低密度好中球の効率的な精製のための迅速な磁気マイクロビーズ法

Summary

低密度好中球 (LDN) は、いくつかの疾患で大幅に増加します。LDNは通常、細胞選別によって単離されます。純粋で生存可能なLDNを得るための実用的な方法を提示します。末梢血の密度勾配遠心分離後、細胞を磁気マイクロビーズでインキュベートし、LDNを磁気カラムで分離します。

Abstract

自然免疫の重要な白血球である好中球は、伝統的に均質な細胞集団と考えられてきました。それにもかかわらず、最近の証拠は、好中球がいくつかの亜集団に存在することを示しています。そのような亜集団の1つが低密度好中球(LDN)です。LDNは健常者の血液中に少量存在しますが、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、がん、感染症などの疾患ではその数が大幅に増加します。これらの場合、LDNは病気の病因に関与する可能性があります。LDNを単離する唯一の方法は、末梢血の密度勾配遠心分離です。ただし、遠心分離後、LDNは単核細胞と共精製します。したがって、この好中球亜集団を研究することは困難です。LDN を単核細胞から分離する標準的な方法論はありません。通常、LDNはフローサイトメーターでの細胞選別によって分離されます。ただし、この方法では、さらなる機能研究に十分な純粋な細胞を得るために長い選別時間(数時間)が必要です。これは細胞の生存率と機能に深刻な影響を与えます。ここでは、純粋で生存可能なLDNを短時間で大量に得る実用的な方法を提案します。密度勾配遠心分離後、単核細胞画分を抗CD66b磁気マイクロビーズでインキュベートし、LDNを磁気カラムを介して<30分で分離します。精製されたLDN(CD66b⁺ 細胞)は、CD10、CD11b、CD14、CD15、CD16b、CD33、CD62L、CD66b、およびCD98に対するモノクローナル抗体で標識され、確認のためにフローサイトメトリーによって分析されます。精製されたLDNは、活性酸素種を生成し、好中球細胞外トラップを形成する能力によって示されるように、完全に機能します。この新しい精製法により、短期間で高純度(90%以上)と生存率(96%以上)のLDNが得られます。この方法は、生化学的またはその他のオミクス分析を通じてさまざまな疾患におけるLDN機能を評価するために、多数の純粋なLDNを取得するために簡単にスケールアップできます。

Introduction

ヒト血液中の主要な白血球である好中球¹ は、自然免疫系の重要な参加者です。それらは炎症や感染のある組織に大量に到着します².そこでは、好中球は食作用^3,4、脱顆粒^5,6、好中球細胞外トラップ(^NET)7の形成など、いくつかのエフェクター機能を活性化します。さらに、好中球は適応^{免疫応答にも}関与しています8。好中球の古典的な見解では、好中球は骨髄で産生される均質な細胞であり、所定の応答^9,10を有する。しかし、最近の研究では、好中球は健康状態と疾患状態の両方で複数の表現型および機能状態を持つ不均一な細胞であることが明らかになりました^{11、12、13、14、15}。

いくつかの好中球亜集団の中で、低密度好中球(LDN)は、その固有の特性と、いくつかの疾患で数が増加するため、多くの関心を集めています16,17,18。LDNは、1986年に全身性エリテマトーデス(SLE)患者の血液中に発見されました¹⁹。それらは、密度勾配^20,21で白血球を分離するプロセスに従って検出されました。血液または白血球に富む血漿を密度培地(Ficoll-Paqueなど)で遠心分離した後、単球およびリンパ球(末梢血単核球[PBMC]として知られる)は、チューブの上部(低密度)部分にバンドを形成します。チューブの底にある好中球沈殿物。PBMCの中には、いくつかの好中球も見つかりました。これらはLDNです(図1)。少数のLDNは健康な人の血液中にあります²²。しかし、LDN 数は、SLE^23,24、敗血症²⁵、乾癬²⁶、喘息²⁷、若年性特発性関節炎²⁸、抗好中球細胞質抗体 (ANCA) 関連血管炎²⁹、HIV 感染³⁰、マラリア³¹、結核³² などの複数の免疫抑制および慢性炎症状態で大幅に増加します.LDN 数は言及されたすべての病状で増加しますが、LDN は主に SLE¹⁷ の文脈で研究されてきました。SLE 患者の血液からの LDN は、NET³³ を形成し、大量の炎症誘発性メディエーター³⁴ を分泌し、T 細胞を活性化する能力が高いようです²⁴。しかし、癌などの他の状態では、LDNは成熟好中球と未熟好中球³⁵で構成され、T細胞抑制特性36,37,38を有することが報告されている。同様に、COVID-19患者では、LDNもT細胞増殖を抑制することが報告されています³⁹が、SLEとは対照的に、LDNはNETの産生が少ないようです³⁹。したがって、LDNの起源、組成、機能特性については依然として議論の余地がある。

