アンジオテンシンIIを用いた高血圧性心筋線維症のマウスモデル構築のためのプロトコル

Summary

浸透圧ポンプ を介した アンジオテンシン II (Ang II) の持続注入は、高血圧性心筋線維症の動物モデルを構築するための古典的な方法の 1 つです。このプロトコルは、このモデルを構築するプロセスを体系的に最適化し、浸透圧ポンプの注入、位置決め、およびAng II濃度設定の重要なポイントを詳しく説明しました。

Abstract

浸透圧ポンプ を介した アンジオテンシン II (Ang II) の持続注入は、高血圧性心筋線維症の動物モデルを確立するために広く利用されているアプローチです。それにもかかわらず、この技術は、Ang II の不安定性、不正確なポンプ配置、標準化された手順の欠如など、現在のレポートでは特定の制限を示しています。設立の方法論に関する現在の報告は、依然として比較的限られています。このプロトコルは、Ang II 溶液の標準化された調製、投与量の校正、浸透圧ポンプの正確な皮下移植、モデル評価指標の定量的標準など、マウスにおける Ang II 浸透圧ポンプ誘発性高血圧心筋線維症モデルの確立を体系的に最適化しました。実験結果は、Ang II 浸透圧ポンプがマウスの高血圧性心筋線維症を高い生存率で誘発することを実証しました。収縮期血圧 (SBP) レベルは、皮下移植の 7 日後に 160 mmHg で安定しました。モデルマウスは、左心室駆出率が有意に減少し、左心室の拡張末期寸法が増加しました。偽手術群と比較して、高血圧性心筋間質組織および血管周囲領域内のコラーゲン沈着が増加しました。本研究では、小さなサンプルサイズ(n = 6)に基づいて、Ang IIと浸透圧ポンプを組み合わせて高血圧性心筋線維症のマウスモデルを確立する可能性を予備的に検証し、定量的な表現型検証システムを確立しました。

Introduction

高血圧の主要な病理学的転帰である心筋線維症 (MF) は、損傷または圧迫された心筋内に過剰なコラーゲン線維が沈着することを特徴とします。これは、高血圧を介した標的臓器損傷の最も重要な形態の 1 つであり、進行性の心機能障害に寄与します ^1,2。適切な動物モデルの確立は、高血圧性心筋線維症の機構研究を推進し、新しい治療戦略を開発するために不可欠です。レニン-アンジオテンシン系の中枢エフェクターであるアンジオテンシン II (Ang II) は、高血圧の病因において極めて重要な役割を果たします³。したがって、Ang II ベースの誘導は、マウスの高血圧モデルを確立するために広く使用されているアプローチとなっています。

高血圧動物モデルを構築するための現在の方法には、主に外科的導入、薬理学的導入、およびトランスジェニック自発モデルが含まれます。外科的導入では通常、腎動脈収縮、上行大動脈収縮、大動脈弓収縮などの技術を使用して血流抵抗を人為的に増加させ、それによって血圧の上昇を誘発します⁴。これらの方法は、ストレス負荷関連の心臓リモデリングプロセスの研究に適した高血圧状態を迅速に確立できますが、多くの術後合併症を伴う複雑な手順を伴います。薬理学的導入は一般に、実験動物の血圧を上昇させるために腹腔内注射または経口投与を利用します⁵。この技術は比較的簡単ですが、モデルの安定性は、薬物投与量、投与頻度、および動物のストレス反応による干渉を受けやすいままです。安定した高血圧表現型を示す自然高血圧ラットやBPH/2J高血圧マウスなどのトランスジェニックモデルは、遺伝性高血圧症の研究に広く使用されています。しかし、それらの特異な病原性メカニズムにより、多因子誘発性臨床的高血圧をシミュレートする能力が制限されます。

最近では、皮下浸透圧ポンプによる Ang II の連続注入に基づく高血圧モデルが人気を集めています。この方法は、Ang IIの一定の速度での徐放を可能にし、長期間にわたって安定した血中濃度を維持して、病理学的プロセスを厳密に模倣し、マウスの高血圧性心筋線維症を再現します^6,7,8。それにもかかわらず、特にプロトコルの標準化と一貫性のない線維化転帰に関して、重要な制限が残っており、ポンプ移植技術や動物固有の反応などの要因によって影響を受ける可能性があります⁹。これらのギャップに対処するために、この研究では、Ang II 浸透圧ポンプベースのモデルを改良し、主要なステップを標準化し、視覚化されたプロトコルを提供します。これらの改善により再現性と実用的な適用性が向上し、高血圧性心筋線維症に関する将来の研究に貴重な参考がもたらされます。

