ペルオキシソーム特異的プローブを用いた哺乳類細胞におけるペルオキシソーム染色

サマリー

ペルオキシSPYプローブは哺乳類細胞内のペルオキシソーム検出に使用されます。ここでは、プローブを使って生細胞および固定細胞のペルオキシソームを染色する方法を示します。

要約

ペルオキシソームは人間の健康に不可欠な重要な小器官であり、その機能障害は遺伝性疾患のスペクトルを引き起こします。ペルオキシソームの可視化は、ペルオキシソームの機能障害を特定する鍵となります。しかし、ペルオキシソーム特異的プローブの不足により進展は制限されています。PeroxiSPY(自然なペルオキシソーム代謝物を模倣するペルオキシソーム特異的プローブ)を開発したことで、生きた哺乳類細胞におけるペルオキシソーム動態のリアルタイム検出、追跡、定量化が可能となりました。さらに、この技術をペルオキシソーム障害を持つ患者細胞への応用により、病理的な表現型が明らかになります。ここでは、生きた哺乳類細胞におけるペルオキシソーム検出および固定細胞における染色後のペルオキシソーム検出に関する詳細なプロトコルを提供します。私たちは、細胞の調製、手順のタイミング、再現性、トラブルシューティングに焦点を当て、ペルオキシソーム特異的プローブを用いて生細胞内のペルオキシソーム染色方法を示します。これらのプローブは、ペルオキシソームの迅速かつ特異的かつ無毒な生細胞検出を可能にし、ペルオキシソームの機能およびその機能障害を評価する独自の定量的手法を提供します。

概要

ペルオキシソームは最も豊富な真核細胞小器官であり、一部の細胞は千個を超えるペルオキシソーム^{もあります。}その機能は生物の発生と代謝適応に極めて重要^{であり、これは}主に治療不可能な神経変性および神経代謝疾患を含む幼児におけるさまざまなヒトペルオキシソーム障害によって証明されています。^3,4。私たちの知る限り、これまで生細胞や組織にペルオキシソームを標識する選択的手法が不足していました。これらのツールは研究や診断用途において非常に貴重であり、ペルオキシソーム形成^{および機能の}複数の側面を直接かつ定量的に測定することを可能にします。これらのプローブは、一方で細胞内のペルオキシソーム機能の定量的読み取りを提供するだけでなく、トランスレーショナル・アクセイやペルオキシソーム障害の診断にも活用できるほど多用途です^。ペルオキシSPY染色は、非侵襲的な生細胞ペルオキシソーム検出のための迅速で特異的かつ非細胞毒性の技術です。ここでは、哺乳類細胞株におけるペルオキシソームの染色方法をペルオキシソームプローブで説明します(プローブはゼブラフィッシュ胚でも特異的なペルオキシソーム染色を示しましたが、植物のアラビドプシス・タリアナ^細胞でのペルオキシソーム染色には適していません6)。染色は10分以内に完了します。プローブは数時間検出されるか、さらなる免疫染色のためにパラホルムアルデヒド固定プロトコルで固定されます。