LDNはPBMCと一緒に見つかるため、それらを研究することは技術的に複雑です。さまざまな病状におけるLDN特性を完全に調査するには、それらを精製する必要があります。LDN分離の一般的な手順は、蛍光細胞選別^{22、40、41、42、43、44、45}です。しかし、細胞選別は細胞分離に長い時間を要します。選別時間が十分でない場合、細胞の損失や回収率の低下につながる可能性があります。さらに、細胞は過度のストレスにさらされ、これらの細胞の機能を研究している間にさまざまな結果を引き起こします。選別時間が長いと、実験手順のコストも増加し、専門の人材が必要になります。

ここでは、非常に短時間で多数の純粋で生存可能なヒトLDNを取得するための迅速かつ効率的な方法を紹介します。密度勾配遠心分離後、LDNは磁気セルソーティング(MACS; 図1)。この精製法の主な利点は、LDNが高純度(90%以上)と生存率(96%以上)で分離されることです。また、精製されたLDNは、活性酸素種(ROS)を生成し、NETを放出する能力によって示されるように、完全に機能します。このプロトコルは、好中球生物学に関心のあるあらゆる研究室で簡単に実装でき、これらの細胞をさらに研究するために、複数の疾患を持つ人々の血液からLDNを迅速に分離できます。

Protocol

このプロトコルのすべての手順は、Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) の人間研究生命倫理委員会のガイドラインに従います。すべての参加者はインフォームドコンセントを提供しました。

1. ヒト血液からの末梢血単核球(PBMC)および好中球の単離

1. 静脈穿刺により健康な成人ボランティアから約10mLの血液を採取します。抗凝固剤として10 U / mLのヘパリンを追加します。
   注意: 針はバイオハザード針廃棄容器に廃棄してください。注射器や血液と接触するその他の物質は、廃棄する前に袋に入れ、オートクレーブ滅菌する必要があります。
2. 15 mLのコニカル遠心分離管に、2 mLの6%デキストランT500をPBSに加えます。次に、チューブの側面から排出して10mLの血液を追加します。チューブを数回反転させて、血液とデキストランを混合します。
3. 赤血球が沈殿している間、チューブを45分間休ませます。白血球が豊富な血漿は、赤血球層の上に現れます。
4. 別の15 mL遠心分離管に、5 mLの密度勾配培地を加えます。赤血球に触れずに血漿を慎重にピペットで移動させ、培地の上に重ねます。2つの別々のフェーズを形成する必要があります。
5. チューブを516 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 単核細胞(PBMC)は、血漿と培地層の間にバンドを形成します。好中球は底にペレットを形成します(図1)。
6. PBMCの絶縁
   1. 細胞に触れることなく、PBMC上部の血漿を吸引して除去します。血漿と培地の間のバンドから細胞を収集します。できるだけ少ない媒体を吸引するようにしてください。
   2. 細胞を50 mLの円錐形遠心分離管に入れます。20 mLのPBSを加えます。チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   3. 上清を注意深く吸引し、チューブをこすって細胞を分離します。10 mLの冷たいPBSを加えて細胞を再懸濁します。ノイバウアーチャンバーを使用してPBMCをカウントします。
      注:細胞に損傷を与える可能性があるため、ピペットを使用して細胞を再懸濁しないでください。
7. 好中球の単離
   1. 密度勾配媒体を除去します。チューブをこすって細胞を分離し、10 mLの冷たいPBSを加えます。
   2. 細胞を新鮮な50 mL遠心分離管に入れ、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、ステップ1.6.3で説明したように細胞を分離します。
8. 残留赤血球を除去するには、10 mLの冷たい低張溶液(0.2%NaCl、1%BSA、20 mM Hepes、pH = 7.4)を加え、正確に1分間穏やかに混合します。
9. 10 mLの冷たい高張溶液(1.6%NaCl、1%BSA、20 mM HEPES、pH = 7.4)をすばやく加えて、溶液を等張性にします。
10. ノイバウアーチャンバー(純度>95%)を使用して好中球を数えます。ステップ1.6.2のように遠心分離して細胞をペレット化します。そしてそれらを冷たいPBSに再懸濁します。チューブを氷の上に置いて維持します。
    注:in vitroでの好中球の半減期は8〜12時間46,47,48であると報告されています。このプロトコルに関する私たちの経験では、好中球は約6〜8時間その機能を維持します。

