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方法論記事

腫瘍関連マクロファージ のin vitroモデリング:分泌因子が腫瘍微環境動態に果たす役割

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DOI:

10.3791/69406

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2025年12月30日

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

この記事について

サマリー

本論文は、ヒト単球に腫瘍細胞株からの条件付けされた培地を曝露することで腫瘍関連マクロファージ様細胞を生成する in vitro プロトコルを提示します。

要約

マクロファージは驚くべき可塑性を示し、さまざまな環境的手がかりに応じて異なる機能状態を獲得することが可能です。固形腫瘍では、腫瘍微小環境内で最も豊富な免疫細胞集団を形成し、腫瘍関連マクロファージ(TAM)と呼ばれます。TAMは悪性細胞と密接に相互作用し、腫瘍の進行、血管新生、免疫回避を積極的に促進します。腫瘍細胞は直接の細胞間接触や多様な分泌因子を通じてマクロファージを再プログラムし、腫瘍寄生表現型への分極形成を形成します。これらのTAM分極機構を in vitroで研究するため、腫瘍細胞株調理培地に存在する可溶性因子をヒト単球に曝露する方法を提案します。このプロトコルにより、制御条件下でTAM様マクロファージの生成が可能となり、腫瘍由来シグナルによって誘発される表現型および機能変化の解析が容易になります。私たちのアプローチは、腫瘍とマクロファージの相互作用を調査するための再現可能かつ生理学的に関連性の高いモデルを提供し、マクロファージ再プログラミングの理解を深め、がん免疫学および免疫療法における新しい治療戦略の研究を支援します。

概要

マクロファージは多機能な先天免疫細胞であり、その驚くべき可塑性により環境の手がかりに応じて多様な表現型を採用できます。固形腫瘍内では、マクロファージが最も豊富な免疫細胞集団となり、腫瘍関連マクロファージ(TAM)へと分化することが多い2。これらの細胞は腫瘍微小環境によって積極的に再プログラムされ、腫瘍の成長を支援し、血管新生を促進し、転移を促進し、効果的な抗腫瘍免疫応答を抑制します。腫瘍細胞は、直接的な細胞間相互作用と、サイトカイン、ケモカイン、成長因子などの複雑な分泌因子のレパートリーを通じてこの分極を促進し、これらはマクロファージの転写および機能プログラムを再形成します3。この動的な相互作用は、TAMsががん生物学における中心的役割を支え、マクロファージ可塑性を治療介入の課題であると同時に機会としても浮き彫りにしています。

TAMsの臨床的関連性はますます認識されており、腫瘍におけるその存在量は予後不良や治療抵抗性と相関することが多い4,5。その結果、TAMs 6は魅力的な治療対象として浮上しています。彼らのリクルートを阻害し、生存を阻害し、炎症性および腫瘍破壊性表現型へと再プログラムすることを目的とした戦略が現在調査中です。したがって、腫瘍由来因子がどのようにマクロファージをTAMに分極させるかのメカニズムを理解することは、効果的な免疫療法の開発に不可欠です。免疫チェックポイント遮断は多くのがんで大きな成功を示していますが、他のがんではその効果が限られています7。抗プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)や抗プログラム細胞死リガンド1(PDL-1)抗体などのT細胞標的治療法と、マクロファージ再プログラミング戦略を組み合わせることで、全体的な抗腫瘍免疫応答が強化される可能性があります。

TAM生物学を研究するための従来の実験モデルには、複雑で生理学的に関連性の高い環境を提供する生体内マウスがんモデルが含まれます8。これらのモデルはTAMの採用と機能に関する基本的な洞察を提供してきました。しかし、免疫シグナル伝達、腫瘍生物学、マクロファージ発生における種間差異が大きいため、ヒト疾患への直接翻訳は制限される可能性があります9,10。さらに、生体内システムの複雑さから、マクロファージ分極を駆動する特定のシグナル伝達経路や分子イベントの単離や研究が困難です。

