脳転移のモデル化:立体定位皮質内注射による転移性コロナゼーションおよび組織学的成長パターンの標準化解析

サマリー

立体定位頭蓋内注射技術は、マウス皮質への腫瘍細胞の正確かつ局所的な移植を可能にし、脳の転移性コロナゼーションを研究する強力なモデルとなっています。

要約

脳転移は進行した固形腫瘍の一般的かつ壊滅的な合併症であり、しばしば予後不良、神経機能の低下、生活の質の低下と関連しています。中枢神経系(CNS)の機能不全や神経機能死の発生率は急速に増加していますが、二次的な転移、再定着、組織学的成長パターン(HGP)が潜在的な代理パラメータとして関与していることなど、脳転移の最終段階を駆動するメカニズムは依然として十分に解明されていません。

標準化された立体定位皮質内注射モデルにより、腫瘍細胞や間質細胞や免疫成分を含む混合集団をマウスの大脳皮質に直接正確に再現可能に移植することが可能です。このプロトコルはまた、前臨床組織アーカイブの作成を支援し、転移性成長、HGP特異的成長動態、神経機能不全に寄与する病態生理学的メカニズムなど、CNS定着の重要な側面を調査するための堅牢なプラットフォームを提供します。さらに、このモデルは再現性のある臨床的文脈での薬理学的検査を支援します。

全身注射法(例:尾静脈注射法や心内注射法)は早期転移段階の研究に最適化されているものの、脳の定着率は変動的かつしばしば低いのに対し、立体定位モデルは一貫した脳特異的な転移性成長を保証し、中枢神経系転移の後期段階の調査を可能にします。オルガノイドや脳スライス培養などの 生前 システムと比較して、 生体内 立体定位モデルは血管形成、全身シグナル伝達、脳の免疫地形の全複雑さを保持し、腫瘍の進行と治療反応の長期研究を支援します。

再現性が高く臨床的に関連性の高いプラットフォームを提供することで、本モデルは予後マーカーの特定、治療戦略の探求、末期脳転移のメカニズムの理解を進めています。

概要

脳転移は固形腫瘍患者に共通し壊滅的な合併症であり、予後不良、著しい神経学的低下、生活の質の低下と関連していることが多い^1,2,3。特に、肺がん、乳がん、メラノーマ(4,5,6,7)では、中枢神経系(CNS)の機能不全や神経死がますます頻繁に起こる結果となっています。脳転移における中枢神経系の機能不全は、局所的な塊効果、腫瘍周囲浮腫、頭蓋内出血、髄膜の播散など、さまざまなメカニズムから生じることがあり、これらは独立して作用したり相乗的に作用したりして、最終的に神経学的な死を引き起こすこともあります⁸。

臨床的重要性があるにもかかわらず、中枢神経系不全および転移の最終段階の病態生理学的メカニズムは、依然として十分に解明されていません。代替的散布、二次散布、再植民といったプロセスは、専用調査の焦点となることは^稀です。臨床試験も前臨床研究も、脳転移数、サイズ、全生存率(OS)などのエンドポイントに分析を限定し、重要な機構的知見や神経学的衰退・死亡の真の原因を見落とすことが多いです。

この文脈で、私たちおよび他の研究者は、脳転移における臨床アウトカム^9,10,11と相関する異なる組織学的成長パターン(HGPs)を特定しました。主に3つのHGPが記載されています:i) 非浸潤性で、しばしば反応性の星形細胞リムに囲まれた明確な腫瘍境界が特徴;ii) 上皮浸潤性で、腫瘍細胞のクラスターが隣接する脳実質に星状細胞性収容なしに浸潤する現象;iii) 広範囲に単一の腫瘍細胞や小さな細胞群が浸潤し、広範囲なアストログリオシスを引き起こすびまい浸潤性^10,12。

臨床的には、浸潤性HGPは非浸潤型パターンと比較して予後が有意に悪化すると関連しています(^9,10,11)。さらに、HGPは腫瘍の成長動態や神経死に至るメカニズムの重要な側面を反映しているようです。非浸潤性転移は通常、単一の病変として拡大し脳内の重要構造を制圧しますが、浸潤性病変は中枢神経系内で二次的な転移(原発腫瘍ではなく既存の病変から開始)を示し、広範な損傷や臓器の完全な破壊に寄与します(未発表データ)。浸潤性病変は髄膜を再定着させることもあり、髄膜転移に寄与し、疾患経過をさらに複雑にする^10,13。臨床的関連性があるにもかかわらず、脳転移のHGPsおよび中枢神経系の最終段階(二次的な媒介および再定着を含む)は、適切な実験モデルの不足により、依然として十分に研究されていません。