2. 低密度好中球(LDN)の精製

1. PBMCを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、細胞を120 μLのコールドウォッシュバッファー(PBS中の1%BSA)に再懸濁します。
2. 35 μLのCD66b磁気マイクロビーズを加えます。混合物を暗所で4°Cで30分間インキュベートします。細胞凝集を防ぐために、10分ごとに穏やかに混合します。
3. 1 mLのコールドウォッシュバッファーを加えます。細胞を微量遠心分離機に入れ、400 x g で3分間回転させます。
4. 上清を除去し、チューブをこすって細胞ペレットを分離し、細胞を1 mLの洗浄バッファーに再懸濁します。
5. 磁気分離カラムを磁石の上に置きます。0.5 mLの洗浄バッファーをカラムに加え、カラムを通過させます。
6. 細胞(1 mL)をカラムに転写します。バッファーを一滴ずつ列を通過させます。
7. 0.5 mLの洗浄バッファーをカラムに加え、通過させます。さらに0.5 mLの洗浄バッファーをカラムに加えます。
8. 磁石からカラムを取り外し、微量遠心チューブに入れます。1 mLの洗浄バッファーをカラムに加えます。
9. プランジャーをカラムの上に挿入し、穏やかに圧力をかけて細胞を溶出します。プランジャーを取り外し、新しい微量遠心チューブの上にカラムを置きます。
10. さらに1 mLの洗浄バッファーを追加します。プランジャーをカラムの上に挿入し、穏やかに圧力をかけて細胞を溶出します。
11. 両方のチューブを微量遠心分離機に入れ、800 x g で3分間回転させます。最後に、両方のチューブの細胞(LDN)を1 mLの冷たいPBSに再懸濁します。氷の上に置いてください。
    注:フロースルーの最初の2 mLには、残りのPBMCが含まれています。これらの細胞は、他の研究に使用できます。

3. マルチカラーフローサイトメトリー

1. 精製した細胞を標識バッファー(PBS中の1%FBS)に1 x 10⁶ cell/mLで再懸濁します。250 μLの細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに加えます。
2. 好中球膜分子に対する対応する抗体を追加します(詳細については、 材料表を参照)。細胞を4°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。
3. 1 mLのPBSを加えます。チューブを微量遠心分離機に入れ、800 x g で3分間回転させます。
4. 上清を吸引し、チューブを軽くたたいて細胞ペレットを破壊し、0.5 mLの1%パラホルムアルデヒドに細胞を再懸濁します。
5. フローサイトメトリーで分析するまで、細胞を光から保護した4°Cに保ちます。フローサイトメトリーで細胞を分析し、サンプルあたり10,000のイベントをキャプチャします。前述のようにセルソーティングを行う²².
   注意:パラホルムアルデヒドは皮膚や気道に刺激を与えます。蒸気を吸い込まないように注意してください。

4. 活性酸素種(ROS)の検出

1. 1.5 mLの微量遠心チューブに、2.5 x 10⁵ 個の細胞を加えます。チューブを微量遠心分離機に入れ、800 x g で3分間回転させます。
2. 上清を吸引し、チューブをこすって細胞を分離し、PBS中の15μMジヒドロロダミン123の100 μLに細胞を再懸濁します。
3. 光から保護された細胞を37°Cで20分間インキュベートします。1 mLのPBSを加えます。
4. チューブを微量遠心分離機に入れ、800 x g で3分間回転させます。上清を吸引し、チューブをこすって細胞を分離し、PBS中の100 μLの50 nMホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)に再懸濁します。
5. 光から保護された細胞を37°Cで45分間インキュベートします。1 mLのPBSを加えます。
6. チューブを微量遠心分離機に入れ、800 x g で3分間回転させます。上清を吸引し、チューブをこすって細胞を分離し、PBS中の0.5 mLの1%パラホルムアルデヒドに再懸濁します。
7. フローサイトメトリーで分析するまで、細胞を4°Cで光から保護します。フローサイトメトリーで細胞を分析し、サンプルあたり10,000のイベントをキャプチャします。