対照的に、in vitroモデルはこれらのメカニズムを解剖するためのより簡素で制御された条件を提供します。最も広く使われているアプローチは、ヒト単球由来のマクロファージを特定の刺激で分極させることです:インターフェロンガンマ(IFN)と細菌リポ多糖(LPS)で炎症促進マクロファージ(M1)を生成し、インターロイキン4(IL-4)とインターロイキン10(IL-10)、またはデキサメタゾンを用いて様々な抗炎症マクロファージ(M2)サブタイプ11、12、13、14を得ることです.これらのモデルは、標準的なマクロファージ分極状態に関連する分子マーカーや転写プログラムの同定に役立っています。しかしながら、腫瘍内でマクロファージが遭遇する複雑で多因子的な環境の再現には及びません。そこでは、多数の可溶性メディエーター、代謝シグナル、細胞間相互作用が同時に影響を及ぼす分極が生じます15,16。古典的なM1/M2分類はマクロファージの機能状態を記述するのに依然として有用ですが、これまで考えられていたよりもはるかに多くのマクロファージ集団が存在することが明らかになりました。Ginhoux博士のグループおよび他の研究者の研究は、単一細胞トランスクリプトミクス手法を用いて、生理的条件下および疾患において見られるマクロファージサブセットの幅広い多様性を示しました17,18。これにより、TAMはしばしばM2様プロファイルに似ていると説明されますが、標準的なサイトカインだけで分化されたマクロファージと厳密には同等ではないことを浮き彫りにしています。むしろ、共通点はあるものの、文脈依存の明確な違いも示します。

このギャップを埋めるため、腫瘍細胞株から採取した条件付け培地にヒト単球由来のマクロファージを曝露することでTAM様分極をモデル化するin vitroプロトコルを提案します。この方法は、がん細胞が分泌するサイトカイン、ケモカイン、成長因子の豊富な混合物である腫瘍の分泌物の影響を捉えます。したがって、腫瘍由来の可溶性因子に応答するマクロファージの表現型および転写の再プログラミングを調査するための関連性があり、実験的に利用可能なシステムを提供します。従来の単球を腫瘍条件付けされた培地に直接曝露した手法とは異なり、このプロトコルはマクロファージの再プログラミングに特化し、腫瘍微小環境内の常駐マクロファージの挙動をよりよく反映します19,20。さらに、フローサイトメトリーによるマクロファージ分極を評価する最適化されたシンプルな表面マーカーパネルを組み込み、実装が容易で研究者のニーズに応じて拡張可能です(14,21)。最後に、M-CSFは単球をM2様表現型10,15,22,23,24にプライムさせることが示されているため、観察されるマクロファージ分極が腫瘍細胞株由来の条件付け培地への曝露に特異的に起因することを確実にするため、意図的に省略しました。

このアプローチにはいくつかの強みがあります。in vitroシステムの再現性と簡潔さを保持し、一次ヒト細胞を用いて翻訳上の関連性を高め、腫瘍微小環境の異質かつ多因子的な性質を単一サイトカインモデルよりもよく反映している点です 25,26,27,28.さらに、異なる腫瘍タイプや遺伝子組み換えがん細胞の条件付け培地に対するマクロファージ応答の比較研究を促進し、TAMの分極を変化させる可能性のある薬理学的薬剤の試験プラットフォームとしても機能します。一般的な応用性に加え、この方法は適切な細胞株を選択したり、条件付け培地の割合を調整したりすることで、異なる腫瘍モデルに合わせることができます。それでも、健康なドナーや腫瘍細胞株間の変動が再現性に影響を与える可能性があることを認識し、慎重な実験設計と標準化の重要性を強調しています。

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プロトコル

ヘルシンキ宣言に従い、健康なドナーから周辺血液サンプルがインフォームド・コンセントのもとで採取されました。このプロトコルはブエノスアイレス大学の倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。

注意:プロトコル全体を通じて無菌状態を維持し、バイオセーフティレベル2(BSL-2)キャビネット内で作業し、細胞生存率>90%)を確保してください。処分の際、すべての生物廃棄物はまず10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に少なくとも30分間浸して除染し、その後適切なバイオハザード処理容器に入れなければなりません。