Protocol

すべての実験手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドラインに従って実施され、実験プロトコルは南西医科大学の動物研究委員会によって承認されました(承認番号SWMU2020317)。

1. Ang II溶液の調製と浸透圧ポンプの充填

1. 体重20±1 gのSPFグレードの雄C57BL / 6Jマウス12匹(材料 表を参照)を、年齢に伴う交絡因子を制御するために、発達の均一性のために8週間齢の動物を選択しました。マウスを単純な無作為化法を使用して偽手術群とモデル群に分け、各グループに6匹のマウスを配置します。
2. マウスの初期体重を測定し、Ang IIの用量( 材料表を参照)を1.46 mg / kg / dと決定します。
   注:予備実験によると、1.46 mg / kg / dがAng IIの最適用量です。この用量は収縮期血圧を約 160 mmHg に確実に維持し、4 週間の研究を通じて動物の生存を確保しながら、病的心筋線維症を効果的に誘発します。
3. 4°Cに予冷した2.45 mLの0.9%滅菌生理食塩水を10 mgのAng II凍結乾燥粉末に加えます。溶液をよく混ぜ、すぐに使用できるように氷の上に置いてください。
4. シリンジを使用してAng II溶液を引き出し、6つの浸透圧ポンプ( 材料 表を参照)チャンバーのそれぞれに200 μL(3.91 mmol / L濃度)を順次注入して、氷上で手順を実行します。
5. ポンプを37°Cの滅菌生理食塩水に48時間浸すことにより、浸透圧ドライブを作動させます。
   注:偽手術グループの浸透圧ポンプに同量の生理食塩水を入れます。Ang IIは感光性であるため、手順は全体を通して完全な光保護の下で実施する必要があります。

2. 浸透圧ポンプの注入とモデル⁶の構築

1. 動物の準備と麻酔
   1. マウスを水に自由にアクセスできるように4時間断食します。次に、各マウスの体重を量り、適切な麻酔用量(80 mg / kgペントバルビタールナトリウム)を計算します¹⁰。
   2. 計算された用量のペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射 によって マウスを麻酔します。
      注:ペントバルビタールの取り扱いには、規制の遵守、ヒュームフードでの操作、保護具の着用、および個別廃棄のための残留液体のラベル付けが必要です。
2. カミソリまたは脱毛クリームを使用して、尾の付け根から背側中央部まで伸びる領域の背側皮膚から毛を取り除きます。
3. 剃毛部位を70%エタノールで3回徹底消毒する¹¹。
4. メスを使用して、消毒した領域内に0.5cmの皮下切開を行います。
5. 切開を通して、鉗子を使用して皮下組織を首の後部に向かって鈍く分離し、ポケットを作成します。
6. カテーテルの先端がマウスの頭を向くようにポンプ本体の向きを合わせます。次に、止血鉗子でチップをクランプし、ポンプをその方向に皮下に挿入します。
7. ポンプ移植後、中断された6-0吸収性縫合糸で皮下組織を縫合し、外科用縫合糸で皮膚切開部を閉じます。次に、マウスを麻酔から完全に回復するまで予熱した37°Cのサーマルマットに入れます(約5〜10分)。
8. 調製したAng II溶液を所定の用量(1.46 mg / kg / d)で浸透圧ポンプ を介して 28日間連続注入します。
9. 28 日間の注入期間が終了したら、すべての実験データを収集します。次に、以前の麻酔で行われたのと同じ方法、つまりステップ2.1.1〜2.1.2で説明した手順に従ってマウスを麻酔し、頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。