このギャップを埋めるために、腫瘍細胞や腫瘍細胞と1つ以上の非腫瘍細胞からなる細胞混合物を、実験マウスの大脳皮質に正確に再現性のある移植を可能にする立体定位頭蓋内注射モデルを提示します。このモデルは全身転移モデルの主要な限界を克服し、中枢神経系のコロナー形成の重要な側面を調査するための堅牢なプラットフォームを提供します。例えば、コロナイゼーション中の腫瘍と免疫細胞の相互作用¹⁴、前処理細胞混合物の影響¹⁵、転移性外成長¹⁶、HGP特異的成長動態、神経機能不全に寄与する病態生理学的メカニズム(未発表データ)などです。さらに、このモデルは再現可能で臨床的に関連性の高い文脈での薬理学的検査を支援しています(^14,15)。

本プロトコルは、脳転移におけるHGPを研究するための立体定位注射モデルを実装するための詳細な方法論的枠組みを提供します。また、後期CNSコロニゼーション生物学の体系的調査のための構造化された前臨床サンプルアーカイブおよびデジタル組織ライブラリの開発も支援しています。私たちの目標は、予後および潜在的に予測的なバイオマーカーの特定を可能にし、治療戦略の改善に貢献し、脳実質および免疫系の急性および慢性反応の予測能力を高めることです。このアプローチを通じて、CNSの定着と転移進行の体系的な研究のための標準化されたプラットフォームを提供しようとしています。

プロトコル

本プロトコルで記載されたすべての動物処置は、機関のガイドラインに従って実施され、下フランケン州政府(許可番号:RUF-55.2.2-2532-2-1678)によって承認されました。このプロトコルは、脳の転移性定着モデルとして、合成性成体マウス(10〜12週齢)における腫瘍細胞の立体定位皮質内注射を目的と設計されています。プロトコルの変更がある場合は、指定された動物福祉担当官と相談してください。