1. 腫瘍細胞株培養および調製培地の調製

  1. MDA-MB-231トリプルネガティブヒト乳がん(または他の選択腫瘍)細胞株を液体窒素貯蔵から解凍します。すぐに細胞株を含むクライオチューブを37°Cの水浴に浸し、バイアルを優しく回して迅速かつ均一に解凍させます。ほぼ解凍したらすぐにバイアルを取り出してください。
  2. 解凍した細胞を、5mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mL遠心分離管に移します。セル懸浮液を室温(RT)で400× g で5分間遠心分離します。
    注意:細胞の生存率を維持するために解凍プロセスは迅速に行う必要があります。
  3. 上澄液を慎重に捨て、細胞ペレットを高グルコース(4.5 g/L)を含む新鮮な完全なデュルベッコ改良イーグル培地(DMEM)に素早く再懸浮させます。この中には10%胎児用牛血清(FBS)、4 mMグルタミン、1 mMのピルビン酸ナトリウムが含まれています。再懸浮ペレット中の細胞数を数え、以下の2段階の連続希釈を行います。
    1. まず無菌DMEM培地で1:5の細胞懸濁希釈を準備し、その後(1:2)で生存性染色のトリパンブルーで最終希釈1:10を得ます。
    2. 光学顕微鏡を使ってノイバウアー血球計(または計数室)内の生存細胞を数えます。青い染料を除外する生存細胞のみを数え、大きな角の正方形あたりの平均生存細胞数を算出します。
    3. 最終濃度は以下の式で計算します:Cells/mL = (平均細胞/平方数) × (希釈係数) × 10,000。
      注意:細胞を所定の完全なDMEM培地に再懸浮させ、最終濃度1×105cells/mLにします。
  4. 2.5 x 105 から5.0 x 105 の細胞を、5mLの完全なDMEM培地を含むT25培養フラスコにシードします。培養液を5%CO2の加湿インキュベーターで37°Cで維持し、採取に必要な細胞密度に達するまで保ちます。
  5. 種まきの翌日、顕微鏡で細胞の付着を確認します。細胞の50%以上が浮遊している場合(細胞死を示し)、古い培地を優しく吸引し、新鮮で予熱された培地2.5mLに置き換えます。
  6. 細胞の成長を毎日観察してください。培養が約90%のコンフルエンス(推定2.3×10x 6 細胞、T25フラスコ)に達すると、通常5日以内に細胞はサブカルチャー(分割)の準備が整います。セルを1:8の比率で分割するには、以下の手順に従ってください。
    1. 使用済みの培地は無菌のパスツールピペットで除去します。
    2. 細胞単一層を滅菌1倍PBS3mLで一度洗い流し、トリプシンを阻害する残留血清を除去します。PBSを1回吸引して捨てます。
    3. 細胞に0.25%トリプシン-1 mMエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)溶液1mLを加え、37°C、5%CO2で加湿インキュベーター上で3分間培養して細胞を剥離します。
      注:トリプシン/EDTAの最適な潜伏期間は特定の細胞株により、調整が必要になる場合があります。3分後に顕微鏡で細胞を確認し、完全に剥離されているか確認してください。
    4. 酵素活性を中和するには、完全なDMEM培地3 mLを加えます。すぐにピペットで上下にピペットを動かして細胞を完全に取り外し、懸浮させます。
  7. 細胞懸濁液3.5mLを15mLの円錐形チューブに移し、400 x g のRTで5分間遠心分離します。
  8. 上澄液を慎重に除去し、細胞ペレットを1mLの冷凍培地(90%FBSと10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むもの)に再懸濁します。細胞懸濁液を移してクライオビアルに分割し、1本あたり5×10個の5 細胞の濃度を確保し、将来の使用に備えます。
    1. 冷凍は、クライオバイアルをミスターフロスティ(または同様の制御速度冷凍容器)に入れて徐々に冷却する必要があります。容器を-80°Cの冷凍庫に移し、細胞を一晩冷凍させます。細胞は数日間-80°Cで保管できますが、その後は液体窒素に移して長期保存する必要があります。
      注意:細胞通過の詳細な記録を保持し、初期の通過を実験に活用してください。20回未満の細胞の使用が推奨されます。
  9. 新しい培養液が再び~90%の合流に達したら、吸引して上清液を15 mLの円錐形チューブに採取します。培養を継続したい場合は、収集した体積を新しい完全なDMEM培地に置き換えてください。
    1. 集めた上清液を400× g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞の残渣を除去します。上澄んだ調製液(清浄化された培地)はそのままにし、ペレットは捨てます。
  10. 浄化された培地を1mLの分量に分け、チューブにラベルを付けて使用まで-20°Cで保存します。
    注意:品質管理のため、条件付けされた培地の採取日と、アリコートが以前に解凍されているかどうかを必ず記録してください。同じアリコートを2回以上解凍することは強く避けることが推奨されます。さらに、凍結日から1ヶ月以内にコンディショニングを使い、最適な活性を確保しましょう。

