豚腸組織からのクリプトおよび間質質細胞の最適化された逐次分離

Summary

本研究は、豚の空腸組織から腸内cryptおよび腸間質細胞(iMSCs)を逐次分離するための段階的なプロトコルを提供します。この手法は、腸内恒常性と再生中の細胞クロストークを研究するための再現可能で生理学的に関連性の高い上皮-間質共培養モデルの開発に適した2次元腸内膜モノレイヤーおよびiMSCを生成します。

Abstract

腸上皮は、基礎となる腸介質間質細胞(iMSCs)と密接に相互作用し、発生、恒常性、再生を調節します。しかし、豚の組織から上皮画と間質画の両方を逐次分離する標準化された方法は限られています。このプロトコルは、同じ子豚の空腸セグメントからクリプトとiMSCを分離するための最適化された段階的プロセスを記述しています。この方法は、エチレンジアミネテトラ酢酸/ジチオスレイトール(EDTA/DTT)ベースの解離バッファーを用いてクリプトを放出し、その後細胞外マトリックスのコラーゲナーゼ/ディスパーゼ消化でiMSCを分離します。このアプローチは、分離された細胞内の空間的変動を最小限に抑えます。分離されたクリプトは成功裏に培養され、コラーゲンハイドロゲル被覆プレート上で典型的な拡張型二次元(2D)腸状単分子層を形成しました。培養されたiMSCは培養フラスコに付着し、免疫染色により血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)や分化クラスター81(CD81)などの間質マーカーを発現させました。全体として、この最適化された分離プロトコルは、同じ子豚の空腸部分から上皮細胞と間質細胞の両方を得ており、腸オルガノイドとiMSC共培養システムを用いて、豚における上皮細胞と間質細胞相互作用を制御するメカニズムを解明する将来の研究の再現性基盤を提供します。これは人間の生理学の再現と動物科学の進歩に関連した翻訳的に重要なモデルです。

Introduction

腸上皮は、腸の恒常性を維持し、粘膜損傷後の再生を促進するために、継続的な自己更新と分化を行う動的な組織です^1,2。腸上皮細胞は腸幹細胞(ISC)に由来し、多様な微^{小環境因子}3,4,5,6,7,8と相互作用します。上皮下区画は主に固有層と粘膜筋層で構成されており、異なる系統の多様な細胞群^{で構成されています。}これらの細胞群の中で、腸介質間質細胞(iMSC)、線維芽細胞や筋原線波芽細胞を含む細胞群は、ISC幹の形成、増殖、分化を調節する栄養因子および成長因子を産生し、上皮の恒常性と再生を調節^します。

これらの細胞相互作用を研究するために、最近の研究では腸上皮細胞とiMSCのクロストークを駆動する作用機序を解明する新しいアプローチが開発されています。オルガノイドと間質細胞や免疫細胞を組み合わせた共培養システムは、発生、再生、薬物スクリーニング、疾患モデルにおける上皮下細胞相互作用の理解を深めました。12,13,14,15,16,17。しかし、ほとんどのオルガノイド共培養研究ではマウス組織が使用されており、これらは人間の生理や疾患表現型を効果的に模倣できず、臨床的トランスレージ関連性を制限しています¹⁸。

ほとんどのマウス腸内分離プロトコルでは、上皮細胞と間質細胞は別々の組織セグメントから得られ、これによりわずかに異なる特徴を示すサンプルが得られ、実験間の再現性に影響を及ぼす^{可能性があります。}現在、同じ組織サンプルから豚の腸内クリプトとiMSCを分離するための標準化された最適化プロトコルは存在しません。さらに、適切なヒト腸サンプルの取得に実用的な制約があるため、多くの研究者は異なる臓器(例えば皮膚線維芽細胞を持つヒト腸内分泌物)の不一致細胞タイプを用いて上皮・間葉系細胞のクロストークを評価することに依存しており、データ解釈を交絡させる^{可能性があります。}

最近発表されたヒト腸生検プロトコルでは、残存した上皮が枯渇した組織から細胞を単離し、線維芽細胞を得ましたが、豚²⁴では同様の標準化されたアプローチが不足しています。豚は解剖学的および生理学的に人間に似ているため、翻訳研究に適した動物モデルとして用いられています 2,18,25,26,27,28,29。したがって、この方法は生理学的、解剖学的、形態学的構造に基づいて同じ豚の空腸セグメントから腸のcryptとiMSCを回収する逐次分離プロトコル^{を提供します。}この手法は、将来の豚腸共培養研究に適したクリプトおよびiMSCを分離するための再現可能な枠組みを提供します。