1. 術前手技

1. 動物の順応
   注意:マウスは実験手順開始の少なくとも7日前に順応させる必要があります。
   1. 実験動物を標準的な実験室条件(22 ± 2°C、相対湿度50-60%、明暗サイクル12時間)でグループで飼育し、自由に餌と水 を得られます 。
   2. 福祉を促進しストレス軽減のために、巣材やシェルター、かじりブロックなどの環境豊かさを提供しましょう。
   3. 慣れ期間中は1日1回(セッションあたり3〜5分)動物を触って、人間との接触に慣れさせましょう。さらに、侵襲的な介入を行わず、今後の手術の重要な側面、例えば体重測定や麻酔装置への曝露を模擬した模擬手技を実施します。これらのセッションは、動物を手続き環境に慣れさせ、ストレスに伴う変動を最小限に抑えることを目的としています。
2. 身体検査(術前の健康診断)
   注:腫瘍細胞注射前に、すべての動物は研究に関連しない既存の異常を除外するために徹底的な身体的および神経学的検査を受けなければなりません。欠損や異常を示す動物は研究から除外すべきです。身体検査は注射前日に行うことができます。
   1. 被毛の状態、姿勢、呼吸、歩行、体重、全体的な行動など、全体的な健康状態を総合的に検査します。
   2. 握力と協調性を評価するために、ハンギングワイヤーテストを用いて神経機能を評価します。吊り下げワイヤーテストを行うには、直径約2mmの水平ワイヤーを2つの支柱の間に吊り下げ、脱出プラットフォームをパッド面の約30cm上に設置します。ネズミをワイヤーの中央に置き、前足でワイヤーを掴ませます。マウスを離してすぐにタイミングを計り始めてください。マウスがプラットフォームの一つに到達するか落下した時点で試行を終了します。マウスが60秒以内にプラットフォームに到達した場合、成功とみなします。この制限時間内に落下したりプラットフォームに到達しなかった場合は失敗として記録してください。
3. ワークステーションの準備
   1. 手術当日(0日目)には、以下の通り4つの専用ワークステーションを設置し、効率的なワークフローを確保し、手術中ずっと無菌技術を維持します。
      注意:滅菌の外科用材料(下着、ガーゼ圧布、縫合糸など)とオートクレーブされた手術器具(メス、鉗子、ハサミ、ヘラなど)を使用してください。
      1. ワークステーション#1 - 手術前の動物準備:このワークステーションを使ってマウスの体重測定、麻酔溶液の準備、麻酔の投与を行います。秤、寝具付きのケージ2つ(麻酔マウス用に指定)、麻酔液を入れた1mLの注射器、眼軟膏を用意します。
      2. ワークステーション#2 - 手術前後のセットアップ:このワークステーションを使って頭皮切開を行い、頭蓋骨を封じ、傷口を縫合します。清潔な表面を用意し、メス、0.9%NaCl入り10mLの注射器、骨ワックス、ヘラ、縫合材、鉗子とハサミ、綿棒、消毒剤(70%エタノール)、鎮痛剤入りの1mL注射器、そして温熱パッドまたは同様の温熱用プラットフォームを用意します。
      3. ワークステーション#3 - 腫瘍細胞の準備:このワークステーションを使って接種前に腫瘍細胞溶液を準備してください。10μLのハミルトン注射器と細胞外マトリックス(ECM)培地中の細胞懸濁液を持つエッペンドルフチューブを備えたアイスボックス、細胞再懸濁用の100μLチップ付きピペット、そして腫瘍細胞接種後のハミルトン注射器洗浄用の3つの容器を準備します。そこには蒸留水、70%エタノール、0.9%NaClが含まれています。
      4. ワークステーション#4 - 定位注射:このワークステーションを使って大脳皮質に定位腫瘍細胞注射を行います。小動物用の立体定位フレーム、精密な歯科用ドリル、大型鉗子、綿棒を含む清潔な表面を用意してください。
4. 腫瘍細胞懸濁液の調製
   注意:腫瘍細胞懸濁液の準備のすべての手順は、認証済みの生物学的安全キャビネット(クラスIIフード)内で、適切な個人用防護具(PPE)(白衣、手袋、眼を保護する)を使用して行われなければなりません。これにより、無菌性を確保し、潜在的なバイオハザード曝露から人員を守ります。
   1. トリプシン1mLを1倍EDTAで細胞にトリプシンを作ろう。
      注:腫瘍細胞は指数関数的な成長期に使用することが推奨されます。
   2. 適切な計数方法(例:ヘモサイトメーターや自動細胞計)を用いて正確に細胞数を測定してください。
   3. 1匹あたり3μLのECM培地に1×10個の^3個細胞 を含む細胞懸濁液を準備します。ECMと標準培養培地(FCS10%を含む)を2:1の混合液で使用し、必要に応じて他のサプリメントも適切に含まれます。動物の数に応じて懸濁液の体積と細胞数を拡大します(例:10匹のマウスの場合、30 μL ECM培地に10個׳ 個の細胞を準備します)。
      注意:注射細胞の数は各細胞株ごとに慎重に滴定されるべきです。
   4. 注射までは細胞懸濁液を氷に保管し、最大2時間まで保管してください。