2. 末梢血単核細胞(PBMCs)の単離

注:PBMCは末梢血40mLから分離され、3.8%シトウム酸ナトリウムで抗凝固されています。分離はフィコル・ヒパク密度勾配(1077)と遠心分離を用いて行われます。このプロトコル全体はBSL2キャビネット内で無菌状態で実施されなければなりません。

  1. 遠心分離の前に、抗凝固された末梢血サンプルを15mLまたは50mLの円錐形チューブに分割します。
  2. 遠心分離機で低速、200 × g 、15分間RTで血液成分を分離します。この過程では、最上層に血小板富血漿(PRP)が、その下に細胞分画(赤血球と白血球)が生成されます。最大5の場合、遠心分離機の加速度設定は4、減速は2。
  3. 遠心分離後、上清液(上部部分、すなわちPRP)を吸引し、新しい滅菌チューブに移します。
    注:下流実験のため必要に応じて、回収されたPRPは600 × g でRTで10分間(最大加速・減速)遠心分離して血小板を除去し、他のアッセイでは血小板なしで-20°Cの血漿を保存できます。
  4. ステップ2の初期遠心分離で得られた細胞下部は、無菌の室温1倍PBSを用いて、最終体積の2〜3倍に優しく希釈します。得られた懸濁液を逆回転させて柔らかく均質化し、それをフィコル・ヒパク密度勾配遠心分離に用います。
  5. 室温のフィコル・ヒパク15mLを滅菌50mLチューブに投与します。
  6. 薄めた血液30mLを慎重にゆっくりとフィコル・ヒパックの上に重ね、両相が混ざり合わないようにします。
  7. フィコル血層管を600 × g で25分間遠心分離します。ブレーキなしで遠心分離機をセットします(加速度:1;減速:0)。
  8. こぼれを防ぐために、得られた上部の少なくとも4mLを無菌パスツールピペットで捨ててください。次に、同じピペットを使って上部分率とフィコル・ヒパック透明分画の間に形成されたPBMCを含む白色リングを回収します。PBMCリングでフィコルを回収するのは避けてください。
  9. PBMCリングをチューブから無菌の15 mL遠心分離機チューブに移し、少なくとも3 mLの1x PBSを装填します。
  10. 15mLチューブにさらに1倍PBSを入れ、600× g (最大加速・減速)で遠心分離機を10分間RTで加熱します。
  11. 上澄液を逆回転で除去し、再び1xPBSを充填し、600 × g (最大加減速)で10分間RTで遠心分離します。
  12. 上清液を取り出し、PBMCペレットを2〜3 mLの無菌1x PBSと2%の熱不活FBS(1x PBS-2% FBS)に再懸浮させ、その後体積を10 mLまで上げます。細胞数を数え、滅菌冷たい1xPBSで希釈した1:5細胞懸濁液を準備し、その後0.4%のトリパンブルーで(1:2)を混ぜて最終希釈率を1:10にします。ステップ1.3.2で説明されているように、光学顕微鏡の細胞室を計数します。
  13. PBMCサスペンションを300× g で8〜10°Cで5分間回転させてください。 細胞を所定の無菌・冷温1x PBS-2% FBSに再懸浮させ、最終濃度108 cells/mLにします。これらの細胞は次のステップまで4°Cのままにしておきます。
    注:この時点で採取したPBMCは、108 cell/mLの冷凍培地(90% FBS-10% DMSO)で冷凍バイアルに冷凍できます。細胞がゆっくり凍るのを待つために、ミスターフロスティの容器で-80°Cの温度で一晩保存してください。翌日、細胞を保管箱に移し、-80°Cで数日間放置するか、液体窒素タンクに移して長時間保管するか、またはこの手順を継続してください。

3. 磁気ビーズを用いたCD14+単核球の選別

注:精製済みCD14+単球は、PBMCからヒトCD14+陽選択磁気選別キット11を用いて取得されます。PBMCにおけるCD14+細胞の割合はドナー依存的ですが、推定は10%(5〜20%の範囲)です。実験に必要な単球数に応じて、初期のPBMC数と最終反応体積を調整してください。推奨される最小反応容積は100μLであり、1×107 PBMC 未満の処理でも可能です。

