胞のマイクロマニピュレーション	必要な装備
マイクロピペットプラー	P-97、サター計器	ピペット製造用の工具	以下の設定をご利用ください。ヒート:720;プル:30;速度:50;時間:220分;圧力
ミネラルオイル	シグマ	M8410	体細胞操作
ナンクロン 細胞培養皿、直径および時間;H 35 mm & 時間;10mm	ヌンクロン	ナンク153066
PVA	シグマ	P8136	体細胞培養
PVP	シグマ	P5288	体細胞培養
トリパンブルー溶液 0.4%	GIBCO	参考文献 - 15250061	細胞染料