プロトコル

1. 生細胞の染色

1. 生細胞画像診断のための細胞培養準備(所要時間:24時間)
   注:本研究はすべての実験において標準的な細胞培養プロトコルに従って行われました。細胞株は37°C、5%_CO2でDMEMまたはDMEM/F12で維持され、胎児用牛血清(FBS)10%、ペニシリン/ストレプトマイシン1%を補足しました。一部のイメージングシステムはメディアの組成に敏感です。顕微鏡が培地中のフェノールレッド信号を検出した場合は、フェノールレッドを含まない代替品を使用してください。さらに、顕微鏡に_CO2 チャンバーが装備されていない場合は、HEPES(pH 7.4)を含む培地に交換してください。
   1. 実験の前日に、細胞をガラス底のイメージングプレートに分割し、翌日に30〜70%のコンフルージョンを達成します。
      注:このプロトコルでは4ウェル35mmプレートが使用されました。
      1. (危機的)実験では、飢えやストレスを受けた細胞を分解に使わないでください。細胞株は定期的に(少なくとも2〜3日ごとに)新しい培地交換を行い、90%の合流率に達する前に分割してください。目標は健康な細胞株を持ち、均一な染色を保証することです。
         注意:一部の細胞、例えば幹細胞は、染色を妨げない適切なコーティング層(例:マトリゲル)によるガラスコーティングが必要です。
2. 画像検査準備(所要時間:1時間)
   注:小器官および小器官の動態イメージングには高い空間分解能が必要です。このプロトコルには、GaAsP光電子増倍管モジュール、_CO2 チャンバー、温度制御装置を備えた共焦点顕微鏡が使用されました。画像化はCFIのPlan Apo Lambda 60x oil NA 1.42対物レンズを用いた双方向ガルバノメーター走査モードで実施され、555プローブには561 nmレーザー(50 mW)が使用されました。650 nmプローブには640 nmレーザーまたは同等のものを使いましょう。ペルオキシソームはヒト細胞株で可視化されました。プローブとのインキュベーション時間は細胞株によって異なる場合があります。染色後の異なる時刻の細胞を可視化してタイミングを最適化することが推奨されます(図2A)。
   1. 共焦点システムを起動しろ。染色開始と顕微鏡への植入前に、_CO2 と温度(37°C)が20分間安定化していることを確認してください。
      注意:(重要)実験中、細胞が健康であることを目視検査で確認し、培地のpHと温度が維持されていることを確認することが重要です。これはパラメータの制御ユニットを使用し、フェノールレッドを使用している場合にメディアの色を目視で確認することで実現できます。そのためには温度と_CO2 のコントローラーを使うことができます。
   2. 共焦点顕微鏡ソフトをセットアップしてください。ソフトウェアを起動し、555プローブ染色用の561nmレーザーをオンにしてください。取得パラメータとレーザー出力を調整してください。このプロトコルは1%のレーザー出力、HV(利得)100、解像度1024 1024ピクセル(ズーム3倍)でセルをイメージングします。
3. ペルオキシソーム染色(持続時間:1〜5分)
   1. プローブのアリコートをピペットで、最終作業濃度1μM(例:培地0.5mL)をピペットし、プローブの0.5μLをピペットします。
   2. ステインする井戸を選び、マーカーペンで外側にラベルを付けます。
   3. 選んだウェルから、すべての(0.5 mL)培地をピペットで抽出し、ステップ1.3.1のプローブアリコートを含むマイクロ遠心分離機チューブに注入します。
      注意:均一な染色を確保するために、この工程では井戸内のすべての媒体を除去することが重要です。
   4. 培地とプローブを混ぜるためにピペットを3回上下に動かします。全体の混合物をピペットに吸引します。
      注:ピペッティングの代わりに渦巻きによる混合が使用可能です。
   5. 混合物を選んだウェルに滴り返し、ピペットがウェルの壁に接触していることを確認します。混合物を井戸に戻したら、10分タイマーをスタートさせます。
   6. 蓋を閉じ、対物レンズに浸漬油を1滴(このプロトコルでは60×油対物レンズを使用します)を加え、プレートを顕微鏡に置いてイメージングを行います。
      注意:均一な染色を確保するために、各細胞株ごとにプローブの濃度を最適化することが推奨されます。0.25、0.5、1、2 μMで5〜20分間のテストが推奨されます。濃度が低い場合は背景が低いと染色が起こることが多いです(図2A)。細胞株や顕微鏡検出器の感度によっては、染色細胞はプローブ追加から5分後から24時間以内に画像化可能です。例えば、幹細胞の画像診断では、プローブ追加後180分以上細胞の可視化がシグナルの変化なしに実施されることもあります。いつでも培地を交換してプローブを洗い流すことができます。これにより、HEK293T細胞の染色は約30分で徐々に失われていきます。
4. 生細胞中のペルオキシソームの共焦点イメージング(持続時間:10分〜3時間)
   1. プレートを顕微鏡に配置したら、染色されたウェル内の細胞に焦点を調整してイメージングを開始します。
   2. セルがピントが合ったら、標準的な共焦点顕微鏡のセットアップガイドラインを使ってゲイン(HVまたは検出器感度)とレーザー出力設定を調整します。
   3. セル群を見つけて位置づけ(ズームイン)します。セルにピントを合わせた後、必要な画質に取得パラメータを調整します。
      1. 画像取得のイメージングパラメータをNIS-Elementsソフトウェアで設定します:0.5-1%のレーザー出力、100 HV(利得)。画像が過飽和していないか確認してください(もしそうなら、強度とゲインを調整してください)。
      2. スキャンサイズを選択してください。撮影に適した1024枚の1024ピクセル画像を取得し、スキャン速度(1/2-1/4)、ライン平均(2)、ズーム(3)を取得します。
         注:ペルオキシソームは画像取得中に移動するため、アーティファクトが生じることがあります。推奨パラメータは、動きの痕跡を最小限に抑えつつ、定量化に十分な画像品質を確保するために最適化されています。タイムラプスを作成する際は、動画を始める前に間隔、持続時間、ループを指定してください。プローブは光安定です。
   4. すべての画像を取得・保存し、アクセス可能なラベルで保存してください(ここでは.nd2 NIS-ElementsのNikon Software形式を使用しています)。