Protocol

メリーランド大学カレッジパーク校の豚施設に収容されていた21日生子豚の近位空腸から5cmの断片が解剖されました。子豚を生贄にした手順(R-6月22日-30日)は、大学の施設動物ケア・利用委員会が承認した動物ケアおよび利用方針のガイドラインに従って行われました。分離作業に進む前に、プロトコルの概要は 図1に示されており、豚の腸内クリプトおよびiMSCの連続分離に使用される試薬および機器のリストは 材料表に示されています。

1. 分離前準備段階

1. 50 mLの円錐形チューブ内に、5 cmの組織セグメントごとに30 mLの洗浄バッファーを準備します。
2. 採取した組織サンプルの数に応じて体積を調整してください。
   注意:洗浄バッファーの組成については 表1を確認してください 。すべての組織準備および細胞分離工程は、作業台上で行われます。

2. 腸組織準備段階

1. 切除した腸組織を30mLの洗浄バッファーに50mLの円錐形チューブに入れます。
   注意:切除した組織は使用前に1時間ほど冷水洗浄バッファーに入れても構いません。
2. 21Gのシリンジで冷たい洗浄バッファーで3×分の組織を洗浄し、ルミナール成分を除去します。
3. 組織を滅菌された発泡スチロールの表面に置き、腸系膜と脂肪組織を慎重にセロサから除去します。
4. 手術用刃を使って組織を縦方向に切り離し、腔を開けます(図2A)。
5. 部分的に洗浄された解剖組織を新しい洗浄バッファーに移し、バッファーが透明になるまで2回洗浄します。
6. 組織を100mmのペトリ皿の洗浄バッファーに入れ、新しい手術用ブレードで10〜15mmの片状に切ります(図2B,C参照)。この工程により消化バッファーに曝露される表面積が増加します。
7. 挽いた組織を新しい50 mLの円錐形チューブに移します。
8. ウォッシュバッファーで優しく洗い、挽いた組織を重力で約30秒沈降させます(図2D)。
9. 上澄液を優しく吸引し、円錐形チューブ内の組織片を覆うのに十分な緩衝材だけを残します。
10. 上皮解離期
    1. 予熱された上皮解離バッファー30mL(表2)を加え、約9 ×gの静的ビード浴または揺らす水浴で37°Cで20〜30分間培養します。
    2. 15分ごとにチューブを優しく振って、上皮膜からのcryptの解放を促進します。
    3. 組織が沈殿するのを待ち、血清学ピペットで上清液を優しく吸引し、円錐形チューブ内の沈着した組織を覆うだけの緩衝材を残します。
    4. 沈殿した組織に新鮮な洗浄バッファー30mLを加え、激しく振って絨毛、陰部、ゴミを解放します(図3A)。組織残留物を沈殿させた後、懸浮したクリプトセグメントを含む洗浄バッファー上清液を100μmの細胞ストレーナーを通して新しい50mL円錐形チューブに優しくデカントします。
       1. 残存組織に新しい洗浄バッファーを加え、3回(3×)デカントするプロセスを繰り返します。100mmのペトリ皿に10μLの洗浄バッファーをピペットで移し、立体顕微鏡で陰部の密度を調べます。
          注意:洗車後には各洗浄バッファーにクリプト(地下墓地)を保管してください。
    5. 3回目の洗浄後、地下室を含む洗浄バッファーはほとんど残骸が残らない状態でクリアになるはずです(図3B)。
       注意:細胞外マトリックス(ECM)とともに組織残存物は円錐形チューブ内に保管し、その後のiMSC分離処理のために保管してください。
    6. 室温で150× g の離心分離液を2分間、地下室の断片にペレットで送り出します。
    7. クリプトペレットを吸引し、上皮培養培地に再懸濁します。
    8. 再懸濁したクリプトを再び150 ×g で2分間遠心分離し、クリプトの断片ペレットを回収します。
    9. 上皮培養培地を加えてクリプトを再懸垂し、ピペット5×を1,000 μLのピペットチップで使用します。
    10. 約100個の再懸濁されたクリプトを、事前に準備されたコラーゲンタイプ1のハイドロゲルコーティングされた6ウェルプレートに播種し、クリプトを培養・拡張して二次元(2D)の腸内膜単分子層に形成します。
        注意: 表3のコラーゲンハイドロゲル被覆プレート準備を確認してください。最終的なコラーゲン1型濃度は1.0 mg/mLであるべきです。酵母や真菌の汚染を防ぐために、過度に密度の高いクリプトや破片の板を塗りません。洗浄バッファーと培養培地に抗生物質-抗菌剤(anti-anti-anti)を置くと保護効果が期待されます。
    11. 逆位相差顕微鏡で細胞を観察し、加湿された5%_CO2 インキュベーターで37°Cで培養します。
    12. 種まきから12時間以内に培地を交換し、浮遊するゴミを除去し細菌汚染を減らしてください。
    13. 腸内イドは上皮培養培地(表4)で培養し、培地を隔日で交換し、拡張された2D単分子層が4日目≥85%の合流度に達してサブカルチャーを行うまで続けます。
11. 細胞外マトリックス解離段階
    注意:円錐形チューブ内の細胞外マトリックスを含む残った組織断片で分離プロセスを継続してください(図3C および 図4A)。
    注:上皮解離バッファー内のEDTAはコラーゲン酵素活性を抑制しますが、前の3つの洗浄工程ですべてのEDTAとDTTが除去されます。したがって、その後の過程でコラーゲン酵素活性が影響を受けることはありません。
    1. 残った組織を再び小さな塊に刻み、その後固有層のiMSCを分離します。
    2. 細胞外消化バッファー25mL(表5)を組織に加え、37°Cで静的なビーズ浴で15〜20分間培養します(図4B)。
    3. 孵化後は激しく振ってください。
       注意:上清液は濁り、浮遊組織の断片が減ります。上清液の10μLピペットを倒置顕微鏡で照射し、上清液中のiMSCの密度を調べます。観察されたiMSC密度が低い場合は、組織をビードバスでさらに15分間キュベートし続けます。
    4. 上清液を(ステップ2.2.3で激しく振った直後)100μmのセルストレーナーを通して新しい円錐形チューブに優しくデカントし、ゴミを最小限に抑えます。
    5. 細胞懸浮液を室温で280× g で5分間遠心分離し、iMSCをペレット化します。
    6. 上澄液を吸引し、iMSCを間葉培養培地に再懸濁させます( 表6のiMSC培養培地参照)。
    7. 再懸濁したiMSCを再び280× g で5分間遠心分離し、解離バッファーを洗い流します。
    8. iMSCを吸引し、間葉系培養培地で再懸濁します。
    9. iMSCをT75培養フラスコに約5個の5個の⁵ 細胞を1フラスコに刻みます×
       注意:メッキジム細胞は最適な成長のために中程度から高いシーディング密度を必要とするため、プレートされた細胞はフラスコ表面積の約60%を覆うようにしてください。
    10. 培地を盛り上げてから12時間以内に交換し、余分なゴミを除去し細菌汚染を防ぎます。
    11. 種まき後2日目に逆位相差顕微鏡で線維芽細胞様細胞を観察します。
        注意:間葉系培養培地は一日おきに交換してください。iMSCは約85%の合流に達し、4日目までにサブカルチャーの準備が整うはずです。