  1. PBMC100μLごとに陽性選択カクテル10μLを加え、ピペットで上下に動かし、15分間氷で冷やしておきます。
  2. 使用前に30秒間、ビーズのサスペンションを渦巻きます。次に、100μLのPBMC懸濁液に対して10μLのビーズを追加します。よく混ぜて氷で15分間孵育します。
  3. 最終体積2.5 mLにPBS-2% FBS -1 mM EDTAを1個加え、懸濁液を優しく混ぜてチューブを磁石に挿入し、5分間インキュベートします。
  4. 真空管を外さずに磁石を逆さにして、捨てる受け取り管の上に2〜3秒間かけて揺れないようにします。陽性の細胞はチューブ内に残ります。
  5. チューブを磁石から取り出し、チューブ壁に1回のPBS-2% FBS -1 mM EDTAを加え、最終体積2.5 mLになります。
  6. 再びチューブを磁石に挿入し、5分間孵化させます。
  7. 真空管を外さずに磁石を逆さにして、捨てる受け取り管の上に2〜3秒間かけて揺れないようにします。磁石からチューブを取り出し、チューブ壁に1xPBS-2% FBSを3mL塗布してすべての細胞を回収します。
  8. 10μLを使って、ノイバウアーチャンバー内のCD14+細胞の数を光学顕微鏡で数えます。トライパンブルー1:2で薄めてください。
    注意:次の式に従って細胞数を計算してください:CD14+細胞数 = 培地 各象限あたりの生細胞数 × 希釈係数 x 10.000。
  9. CD14+細胞懸浮液を新しい無菌15mLチューブに入れ、600× g (最大加速・減速)で4°Cで10分間遠心分離して細胞を洗浄します。
  10. CD14+細胞をRPMI 1640培地に10% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシン(P/S)の完全培地を補足して、適切な体積で再懸濁し、次のステップに進むために2.5 x 106 cells/mLを得ます。これは得られた細胞数を考慮します。
    注意:CD14+単核球は次の段階まで氷上に保管し、これらの細胞がプラスチック管壁に付着するのを防いでください。

4. マクロファージの分化

  1. 2.5×10 5細胞のCD14+単球を48ウェル処理プレートで250μLの完全なRPMI培地(10% FBS-1% PS)に懸浮させ、48ウェル処理プレートでプレート化しました。
    注:96ウェル処理プレートの細胞数の半分でも可能です。
  2. プレートインキュベーション中の蒸発を減らすために、周囲の空の井戸に滅菌水を加えます。
  3. 細胞を37°Cで5%のCO₂を含み、加湿インキュベーターで5日間を培養し、形態、分化、生存率を毎日監視します。
    注:分化のためにM-CSF(25 ng/mL)を追加することも可能ですが、当プロトコルでは培養5日後に10%の高品質FBSのみを使用してM0マクロファージを得ることを確認しています。特にM-CSFは単球をM2様表現型にプライム化する可能性があるため、避けることを推奨します10,22。

5. マクロファージの条件付き培地への曝露と解析

  1. 分化5日目に、各ウェルから培地の50%(125μL)を優しく除去し、以下のいずれかに置き換えます。
    1. 新鮮なRPMI完全培地125μL(対照)、
    2. 腫瘍細胞株調制培地125μL(例:MDA-MB-231由来)、または
    3. 125μLのDMEM完全培地(調整培地の制御)。
      注:新しい腫瘍細胞株での初期最適化のために、10%、25%、50%など様々な条件付き培地濃度をテストしてください。この範囲はマクロファージの生存能力と分化変化を保証するために推奨されています。マクロファージの生存率が高い調整された培地の濃度が高い方を選びましょう。
  2. 7日目まで潜伏を続けます。
    注:5日目にM0マクロファージを得て、その後さらに2日間の培養を条件付けた培地の存在下で表面分極マーカーの発現を誘導します。分極面マーカーはフローサイトメトリーによって決定され、同様に標準化されたサイトカインを用いてM1またはM2マクロファージを生成する場合も同様です11,14。
  3. 毎日顕微鏡でマクロファージの生存率と形態を評価してください。
    注意:7日間の培養期間中、マクロファージの分化を毎日監視してください。細胞の付着は健康で生存可能な培養の指標として用いられます。柱状細胞の割合が高いことは、 図2に示すように、調整培地(CM)処理群における分化と分極の増加を示しています。