2. 固定セルの染色

1. 生細胞画像診断のための細胞培養準備(所要時間:24時間)
   注:すべての実験において標準的な細胞培養プロトコルが遵守されました。Huh7細胞はDMEM/F12に10%のFBS、1%のペニシリン/ストレプトマイシンを37°C、5%の_CO2で維持しました。
   1. 実験の前日に、細胞をカバースリップ付きのプレートに分割し、翌日に30〜70%の合流率を達成します。
      注:12ウェルプレートに18mmカバースリップで10,000セル/ウェル、または13mmカバースリップを使った24ウェルプレートに15,000セル/ウェルを播種してください。
2. ペルオキシソーム染色(持続時間:1〜5分)
   1. 新しい培地でプローブを希釈し、空の感光微量遠心分離機管で最終作動濃度4μMにします。例えば、0.5mLの培地に対して、プローブ2μL(標準溶液:1 mM)をピペットに入れます。
   2. ステインする井戸を選び、マーカーペンで外側にラベルを付けます。
   3. 選んだウェルから全て(0.5 mL)の培地を吸引し、ステップ2.2.1のプローブ培地に置き換えます。プローブ媒体を選んだウェルに滴ずつ滴り、ピペットがウェルの壁に接触していることを確認します。
   4. 混合物をウェルに戻した後、37°Cで10〜15分間培養します。
      注意:この瞬間からセルは光に敏感なので、アルミホイルで覆うべきです。
3. 固定細胞内のペルオキシソームの染色後固定およびイメージング
   1. 染色後、培地を慎重に取り除き、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回洗浄します。
   2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液をPBSに室温で20分間塗布します。
   3. 指定された廃棄物容器にPFAを慎重に取り出してください。PBSで一度だけ細胞を洗浄します。
      注意:PFAは有毒であり、施設の規則に従って廃棄する必要があります。
   4. 免疫蛍光検査を進めるには、以下の手順に従ってください
      1. 細胞を透過させるために0.5%のトリトンX(PBSで希釈)を加えます。2.5分ほど離脱してください。
      2. 慎重にトリトンXを取り外してください。PBSで細胞を2回、10分間洗浄します。
      3. PBSで5%の牛血清アルブミン(BSA)溶液を室温で20分間、または4°Cで一晩ブロックします。
      4. 標準的な免疫蛍光検査を進めてください。

結果

ペルオキシSPYプローブは、ペルオキシソームの自然な基質である分岐型および非常に長鎖の脂肪酸を模倣するように設計^{されています5。}したがって、染色により細胞質からプローブが^5,6,7に誘導され、アデノシン三リン酸(ATP)結合カセットサブファミリーD(ABCD)に依存的に取り込まれます。細胞の代謝状態によっては、ATP依存性ABCD輸送がプローブを効率的かつ迅速に導入し、その結果、蛍光強度のペルオキシソームと細胞質の比率が高くなります(図1A)。高い比率を確保するための重要なステップには、定期的に細胞培地を補充し、高濃度で細胞を増殖させないことで細胞の飢餓を防ぐことが含まれます。