3.血圧測定

1. 機器( 材料表を参照)予熱:加熱プラットフォームを37〜38°Cに設定して、マウス尾血管の血管拡張を確実にします。
2. マウスをそっとつかんで拘束ホルダーに置き、テールが後部の穴から自由に突き出るようにします。次に、露出した尻尾をアルコールを吸った綿球で徹底的に掃除します。
3. 尾の付け根にインフレータブルカフを置きます。脈拍センサーをカフから約5〜10 mm遠位の中央から下部の尾部に配置します。
4. デバイスを起動し、パルス波形が安定するのを待ってから続行します。
5. 測定サイクルを開始します。システムは自動的にカフを200mmHgを超える圧力まで膨らませて血流を遮断し、その後、毎秒2〜3mmHgでゆっくりと収縮させます。センサーは、流れが再開すると脈波の再出現を検出し、収縮期血圧を決定します。
6. モデリング後 7 日間隔で収縮期血圧 (SBP) を測定し、合計 5 回測定します。各マウスについて、すべての時点で3つの連続した読み取り値を記録し、連続した測定の間に2分間の休憩時間を確保します。
7. 測定後、マウスを餌と水を入れたケージに戻します。相互汚染を防ぐために、ホルダーとテールスリーブを清掃してください。

4.心機能測定

1. モデリングの28日目に、すべての実験マウスをペントバルビタールナトリウム(80 mg / kgペントバルビタールナトリウム)で麻酔します。
2. マウスを一定温度のプラットフォーム上で仰臥位に置きます。
3. 超音波システムを使用して経胸壁心エコー検査を行います( 材料表を参照)。マウスの手足をプラットフォーム上の電極に接続して、心電図(ECG)信号を監視します。
4. Mモード超音波 を介して 乳腺筋レベルでの短軸画像を取得し、心臓を視覚化し、心機能を分析します。マウスごとに3枚の画像をキャプチャし、左心室内拡張期寸法(LVIDd)、左心室内径収縮期(LVID)、左心室短縮率(LVFS)、および左心室駆出率(LVEF)のその後の分析のためにデータを平均化します。
   注:胸腔を圧迫することなく、プローブと胸壁の接触を維持します。心室中隔に垂直なMモードサンプリングラインを確保します。平均値を取得するために、≥ 3 つの心周期の連続測定を実行します。

5.マッソン染色

1. 心臓のサンプリングと固定
   1. ペントバルビタールナトリウム(80 mg / kgペントバルビタールナトリウム)でマウスを麻酔します。次に、はさみを使用して胸腔内に約1.5cmの縦方向の切開を行い、主要な心臓血管を結紮し、牽引損傷を避けるために心臓を急速に切除します¹²。
   2. 切除した心臓を予冷したPBSですぐにすすぎ、血液を取り除き、清潔なろ紙を使用して余分な水分を優しく吸い取ります。続いて、乳頭筋に沿って横切面を行い、厚さ3mmの組織スライスを得る。
   3. 固定には、心臓サンプルを4%パラホルムアルデヒドに48時間以上浸漬し、組織と固定物の体積比を1:10にします。
2. 4%パラホルムアルデヒド固定剤から心臓組織を取り除きます。次に、ヒュームフードの下で、サージカルナイフで組織を厚さ4μmで薄くスライスし、スライスを脱水カセット¹³に移します。
3. 組織切片を脱水機にロードし、次の手順を実行します:70%エタノール、80%エタノール、95%エタノールをそれぞれ1時間。100%エタノールI&IIをそれぞれ45分間。キシレンI&IIをそれぞれ30分間。
4. 組織をパラフィンに埋め込み、予冷した-20°Cのコールドプレート上でブロックを固化します。
5. パラフィンミクロトームを使用して、パラフィン包埋組織ブロックから厚さ4μmの縦切片を取得します。次に、切片を次の溶液にそれぞれ5分間順次浸漬し、脱パラフィン化して再水和します:キシレンI、キシレンII、無水エタノール、95%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、最後に蒸留水。
6. 調製したワイガート鉄ヘマトキシリン染色液に組織を8分間浸漬します。次に、蒸留水で繰り返しすすぎ、余分な染色液を取り除きます。酸性エタノール分化溶液中で5秒間分化させ、続いてマッソンブルーイング溶液で5分間ブルーイングします。最後に、蒸留水ですすいでください¹⁴.
7. 切片をカーマインレッドで10分間染色し、スライドあたり約200〜300 μLを塗布して、組織を完全かつ均一に覆うようにします。次に、切片を0.2%氷酢酸で1分間すすぎます。
8. 切片をリンモリブ酸溶液で約5分間、または筋線維が赤くなるまで処理します。次に、組織を完全に覆うのに十分な量のアニリンブルー溶液(通常、スライドあたり200〜300 μL)で切片を5分間染色します。最後に、0.2%氷酢酸溶液¹⁵で切片をすすぎます。
9. 段階的なエタノールシリーズを通して切片を脱水します。それぞれ1〜2分の3回の浸漬を使用して、キシレンで組織を除去します。
10. 少量の中性樹脂を塗布し、カバーガラスで覆ってセクションを取り付けます。
11. 顕微鏡検査( 材料表を参照):マッソン染色組織を40×倍率、20×倍率、および10×倍率で観察します。代表的な画像を保存するために、各スライドを撮影します。
    注: すべての廃棄物は、施設の安全プロトコルに従って廃棄してください。耐食性バレルに酸性分化液と氷酢酸を回収し、高濃度廃棄物をpH 6〜8に中和し、アルカリ性溶液と混合しないでください。エタノールは防爆バレルに入れ、火源から離れた涼しい場所に保管してください。キシレンを茶色の樽に入れ、保護具を着用したヒュームフードで操作し、酸(物質)をエタノールと混合しないでください。動物組織をラベル付きの容器に入れ、密封し、冷凍条件下で保管します¹⁶.最後に、すべての廃棄物を資格のある専門機関に移送して処分します。廃棄物を混ぜたり、気軽に廃棄したりすることは固く禁じてください。