2. 術中手技

1. マウス麻酔
   1. 精密スケールで各マウスの体重を測り、体重に基づいて必要な麻酔薬の量を計算します。
   2. 計算された麻酔量を腹腔内に投与します。
      注意:手術全体(約2時間)をカバーする麻酔療法を使用してください。例えば:ケタミン10%(塩酸ケタミン、100 mg/mL、体重100 mg/kg)とドミトル(メデトミジン塩酸塩、1 mg/mL、0.25 mg/体重)または同等のプロトコルを組み合わせる。
   3. 十分な麻酔深度が確認されたら、体温調節を助けるために事前に温められた温熱パッド(37〜38°Cで維持)にマウスを置き、角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。
      注意:後ろ足を鉗子で優しくつまんで十分な麻酔深度を確認してください。離脱反射が見られない場合にのみ手術を進めてください。
2. 頭皮の準備と切開
   1. 術前にリドカインを投与し、切開部に局所麻酔を与えます。1%リドカイン溶液(5 mg/mL)を使い、計画された切開線に沿って約0.05〜0.1 mLを皮下注射します。頭皮切開を進める前に、麻酔が効くまで少なくとも2〜3分は待ちましょう。
   2. ヨウ素系溶液で頭皮を徹底的に消毒してください。
   3. 皮膚を張って引き伸ばし、無菌メスを使って頭蓋骨に沿って約3〜4mmの中央線切開をします。
   4. 同じメスで骨膜を優しく削り取り、頭蓋骨の表面を露出させます。
3. 立体定位フレームのセットアップ、座標識別、開頭術
   1. 耳棒を使ってネズミの頭部を立体視枠に固定します。
   2. 立体定位腕を使い、冠状縫合線と矢状図頭蓋骨縫合線の交差点であるブレグマを特定し、図 1B に示されたように前頭野の目標注射部位に前方2mm、右側1mmを移動させ、外科的マーカーでマーキングします。
      注意:注射部位に血管がある場合は、出血を防ぐために最大0.5mmまで位置を調整しることができます。
   3. 精密な歯科用ドリルで頭蓋骨を慎重にドリルし、硬膜を貫かないように注意してください。
   4. 無菌の鉗子で優しく探って突破口を確認しましょう。
4. 腫瘍細胞注射
   注意:この工程では迅速に作業してください。ECMは室温で固化し始めるため、注入の精度や一貫性に影響を及ぼす可能性があります。
   1. 腫瘍細胞の懸浮液をピペットで上下にしっかり再懸浮させ、均等な分布を確保します。
      注意:気泡の発生を防ぐために渦巻きは避けてください。
   2. セル懸濁液3μLを10μLのハミルトンシリンジに注入し、適切なホルダーを使って立体定位フレームに置きます。
   3. 注射器の針をバリホールの上に慎重に位置付けます。
      注意:注射時の再現性を高めるために、針の面取りが左向きであることを確認しましょう。
   4. 針を脳組織に縦に3.5mmの深さまで刺します。この深さに達したら、注射中および注射後に細胞懸濁液の逆流を防ぐために、針をゆっくり0.5mm引き抜きます。
   5. 腫瘍細胞懸液3μLを1分間ゆっくりと注射します。全量の投与後は、さらに2分間針をそのままにして細胞とECMが落ち着くまで待ち、逆流のリスクを最小限に抑えてください。
   6. 慎重に注射器を抜き、マウスを立体視フレームから外してください。
5. 麻酔からの縫合と回復
   1. 頭蓋骨を無菌の0.9%NaCl溶液で優しくすすいでください。
   2. 骨ワックスでバリホールを乾燥させて密封します。
   3. 頭皮の切開部を3〜4本の縫合糸で閉じ、それぞれの縫合糸を傷口の縁に3本のきつく結び目をつけてしっかりと結び、適切な治癒を促します。
   4. 指定された識別番号に対応した適切な耳のパンチパターンでマウスの耳をマークします。
   5. 回復中の角膜乾燥を防ぐために、必要に応じて眼軟膏を再塗りしてください。その後すぐに、体温調節を助け、麻酔の回復を円滑にするために、事前に温められた温熱パッド(37〜38°Cで維持)に戻してください。
      注意:回復中は、目覚めた動物と回復中の動物の相互作用による怪我を防ぐために、マウスを個別に飼育することが推奨されています。
   6. ハミルトンシリンジは、針とバレルを3回連続して洗い流し、まず蒸留水で、次に70%エタノールで、最後に滅菌0.9%NaCl溶液で洗い流します。
   7. 洗浄後は、次に使うまで氷の上で保管してください。