3. 免疫細胞化学アッセイ

1. 間葉系培地を用いた96ウェルプレートで、1ウェルあたり約5,000個のiMSCを培養し、細胞が約80%の合流に達するまで2〜3日間培養します。
2. 培地を優しく吸引し、培養したiMSCを室温³¹で100μLの1×PBS1ウェルで2回洗い流します。免疫染色キットに関するすべての言及は 材料表に記載されています。
3. 1ウェルあたり4%パラホルマルデヒド(PFA)100μLを加え、培養したiMSCを固定し、室温の静的なベンチトップで30分間培養します。
4. 固定培養されたiMSCを0.1% Tween-20/PBS(PBST)100μLで5分間2回洗浄し、その後0.5%トリトンX-100/PBS100μLで30分間透過します。
5. 1ウェルごとに5%牛血清アルブミン(BSA)/PBSTを100μL添加し、固定細胞への非特異的結合を阻害します。
   注意:室温で1時間置き、その後100μLのPBSTで2回、各5分間洗濯してください。
6. 各ウェルに希釈した一次抗体100 μL(1:250、すなわち1 μLの一次抗体を250 μLの抗体希釈剤に加え、細胞を4°Cで一晩培養します)。 使用される一次抗体はPDGFRαとCD81です。
   注意:一次抗体を除き、希釈された抗体のみを加えてネガティブコントロールウェルを含めること。
7. 2日目には、一次抗体を100μLのPBSTで2回、それぞれ5分間洗い流します。
8. 二次抗体を1×PBSで希釈します。以下の比率でAlexaフルオフルアプラス555(1μL:100μL)、Alexaフルオフルプラス647(1μL:100μL)、DAPI(1μL:800μL)です。
9. 室温で希釈した二次抗体で1時間の対染をします。
10. 細胞を1×PBSで2回、それぞれ5分間洗います。
11. 1ウェルごとに100μLのマウントメディウムを加え、プレートを覆い、アルミホイルで包み、蛍光画像処理まで最大6ヶ月間4°Cで保存します。