5. 好中球細胞外トラップ(NET)の可視化

1. カバーガラスを12ウェルプレートのウェルに入れ、10 μg/mLのポリ-L-リジンで覆います。プレートを4°Cで穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。
2. ポリ-L-リジンを取り除き、カバーガラスをPBSで洗浄し、プレートを室温で5分間インキュベートし、穏やかに攪拌します。カバーガラスをPBSでさらに2回洗浄します。
3. PBSを取り外し、プレートを層流フード内に2時間置いてカバーガラスを乾燥させます。
4. LDNを5%FBSを含むRPMI-1640培地に1 x 10⁶ 細胞/ mLで再懸濁します。350 μL(3.5 x 10⁵ 細胞)の細胞懸濁液を取り、カバーガラスを含む12ウェルプレートのウェルに入れます。
5. プレートを37°Cの5%CO₂ インキュベーターで30分間保持します。 PBSで希釈した3.5 μLの5 μM PMAを各ウェルに加えます(PMAの最終濃度は50 nM)。
6. プレートを37°Cの5%CO₂ インキュベーターで4時間保持します。 PBSに350 μLの8%パラホルムアルデヒドを加え、プレートを37°Cの5%CO₂ インキュベーターで一晩保持します。
7. 前述の⁴⁹のように試験管スタンドの上に透明なフィルムを置き、チューブの穴にウェルが形成されるようにする。
8. 各ウェルにさまざまな溶液を入れてカバーガラスを洗浄または染色し、大きな液滴を形成します。カバーガラスを取り外し、水滴の上に逆さまにして5分間置きます。同様に、カバーガラスを水でさらに3回洗います。
9. カバーガラスをブロッキングバッファー(PBS中の5%BSA)の一滴に逆さまに置き、室温で20分間インキュベートします。
10. カバーガラスをブロッキングバッファー中の対応する一次抗体(抗エラスターゼまたは抗シトルリンなど)の滴に移し、室温で60分間インキュベートします。
11. カバーガラスをPBS中の0.01%Tween-20で2回洗浄します。カバーガラスを150 nM DAPIを含むブロッキングバッファー内の対応する二次抗体の一滴に移し、光から保護して室温で60分間インキュベートします。
12. カバーガラスをPBS中の0.01%Tween-20で2回洗浄します。スライドガラスに退色防止封入剤を一滴垂らし、カバーガラスを逆さまに置きます。
13. マニキュアで周囲のカバーガラスをシールします。取り付けられたスライドは、光から保護して4°Cで保管してください。蛍光顕微鏡を使用してNETを視覚化します。

6. 好中球細胞外トラップ(NET)の検出

1. 細胞を5 x 10⁵ cell/mLで500 nM Sytox Greenに再懸濁し、5%FBSでRPMI-1640培地で希釈します。
2. 100 μL(5 x 10⁴ 細胞)の細胞懸濁液を取り、96ウェル組織培養プレートのウェルに入れます。
3. プレートを37°Cの5%CO₂ インキュベーターで20分間保持します。 RPMI-1640培地で希釈した20 μLの300 nM PMAを各ウェルに加えます(PMAの最終濃度は50 nM)。
4. プレートを予熱したマイクロプレートリーダーに移します。プレートを35°Cで4時間インキュベートし、プレートの底から5分ごとに蛍光測定を行います(485 nm励起フィルターと528 nm発光フィルターを使用)。

Results

健康な人の低密度好中球(LDN)は、PBMCの約5%を占めます(図2A)。ここで説明するプロトコルは、通常、純粋な(> 90%)LDNを提供します。細胞も効率的に回収され(収率約98%)、高い生存率(>95%;図2B)。比較のために、LDNも、前述のように蛍光活性化細胞選別によって精製された²²。簡単に言うと、PBMCは抗CD16b抗体で標識され、蛍光活性化細胞選別機で選別されました。LDNを3時間選別し、熱不活化FBSで回収しました(図2)。磁気的に精製された LDN は、好中球と同様の膜分子 (マーカー) を示す成熟細胞です。好中球は、膜マーカーCD10、CD11b、CD15、CD62L、およびCD66bを発現します(図3A)。同様に、磁気単離によって精製されたLDNは、同...