3. 術後の処置

1. 術後鎮痛
   1. マウスが麻酔下にある間に皮下で鎮痛剤を投与し、術後の即時の痛み緩和を確実にします。
      注意:この種の処置に適した鎮痛剤を使用してください。例えば、体重10mg/kgのカルプロフェンです。
   2. ネズミが完全に目覚めて正常な運動機能を取り戻したら、新しい寝具を敷いた清潔なケージに移してください。動物の正常な行動や呼吸パターンを短時間観察してください。
   3. 完全回復後は、少なくとも24時間は水(例:メタミゾール、体重200mg/kg) による 鎮痛を投与してください。
      注意:水分摂取を促すために、飲料水に0.5%ショ糖を加えて甘くしてください。飲み物のボトルはアルミホイルで包んで光から守り、毎日交換してください。各ボトルに鎮痛剤の摂取量を記録するためにラベルを貼りましょう。鎮痛剤を飲用水 で 摂取しない場合や痛みの兆候がある場合は、完全に回復するまで12時間ごとにカルプロフェン(10 mg/kg)を皮下投与してください。
2. マウスモニタリング
   1. 手術後最初の48時間は24時間ごとにすべてのマウスを注意深く監視し、運動機能と行動を評価します。3日目以降は、少なくとも3日に一度はマウスをモニタリングし、体重測定も含めて行ってください。
   2. 苦痛や異常な行動(例:運動機能障害、異常な行動)が観察された場合は、前述のハンギングワイヤーテストを実施します。マウスが検査に合格したら、引き続き観察し、1日おきに検査を繰り返します。
   3. あらかじめ定められた人道的評価項目のいずれかを満たしたら、マウスは直ちに安楽死してください(3.4節参照):初期体重から20%>減少した場合(0日目)、ハンギングワイヤーテストに合格しなかった場合、または最大48時間続く中程度の苦痛の継続。
3. 治療的治療(任意)
   1. 術後完全回復後、実験計画に応じて治療レジメンを開始することがあります。その場合は、研究プロトコルで治療開始の時期を明確に定め、治療介入の期待される効果および潜在的な副作用を反映するようにモニタリング計画を調整してください。
      注意:動物が正常な行動を示し、体重が安定し、術後の苦痛の兆候がないまで治療は開始すべきではありません。
4. 安楽死と組織採取
   注意:マウスは、特定の研究目的で求められるあらかじめ定められた人道的基準点を達成した直ちに、または指定された実験時点で安楽死させなければなりません。
   1. 適切な方法でマウスを麻酔します(ステップ2.1.2参照)。
   2. 胸腔を開け、氷のように冷たい滅菌0.9%NaClを10〜20mL、続いて氷のように冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)を10〜20mLで心腔灌流します。
      注意:下流の応用(例:RNA分離やFACS)に新鮮組織が必要な場合は、PFA灌流ステップを省略してください。
   3. 脳や他の関心のある臓器を集めてください。
      注:臓器は液体窒素で速凍したり、FFPE処理のためにホルマリンに固定したり、直接下流解析に使用したりできます。
5. 構造化された死後分析
   注:転移性増殖の確認と関連する組織病理学的特徴を特徴づけるために、脳組織の死後分析は、生来(新鮮に凍結された)サンプルと固定された(FFPE)サンプルの両方を用いて行うべきです。
   1. 組織剥離
      1. 図1Cに示されたスキーマに従い、注射部位のレベルで脳を解剖します。
      2. 前方部分は新鮮冷凍(FF)加工用に保持してください。この部分を注入半球(i.)と非注入(n.i.)半球に分けます。
      3. 中央部分はホルマリン固定およびパラフィン埋め込み(FFPE)のために保存してください。
      4. 小脳や脳幹を含む後部は除外してください。
   2. サンプル処理
      1. 前半部を液体窒素で速凍し、FFサンプルを-80°Cで保存し、再使用まで保管します。
      2. 中央部分を室温で4%PFAを5〜7mL浸して48時間固定し、その後FFPE処理を行います。
         注意:PFA固定は、有害な煙への曝露を避けるため、適切なPPEを着用した化学換気フード内で行う必要があります。
   3. 転移性負荷(FFサンプル)の定量化
      1. 脳組織に最適化された適切な抽出キットまたはプロトコルを用いて全RNAを単離します。
         注意:RNAの分離は、有害な試薬への汚染や曝露を防ぐため、適切なPPEを着用した生物学的安全キャビネット内で行う必要があります。
      2. Ck8などの腫瘍細胞特異的マーカーを用いて定量PCR(qPCR)を実施します。
         注:追加の標的(例:免疫細胞マーカーや間質細胞マーカー)は、適切な遺伝子マーカーを選択することで評価されることがあります。RNAシーケンシング(RNA-seq)は、トランスクリプトーム全体の解析の代替手段として用いられることがあります。
      3. 関心遺伝子(GOI、例: Ck8)をハウスキーピング遺伝子(HK)に正規化して相対腫瘍負荷を計算します。
   4. 組織学的解析(FFPEサンプル)
      1. ホルマリン固定組織をパラフィンに埋め込む。
      2. ミクロトームを用いて3μmの厚さの切片にサンプルを切片します。
         注意:マイクロトームの使用は、適切なPPEを装備した訓練を受けた人員が行い、切断しない場合は刃のガードを使用し、刃は鋭利な容器に保管して安全を確保します。
      3. Ck8(腫瘍細胞)、Cd3(T細胞)、Iba1(ミクログリア/マクロファージ)、Gfap(アストロサイト)などの関連抗体を用いて、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色および免疫組織化学(IHC)を実施します。
         注意:H&EおよびIHCの処置は、安全性を確保し化学物質の曝露を防ぐために、換気の良い場所や排気フードで行う必要があります。
      4. 高解像度スライドスキャナーを用いて染色されたスライドをデジタルスキャンし、デジタル組織ライブラリを構築します。
      5. 公表されたプロトコル^10,12に従い、脳転移の組織学的成長パターン(HGP)を評価します。