ペルオキシソーム染色の特異性を検証するためには、いくつかの対照群を含めることが推奨されます(図1B,C)。参照ペルオキシソームマーカー(例えばタンパク質輸入マーカーGFP-SKL)との共局在解析(図1B,C)。さらに、PEX19 KOのようなペルオキシソーム欠損細胞株が存在する場合、それらの細胞では染色が存在しません(図1B)^5,8。

ペルオキシソームプローブはペルオキシソーム密度の測定に用いられ(図1C)^5,9であり、基質の導入、ペルオキシソームの動態、相互作用の評価に開発が進められています。定量イメージングにおいては、染色手順、画像取得のタイミング(例:染色後10〜20分)、細胞株の準備、取得パラメータの標準化が重要です。一部の細胞株では、細胞質背景に対してペルオキシソームの信号強度を向上させるためにプローブ濃度とタイミングの最適化が必要であり、例えばCOS-7細胞では250 nMと20分の方が効果的です(図2A)。細胞はプローブを代謝し、時間とともにペルオキシソーム染色が徐々に減少していきます。しかし、過酸化体と細胞質の比率は24時間で改善されることがあります(図2B)。さらに、私たちは固定法を開発し、これにより抗体との共染色や後日ペルオキシソームの可視化が可能になります(図2C,D)。

図1:ペルオキシソームの生細胞イメージング。 (A) 染色の概説図。(b) GFP-SKLを過剰発現した細胞HEK293T WTおよびPEX19 KOの定焦点顕微鏡検査を行い、赤色ペルオキシソームプローブ(1μMで10分間)染色。スケールバー - 1 μmおよび10 μm。代表的な強度プロファイルが示されています。(C) GFP-SKLを過剰発現し、PeroxiSPYで染色したヒト線維芽細胞の共焦点顕微鏡検査(1μMで10分間)を測定。スケールバー - 1 μmおよび10 μm。代表的な強度プロファイルが示されています。(D) SW13(副腎皮質)、SH-SY5Y(神経芽細胞)、CCL-136(マイオサイト)、HaCat(ケラチノサイト)、U2OS(骨芽細胞)、およびHEK293T(ヒト胚性腎臓)細胞を赤色ペルオキシソームプローブ(1μMで10分間)染色した共焦点顕微鏡検査。スケールバー - 2μmおよび10μm。定量化は^前述の フィジー9を用いて行われ、平均SEM±1ミクロン平方あたりのペルオキシソーム数、3つの生物学的リピートからプールされたN=100細胞を示しています。*** - p < 0.001、**** - p < 0.0001、Kruskal-Wallis検定。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:固定細胞のペルオキシソームイメージング最適化および染色。 (A) COS-7(アフリカグリーンモンキー腎臓)細胞の共焦点顕微鏡検査で、赤色ペルオキシソームプローブで着色したプロトコル(1 μMで10分間、最適化前)および最適化条件下(250 nMで20分、最適化後)で実施。スケールバー - 10 μm。ペルオキシソームと細胞質の平均ピクセル強度はフィジーを用いて定量化し、比率で表しました。N = 7セル(最適化前)、21セル(最適化後)です。平均 ± SEM、*** - p < 0.001、**** - p < 0.0001、シャピロ・ウィルクス検定。(B) 赤色ペルオキシソームプローブ(1 μM)で染色したHEK293T細胞の共焦点顕微鏡観察を15分24時間実施。定量化により、ペルオキシソームと細胞質の蛍光強度、ペルオキシソームと細胞質の比率、SEM平均±、3つの生物学的リピートからプールされたN=680ペルオキシソーム、**** - p < 0.0001、シャピロ・ウィルクス検法が示されます。(C) 固定プロトコルを用いたペルオキシソームプローブで染色されたHuh7細胞の共焦点顕微鏡検査。ペルオキシソームは抗PEX14一次抗体(ブロッキング溶液で1:100、RTで1時間培養)および二次抗体(ブロッキング溶液で1:1000、Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488、RTで1時間培養)と共染色されました。代表的な共焦点画像が示されます。スケールバー - 10 μm(D) 定量化は、プロトコルに従い固定および透過化時に行われたHEK293T細胞のペルオキシソーム蛍光強度の変化を示し、平均±SEM、N = 100細胞、3つの生物学的リピートからプールした細胞、**** - p < 0.0001、Shapiro-Wilks検査。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