Discussion

一般に、好中球は均質な細胞と考えられていました。しかし、最近の証拠は、好中球が異なる活性化状態および/または複数の表現型を持つ細胞として存在する可能性があることを示しています。したがって、さまざまな好中球亜集団が存在する可能性があります13,14,15。好中球亜集団の1つである低密度好中球(LDN)は、その特定の固有の特性と、複数の疾患で増加するため、大きな関心を集めています16,17,18。LDNは、PBMC²²とともに血液から単離されます。したがって、それらを研究することは技術的に複雑です。さまざまな病状におけるLDN特性を完全に調査するためには、そ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗シトルリンウサギ多クローナル抗体	アブカム	AB100932	1/50希釈
96ウェル組織培養プレート	共演者;コーニング社	3596
Alexa Fluor 488 抗ヒトCD11bマウス IgG1抗体	バイオレジェンド	301317	0.25 & μ;g/mL
Alexa Fluor 647 抗ヒトCD66bマウスIgM抗体	バイオレジェンド	305109	0.05 & μ;g/mL
抗マウスIgG(H+L)ヤギ抗体、Alexa Fluor 488	インビトロジェン - サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11001	1/50希釈
抗好中球エラスターゼマウスモノクローナルIgG1抗体	サンタクルーズ・バイオテクノロジー	SC-55549	10 & micro;g/mL
抗ウサギIgG(H+L)ロバ抗体、Alexa Fluor 555	インビトロジェン - サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-31572	1/50希釈
APC抗ヒトCD62LマウスIgG1抗体	バイオレジェンド	304809	0.03 & μ;g/mL
APC/シアニン7抗ヒトCD14マウスIgG1抗体	バイオレジェンド	367107	0.25 & μ;g/mL
Attune NxT フローサイトメーター	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社	(青/赤レーザー)
牛血清アルブミン(BSA)フラクションV	MPバイオメディカル	810025
ブリリアント・バイオレット510抗体抗ヒトCD33マウスIgG1抗体	バイオレジェンド	366609	0.30 & mu;g/mL
ダピ	Calbiochem/EMD ミリポア	268298
デクトランT500	ファーマコスモスエアコン	5.51005E+11
ジヒドロロダミン-123	アナスペック社	AS-85711
FACSセルソーター	ベクトン・ディキンソン	モデルFACSAria
胎児用牛血清(FBS)	ギブコ	16000-044
フィコル・パーク	メルクKG	GE 17-1440-03
FITC 抗ヒトCD98マウス IgG1抗体	バイオレジェンド	315603	0.30 & mu;g/mL
フロージョソフトウェア	ベクトン・ディキンソン	バージョン10、2019年
蛍光倒立顕微鏡	オリンポス	モデルIX-70
ヘパリン	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
ヘペス	シグマ・オルドリッチ	H7006
MACSprep キメラ CD66b マイクロビーズ	ミルテニ・バイオテック	130-111-552
マグネット	ミルテニ・バイオテック	130-042-102
磁気分離カラム	ミルテニ・バイオテック	130-042-201
マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	モデル5415C
マイクロプレートリーダー	バイオテック・インスツルメンツ	モデルシナジーHT
パラホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	158127
PE抗ヒトCD10マウスIgG1抗体	バイオレジェンド	312203	0.05 & μ;g/mL
PE抗ヒトCD16bマウス IgG2a抗体	BD ファーミンゲン	550868	1/40希釈
PE/シアニン5抗体抗体(CD15マウスマウス)です	バイオレジェンド	323013	0.25 & μ;g/mL
フォボル12-ミリスタント13-酢酸(PMA)	シグマ・オルドリッチ	P8139
ポリLリジン	シグマ・オルドリッチ	P2658
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ	モデル5702R
RPMI-1640組織培養培地	ギブコ	23400-021
SYTOX グリーン	モレキュラー・プローブス社	S-7020
トゥイーン20	シグマ・オルドリッチ	P2287
ベクタシールド	ベクター研究所	H-1000