結果

立体定位注射プロトコル(図1)は、科学的質問に応じて野生型や遺伝子組み換え株を含む、合成株および異種移植マウスの両方に適用可能です。脳内で成長可能な適切な細胞株なら何でも使用可能です。脳に定着できるマウス腫瘍細胞株の例としては、乳がん細胞4T1および410.4、大腸がん細胞CMT93、メラノーマ細胞株B16-F10などがありますが、これらに限定されません。腫瘍細胞が脳内で転移を確立するのにかかる時間は細胞株によって異なり、数日から数週間まで及び、浸透率も変動します。私たちは、最大実験期間20週間以内に10匹中7匹が転移を発症する~70%のモデルを使用することを推奨します(図2A)。各細胞株は個別に最適化され、注入される細胞数は慎重に滴定されるべきです。

例として、私たちは密接に関連する2つの乳がん脳転移モデル、410.4とその派生体4T1を比較しました。遺^伝的には似ているにもかかわらず、これらの細胞株は脳内で大きく異なる転移的行動や成長パターンを示します¹⁶。両者は転移性負担は似ています(図2B)が、それぞれ独自の時間経過(図2C)を示し、明確に異なるHGPs(図2D)を示します。異なる細胞株間のココロニゼーション効率を体系的に評価・比較するために、注入細胞数、中央値生存期間、コロニゼーション成功率を統合した数学式であるコロニゼーション指数を開発しました(図2E-G)。

初めて立体定位注射を行う場合や新しい細胞株を試験する際は、成長パターンを慎重に評価し、動物、手術、実験者を対象に結果を比較することが再現性を確保するために不可欠です。重要なステップの一つが腫瘍細胞注入であり、この過程で細胞懸濁液の漏れが起こる可能性があります。これにより、腫瘍の位置が誤解されやすく、特に医原性腫瘍細胞が頭蓋骨や髄膜にシードされてしまい、真の脳内定殖を代表しない偽陽性髄膜転移とその後の二次髄膜転移につながる可能性があります。これらのシナリオは 図3に示されています。