この単純なペルオキシソーム検出は、動物細胞内で10分以内に行うことができます。ペルオキシSPY染色は、生細胞内のペルオキシソームの可視化、定量化、トレースを可能にし、赤色(材料表)と極赤色プローブ⁵(材料表)で提供されています。染色は古典的なペルオキシソーム標的シグナル(PTS1)lベースの染色¹⁰(図1B)と同様の可視化を提供し、過剰発現を必要としません。蛍光色素は光安定性を持ち、超分解能イメージングやペルオキシソームの長期取得に利用可能です。^{実験条件5,9,11}。さらに、プローブはペルオキシソームの機能に敏感です。したがって、研究や^{診断用途のために}ペルオキシソーム病理5の検出および定量に利用できます。ペルオキシソーム染色はペルオキシソームの代謝と、ペルオキシソームが脂肪酸を取り入れ酸化する能力に依存します。したがって、使用する細胞株の濃度とタイミングを最適化することが重要です。ここでは、私たちが検査した細胞株に有効な標準手順を紹介します。染色のタイミングを24時間まで延長しても、ペルオキシソームと細胞質の蛍光強度比を失うことはありません(図2B)。

プローブは多くの哺乳類細胞株(図1および図2)およびゼブラフィッシュのDanio rerio細胞および胚5で^{試験され、}ペルオキシソームに対する特異性と使いやすさを示しました。これらのプローブは他の動物細胞株では試験されておらず、条件やプローブ濃度も最適化する必要があります。プローブは植物のシロイヌナズナ細胞のペルオキシソームを染色^{しません。}

ここではいくつかの問題と、それに伴うトラブルシューティングの解決策について議論します。もしペルオキシソームと細胞質の比率が低すぎる(過酸化物体染色が少ない)場合は、細胞を新たに分割し、再度分割して染色してください。染色には30〜70%のコンフルエンスを使いましょう。プローブの濃度を最適化してください(濃度が高すぎるとプローブを取り込むペルオキシソーム能力を超えます)およびタイミング(例: 図2A参照)。35mmのガラス底皿を使いましょう(96ウェルプレートでの染色は少量の混合が難しいため難しいです)。プローブはマイクロ遠心分離機チューブに加え、培地と十分に混合してから細胞に加えてください。異なる細胞株や条件によって染色に影響が出ます。最後に、プローブを洗い流すことで背景が減ります。しかし、信号は徐々に失われ、画像撮影を効果的に行う時間が短くなります。

もしペルオキシソームが見当たらない場合は、プローブが培地と混ざっていることを確認してください。プローブの濃度を上げます(例:2μM)。ペルオキシソームを視覚化できるように、追加のペルオキシソームマーカーを導入します。染色に細胞ごとに差異がある場合は、すべての培地を取り除き、アリコートと十分に混ぜてから再び細胞に加えることが重要です。これにより均一な染色が確保されます。もしまだ変異があるなら、細胞集団がペルオキシソーム基質の輸入能力に不均一である可能性があります。細胞の定期的な分割による同期は均一な染色を助けます。信号が検出されない場合は、顕微鏡のレーザー設定がプローブの励起/放出パラメータと互換性があるか確認してください。セルの外の背景が明るすぎる場合は、プローブを洗い流してその背景を除去します。しかし、信号は徐々に失われ、画像撮影が効果的に行われる時間帯が短くなります。さらに、固定効果を用いて背景を軽減することも可能です。固定後信号が非常に弱い場合は、Triton-X 100加算後に信号が失われていないか確認してください。このステップは、下流の用途に応じて変更または削除可能です。洗濯の回数を減らす。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗PEX14抗体	プロテインテック	10594-1-AP
共焦点顕微鏡	ニコン	A1r	高NA対物レンズを持つ共焦点顕微鏡(例:60倍油用NA1.4)は何でも
DMEM	パン・バイオテック	P04-03590	細胞培養培地
ガラス底イメージングプレート	セルヴィス	D35C4-20-1.5-N
ヤギの抗ウサギAlexa Fluor 488	ABCAM	AB150081
HEK293T	ATCC	CRL-3216
ペルオキシSPY555	スピロクロム	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
ペルキシスPY650	スピロクロム	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2