6. 流式サイトメトリーによる分極マーカー評価のためのマクロファージの採取

注:必要に応じて、腫瘍関連マクロファージの表現型特性をさらに拡張するために、RNAを単離して分極関連遺伝子(例:TGM2、IRF-4、CXCL10)を定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)で測定するか、培養上清液を収集して酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)による標準的なサイトカイン産生(例:TNFα、IL-6、IL-10)を測定することも可能です。これは我々のグループ11が報告しています。14歳。

  1. 各ウェルの全培養培地を無菌パスツールピペットまたはチップで優しく吸引し、細胞収穫用に1xPBS-2% FBS-1 mM EDTAバッファーを200μLの冷水添加します。
  2. 氷で10〜15分間培養し、その後1xPBS-2% FBSを200μL加えてEDTAバッファーを希釈します。マクロファージはピペットで上下に動いて(まだ氷の上で)5分間、すべての細胞が剥離されるまで採取します。
    注意:このステップは、十分な数の生存可能なマクロファージを得るために非常に重要です。細胞の生存率を維持するために、EDTA露出期間を推奨以上に延長しないことが重要です。検査終了後、顕微鏡下の細胞を確認し、完全に剥離されているか確認してください。
  3. 1.5 mLのマイクロチューブでマクロファージを採取し、1 mLの1x PBS-2% FBSで遠心分離して400 × g 、8〜10°Cで5分間洗浄します。
  4. マクロファージペレットを200μLの1x PBS-5% FBSで再懸濁し、96ウェルの丸底マイクロプレートに移してRTで非特異的ブロッキングを行います。細胞を400 x g で8〜10°Cで5分間遠心分離します。
  5. プレートを素早く逆さまにして上清液を捨てます。
  6. 各抗体ごとに1:50希釈因子を用いて、1xPBS-2% FBSで適切な直接結合抗体のカクテルを調製します。各サンプルに抗体カクテル50μLを染色し、暗闇で氷の上で30分間培養します。
    注:抗体カクテル:CD11b-PE/Cy7(200 μg/mL)、CD64-AlexaFluor 647(150 μg/mL)、CD163-PerCP/Cy5.5(200 μg/mL)、HLADR-PE(40 μg/mL)、CD206-AlexaFluor 488(400 μg/mL)。試定前の抗体濃度は 表1に記載されています。カタログ番号は 材料表に記載されています。
  7. 染色されたマクロファージを150μLの1xPBSを加え、遠心分離器で400× g 、8〜10°Cで5分間洗浄します。
  8. プレートを素早く逆さまにして上清液を捨てます。
  9. 細胞の生存可能性を測定するために、修復可能な生存可能性染料Zombie Violet(1:1,000、1xPBS)を100μL加え、暗闇で氷の上で30分間培養します。
  10. 染色された細胞を洗浄するには、1xPBSを100μL加え、 400xg で8〜10°Cで5分間遠心分離します。 200μLの1xPBSを使って洗いを繰り返します。
  11. 細胞ペレットを20μLの新鮮な1%パラホルマルデヒドで再懸浮させ、氷の上で暗闇で20分間培養します。
    注:固定には1%のパラホルマルデヒドが使用され、透過化は行われませんでした。オプション:市販の固定剤成分(BD固定剤/透過化キットの)もこのステップ11に使用可能です。
  12. 180μLの1x PBS-2% FBSを加え、400 x g で遠心分離機で8〜10°Cで5分間洗浄します。 洗濯手順を1xPBS-2% FBS200μLで繰り返します。
  13. 上澄液はプレート反逆によって廃棄され、ペレットを200μLの1x PBSで再懸浮させてフローサイトメトリー装置に持ち込み測定します。
    注意:染色と固定されたサンプルを同じ日にフローサイトメトリーで処理できない場合は、4°Cで保存し、光から遮蔽してください。できるだけ早くサンプルを分析してください。
  14. FlowJoソフトウェアを使ってフローサイトメトリーの結果を分析します。ゲーティング戦略は、前方散乱および側散乱(FSC/SSC)を用いてデブリを除外することから始まります。次に、生きたマクロファージをCD11b⁺ゾンビバイオレット細胞 として選択します。
    注:マクロファージにおける自己蛍光はドナー依存性であるため、各実験で同じドナーから派生した対照群を使用することが重要です。