図1:マウスにおける立体定位皮質腫瘍細胞注入の術前、術中、術後の処置。手順の概要。 (A) 術前段階には、動物の順応、健康評価、手術部位の準備、腫瘍細胞の懸浮が含まれます。(B) 術中段階では、麻酔誘導、頭皮切開、立体定位フレームへの配置、正確な開頭切除、立体定位座標を用いた腫瘍細胞の大脳皮質注入、創傷の閉鎖、麻酔からの回復が含まれます。(C) 術後段階は鎮痛剤の投与、術後の回復状況を評価するための定期モニタリング、全体的な健康状態、神経症状の発症(吊り金線検査)から始まり、その後安楽死および臓器摘出を行います。構造化された死後解析も含まれており、qPCRを用いた新鮮凍結(FF)組織の転移負荷を評価し、デジタルスライドライブラリーのFFPEサンプルの組織学的成長パターンを評価します。主要な手技段階は順番に示され、タイミングと手術のワークフローを強調しています。画像はBioRenderで作成されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:4T1および410.4乳がん細胞の立体定位注射後の脳転移マウスモデルにおける転移性増殖の代表的な結果。 (A) ECM注入対照群Balb/Cマウス(対照群)では腫瘍増殖が認められず、腫瘍細胞ECM懸濁液を注入したマウスでは目に見える転移病変が認められていることを示す巨視画像(Met)。(B) ECM注入対照マウス(CTRL)および4T1および410.4乳がん細胞由来の脳転移マウスにおける転移負荷の定量化。転移負荷は、 Ck8 を腫瘍マーカーとして用い、 Gapdh および Pgk1 をハウスキーピング遺伝子(HK)としてqPCRで評価しました。データは個々のデータポイントを含む平均値として提示されます。統計解析は一元ANOVAを用いて行われ、その後ダネットの多重比較検定(n = 5; ****P < 0.0001)を用いました。(C) ECM単独(対照、黒)、4T1(オレンジ)、410.4(青)腫瘍細胞を立体的に注射したマウスの全生存(OS)を比較したKaplan-Meier生存曲線。統計解析は対数ランク(Mantel-Cox)検定(4T1対410.4;n=10;***P < 0.001)を用いて行われました。(D) 4T1および410.4細胞から導出された脳転移の代表的な組織学的画像。それぞれコホート型および鎖状浸潤上皮HGPを含む成長パターンの違いを示す。組織切片は抗サイトケラチン8抗体で染色されました。(E) コロニゼーション効率の比較分析(Colonization Index, CI)を用いる。CI値は4T1(オレンジ)と410.4(青)を示しています。(F) CIを計算するために使われる式。(G) 両モデルのCIに含まれるパラメータをまとめた表。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:成功した定位注射の結果と最適でない代表例。 (A,C)異なる部位での転移性増殖を示す巨視画像:(A) 誤った腫瘍細胞の注入と漏出による頭蓋骨および髄膜の腫瘍増殖、(C) 適切な皮質内注射後の成功した実質転移。(B,D)対応する組織学的切片は、(B) 髄膜内腫瘍の増殖とその後の脳実質への浸潤、(D) 確立された実質転移による髄膜への二次転移を確認すること。組織切片は抗サイトケラチン8抗体で染色されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

立体定位頭蓋内注射技術は、腫瘍細胞や細胞混合物を実験マウスの大脳皮質に直接正確かつ局所的に送達することを可能にします。構造化された死後分析と組み合わせることで、このモデルは転移性の転移、二次的な臓器内転播、死因の可能性を含む脳転移の後期段階の研究に特に有用です。これに対し、全身注射法(例:尾静脈注射や心内注射)は、腫瘍細胞の循環中の生存、漏出、遠隔臓器へのシーディングなど、転移性カスケードの初期段階を調べるのに適しています。しかし、これらのアプローチは脳特異的ではなく、通常は低く一貫性のない脳定着率をもたらします(18,19,20)。

全身モデルはまた、特にどの脳領域が影響を受けるかに高い生物学的変動を示しており、治療研究は困難であり、大規模な動物コホートが必要となります。さらに、動物はしばしば頭蓋外転移を発症し、早期^試験中止につながることもあります。これらの制限は、末期脳転移の研究における有用性を著しく低下させます。さらに、二次的な転移や再定着は、全系統モデルを用いて調査するのが特に困難であり、原発腫瘍から起因する一次転移と既に確立された転移に起因する二次転移を区別することはほぼ不可能です。さらに、特に脳転移の巨量転移性成長やHGPsの評価のための構造化された死後分析は、これらの環境では限界があります。

患者由来オルガノイド(PDO)や脳細胞型スライス(共)培養^21,22,23,24などの生体外システムと比較して、立体定位注射はいくつかの重要な利点を提供します。生体外モデルは、脳の固有の構造の一部を保存し、患者やドナーからの常駐および浸潤免疫細胞を含む場合もありますが、血管形成や全身シグナル伝達、特にT細胞や他の血液・骨髄由来免疫細胞のさらなる浸潤を含む生体内腫瘍微小環境の複雑さを欠いています²³.これらの制限により、短期研究や薬物スクリーニングや基本的な細胞-脳相互作用アッセイなどの簡易な環境に適用が限られています。これに対し、定位アプローチは腫瘍の進行、免疫応答、治療的介入の長期研究を支援します。重要なのは、神経症状を人道的評価項目として評価することで、マクロ転移開始の臨床的に関連性のある測定が可能になることです。これにより、モデルは人間の疾患経過をより反映しやすくなり、特にトランスレーショナルリサーチにおいて価値があります。動物の使用を含み、3R(置換、還元、洗練)の遵守による倫理的考慮を提起していますが、現時点では生前外の代替手段で完全に置き換えることはできません。脳転移の生理学的文脈を全て再現できる能力は、転移性ダイナミクスおよび中枢神経系特有の病態生理学の理解を深める上で不可欠です。