6. 統計分析

1. すべての数値データを収集し、GraphPad Prism 9.0を使用して分析します。
2. 独立サンプルのt検定を使用して、グループ間の差を分析します。
3. 統計的有意性を、有意性の高い場合は**P < 0.01、有意の場合は*P < 0.05 に設定します。

Results

12匹のマウスに浸透圧ポンプを皮下に移植し、生存した。モデル群はすべて高血圧を発症しました (n = 6)。移植後 7 日後、モデル群の平均 SBP は 160 mmHg を超えました (図 1A)。14、21、および28日目に、モデル群のSBPは一貫して160 mmHgを超えました。対照的に、偽手術グループは、有意な上昇なしに、実験全体を通して正常な SBP レベル (約 90-110 mmHg) を維持しました。

浸透圧ポンプの移植から 28 日後、心エコー検査では、偽手術群と比較して、モデル群は心室壁の薄化、後壁の代償性肥厚、および前壁の動きの減少を示したことが示されました (図 1B)。LVEFとLVFSの有意な減少が観察されましたが(P < 0.01)、LVIDdとLVIDは有意な増加を示しました(P < 0.01)(図1C-F)。この発見は、マウスのモデル群が心臓構造の変...

Discussion

このプロトコルは、浸透圧ポンプを使用して高血圧性心筋線維症を誘発するために Ang II の持続注入に関与する重要なステップを最適化し、浸透圧ポンプの移植位置や Ang II 濃度の設定などの重要な側面を詳細に説明しました。モデル 2004 ポンプは 4 週間の期間として選択され、Ang II 用量は公称注入速度に基づいて計算され、バッチ間のばらつきが最小限に抑えられました。このモデルの有効性は、SBP モニタリング、心臓カラー ドップラー超音波、およびマッソン染色によって確認されました。このプロトコルでは、8週齢の雄C57BL / 6Jマウスを使用して、実験被験者の発達段階の均一性を確保し、それによって実験結果に対する年齢の交絡効果を最小限に抑えました¹⁹。

モデル群のマウスは、Ang II搭載浸透圧ポンプを移植してから7日目にSBPの有意な増加を示し、その後160mmHgにとどまり、3週間連続でこのレベルに維持されました。この動的反応は、Ang II の二相性昇圧...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アン II	シグマ・オルドリッチ社	シグマ、A9525
動物麻酔装置	深圳報酬生命科学有限公司	R530
動物用人工呼吸器	深圳報酬生命科学有限公司	R415
GraphPadプリズム	グラフパッド・ソフトウェア株式会社	バージョン9.0
インテリジェントな非侵襲的血圧計	日本ソフトドラゴン株式会社	ソフトロン、BP-98A
光顕微鏡	易景通光学技術(上海)有限公司	オリンパス、SZ61TR
マッソン三色染色剤およびキット	北京ソレイバオ科技有限公司	ソラルビオ、G1340
マウス	成都ドッシー・エクスプリメンタル・アニマルズ株式会社	C57BL/6J
浸透圧ポンプ	ALZAコーポレーション	アルゼット、モデル2004
超音波イメージングシステム	FUJIFILM VisualSonics Corporation(カナダ)	富士フィルム、Vevo 3100