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結果

MDA-MB-231細胞株の50%調整培地(CM)を単球由来のマクロファージを処理し、トリプルネガティブ乳がん腫瘍関連マクロファージ(TAM)様細胞を生成しました。単球は6人の独立した健康なドナーの末梢血単核細胞(PBMC)から選別され、私たちのプロトコルに従って分化しました。CM製剤は90%のコンフルエンスでMDA-MB-231細胞を用いていました(図1)。CMは5日目にマクロファージ培養に加えられ、細胞は7日目に採取されました。図2はCM有無の7日目の細胞形態を示しており、紡錘状細胞の割合が高いことはCM処理細胞における分化と分極の増加を示しています。分極状態はフローサイトメトリーと表面マーカーのパネルCD206、HLA-DR、CD64、CD163を用いて明確に定量化されました。図3は、これらのマーカーを車両(DMEM培地)とCM処理の代表的な比較を示してい...

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ディスカッション

ここで述べるプロトコルは、ヒト単球由来のマクロファージを腫瘍細胞系調和培地にさらすことで、腫瘍関連マクロファージ様分極を再現可能かつ実用的に研究するアプローチを提供します。このシステムは腫瘍細胞が分泌する可溶性因子の影響を捉えており、腫瘍微小環境7,9,10,15,19,20におけるマクロファージの再プログラミングにおいて重要な役割を果たすことが知られています。分析から直接的な細胞間接触を切り離すことで、この方法はマクロファージの表現型と機能を調節する可溶性成分の集中的な調査を可能にします。

このプロトコルの成功と再現性を確...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

国家科学技術振興庁(ANPCyT-FONCYT)からの助成金PICT 2021 I-INVI-00034(DRへ)、PICT 2021-I-A-00807(E.A.C.S.へ)、PICT 2021-I-A-00716(A.E.E.へ)を通じて提供された財政支援に感謝いたします。また、国立科学技術研究評議会(CONICET)のPIP 2022-0763助成金およびブエノスアイレス大学のPIDAE 2022に感謝します。

M.C.L.はブエノスアイレス大学医学部からレガド・ペルイル奨学金を受賞し、ANPCyT-FONCYT博士課程フェローシップも受賞しています。D.R.、E.A.C.S.、A.E.E.はCONICETのキャリア調査員です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
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Alexa Fluor 488マウス anti-human CD206抗体クローン15-2BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国。猫#321113;RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647マウス抗ヒトCD64抗体クローン10.1BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国。猫#305012;リッド:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBDバイオサイエンス、カリフォルニア州サンノゼ、アメリカ合衆国キャット# 554714固定液/透過性キット
ダルベッコ改良イーグルミディウム(DMEM)、高グルコースGibco サーモフィッシャー・サイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)およびnbsp;キャット# 11965092
EasySep ヒトCD14陽性選択キット;イージーセップ・ポジティブ・セレクション・カクテル;EasySep磁性ナノ粒子;イージーセップマグネットSTEMCELL Technologies、カナダ・バンクーバーカタログ#18058
FACS カント細胞計 ベクトン・ディキンソン、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、アメリカ合衆国。
胎児用牛血清、適格、ニュージーランド ギブコ&トレード; サーモフィッシャー・サイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)およびnbsp;キャット# 10091148
フィコル・パケ PLUS CytivaGEヘルスケア - ライフサイエンス、アメリカ猫#17144003
フロージョフロージョLLC。リッド:SCR_008520
GraphPadプリズム  グラフパッド・ソフトウェア株式会社リド:SCR_002798
Partec CyFlow宇宙細胞計およびSysmex Partec、ドイツ
PE抗ヒトHLA-DR抗体クローンL243BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国。猫#307605;RRID:AB_314683
PE/Cy7ラット抗マウス/ヒトCD11b抗体クローネM1/70BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国。猫#101216;RRID:AB_312799
PerCP/Cy5.5マウス抗ヒトCD163抗体クローンGHI/61BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国。猫#333607;リッド:AB_1134006
RPMI 1640 ミディアムGibco サーモフィッシャー・サイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)およびnbsp;キャット# 11875119
ピルビン酸ナトリウム溶液シグマ・オルドリッチ・メルク、ミズーリ州サンルイス、アメリカ合衆国 Cat# S8636
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッドGibco サーモフィッシャー・サイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)およびnbsp;キャット# 25200056
ゾンビバイオレット修正可能な実用性キットBioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国。キャット# 423113

参考文献

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