多くの利点があるにもかかわらず、立体定位注入モデルには考慮すべきいくつかの制限があります。主な懸念は、注射時に腫瘍細胞の懸濁液が漏れる可能性があり、これが誤った成長パターンを引き起こす可能性があることです。特に、腫瘍細胞が髄膜に意図せず付着すると、医原性髄膜転移8を引き起こす^{可能性があり、これは}この特定の細胞株における自然な転移経過を正確に反映していません。データの信頼性を確保するために、特定の腫瘍細胞株の成長パターンは動物、外科手術、実験者間で一貫して比較されるべきです。腫瘍細胞の漏れを最小限に抑えるために、細胞外マトリックス(ECM)の使用を提案します。これはゲル状の粘度と体温で固化する能力から有用なツールです。しかし、ECMには早期固化を防ぐために注入中の迅速な取り扱いが必要という課題もあります。私たちのプロトコルで考慮すべきもう一つの点は、腫瘍細胞をECMと血清含有培地の混合液に注入することです。FBSは通常脳内で限られている栄養素を供給することで腫瘍細胞の移植を促進する一方で、炎症を促進することもあります。もし懸念がある場合は、血清フリー培地やバランス塩溶液(例:HBSSやPBS)が代替として使われることがあります。

さらに、定位注射は静脈内注射など他の方法よりも技術的に負荷が高いです。再現性を確保するために特別な訓練が必要であり、手術時間もかなりかかり、通常1匹あたり15〜30分かかりますが、点滴注射は3〜5分で終わります。この長期化は1セッションあたり処理できる動物の数を制限し、統計的検出力を得るために大規模なコホートを必要とする治療研究にとっては課題となる可能性があります。しかし、この制限は複数日に注射を分散することで効果的に対処でき、実験の柔軟性と実現可能性を高めるだけでなく、腫瘍細胞の行動や宿主応答における個体間差異をより現実的に反映する貴重な生物学的変動性も生み出します。

最後に、このモデルは前述の転移カスケードの初期段階を迂回していることに注意が必要です。適切な実験モデルは、研究課題と研究対象の転移の特定の段階に基づいて選択されるべきです。後期脳の定着を研究する際には、立体定位皮質内注射がゴールドスタンダードとして認められています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物用耳用パンチペンチ	ラボアート
Bepanthen®眼と鼻の軟膏	バイエル・ヴィタル有限会社	1578675
骨ワックス	B.ブラウン	210434
綿棒	ハートマン	143213
カルトレックス基底膜(ECM)エキス	B&D	3432-005-01
消毒剤	B.ブラウン	107190
ドリルビット	ビラニー・コンサルタンツGmbH	D #76
アイシザーズ	ヘルムレ	501
ハミルトン注射器(10µLボリューム)	VWR	5491135
温熱パッド	インターガストロ	258122
マウス・ナセ/トゥースバーアッセ(900/1430)	ビラニー・コンサルタンツGmbH	DKI 926-B
ノイズのアイハサミ	ヘルムレ	545
パウアー60度;チップノンノプトーレマウスイヤーバー	ビラニー・コンサルタンツGmbH	DKI 922
メス	PFMメディカルAG	17027
セムキン標準鉗子	ヘルムレ	710
セラロンポリアミド縫合糸(DR-009、USP 7/0、EP 0.5)	セラーグ・ヴィースナー有限会社およびnbsp;	V0053491
ステレオタキシックドリル - ジェイコブズ・チャック - 18000rpm	ビラニー・コンサルタンツGmbH	DKI 1471-200-CE-A
ラットアダプターなしの立体走位	ビラニー・コンサルタンツGmbH	DKI 963 % 920
5&5のシリンジHDDER10µハミルトン	ビラニー・コンサルタンツGmbH	DKI 1772-F1
TC ニードルホルダー メイヨーヒール 160mm	ヘルムレ	6425