4. RNA単離およびqPCRアッセイ

1. 酸性グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム分離技術を用いてT75フラスコで培養したiMSCから総mRNAを抽出します。
   注:RNA濃度と純度は分光光度計を用いて測定してください。
2. 選択されたSus scrofa遺伝子プライマーGAPDH(順位:ATCCTGGGTACACTGAGGAC;逆:AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG)の増幅プロットを検証するためのテンプレートとして、cDNAに全mRNAを逆転写し、qRT-PCRアッセイのテンプレートとして使用します。^これは過去の研究で報告された通り^です。

Results

上皮解離の過程で、エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)はカルシウムイオンをキレート化してカルシウム依存性細胞間接着を破壊し、ジチオスレイトール(DTT)はムシン糖タンパク質内のジスルフィド結合を切断して粘液溶解を促進します。したがって、キレート化合物(EDTA)と還元剤(DTT)を組み合わせて使用することで、細胞外マトリックス(ECM^)構造を破壊することなく、上皮膜からのcryptを効果的に放出^{できます(}図3)。クリプトは上皮層から最小限のECM破壊で解放されました(図3B,C)。腸上皮培地で培養すると、分離された骨はコラーゲン被覆のハイドロゲル表面に付着し、腸状単分子層へと拡大し、培地は隔日で交換されました(図5A)。コラーゲンハイドロゲルは腸内腸内モノレイヤーに不可欠な構造的サポートを提供し、生体...

Discussion

同じ豚の空腸セグメントから腸のcryptとiMSCを分離することは、組織セグメント特異的な細胞および機能的特性を保存する新しいアプローチを提供します。これは重要な点で、腸組織は地域的かつ空間的な同一性を示すためであり、これは^{以前の豚の}研究2,36,37,38で示されています。これまでのオガノイド研究は、あるセグメントから分離されたクリプトと遠隔領域または成長培養からの線維芽細胞に依存し、リスクミスマッチや生理学的に異なる微小環境ニッチに依存し^{ていました。}ここでは、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.50万EDTA	プロメガ	PR-V4231
1 M HEPESバッファ	サーモフィッシャー	15630080	コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用
1000 uLのピペットチップ	アルカリ・サイエンティフィックFT1000	104027-530
10倍PBS	インビトロジェン	AM9624	コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用
1N水酸化ナトリウム	熱力学	SS266-1	コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用
1台のHBSS	サーモフィッシャー	14025092
1X PBS	ハイクローン	SH30256FS
4%パラホルムアルデヒド(PFA)	サーモフィッシャー	AAJ61899AK
50 mL円錐形チューブ	サーモフィッシャー	12-565-271
6ウェル板	フィッシャーブランド	FB012927
7.5%重炭酸ナトリウム溶液	コーニング	MT25035CI	コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用
アドバンスDMEM/F12	Gibco	12634-010
Alexa fluor plus 647	インビトロジェン	A32728	二次抗体
Alexa plus 555 - A32732	インビトロジェン	A32732	二次抗体
アルミホイル	レイノルズ	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
アンチ・アンチ	ギブコ	15240096
B27	サーモフィッシャー	12587010
BSA	フィッシャーブランド	BP1600-100
CD81	プロテインテック	66866-1-ig	一次抗体
細胞培養グレードの水	ハイクローン	SH30529FS	コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用
コラーゲン、タイプ1	コーニング	356236	コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用
コラーゲナーゼIV	ギブコ	17104019
コーニング100mmペトリ皿	コーニング	07-202-011
クライオスターセルの凍結保存培地	幹細胞技術	7930
細胞用クリオバイオル	フィッシャーブランド	1050026
ダコ抗体希釈剤	ダコ/アジレント	部品番号:S302283-2	一次抗体希釈剤
ダコ蛍光器取り付け媒体	ダコ/アジレント	部品番号:S302380-2
ダピ	プロモセル/VWR	10180-470	DNA染色
ディスパースII	ロッシュ	4942078001
DMEM、高血糖	コーニング	MT10013CV
DTT	シグマ	646563
EGF	ペプロテック	315-09
FBS(ハワイ)	アヴァントール	1300-500H
ガストリン	アナスペック	AS-64149
ゲンタミシン	MPバイオメディカル	ICN1676045
グルタマックス	サーモフィッシャー	35050061
ヘペス	サーモフィッシャー	15630-080
逆蛍光マイクロスクロプ	ニコン	エクリプス Ti2	蛍光イメージング
逆位相差顕微鏡	ニコン	エクリプス TS100	培養細胞イメージングおよびnbsp;
iScript Advanced cDNA 合成キット	バイオ・ラッド	1725038	RT-PCRキット
iTaq ユニバーサル SYBR グリーン・スーパーミックス	バイオ・ラッド	1725122	qPCRキット
LWRN条件付きメディア	ATCC	CRL-3276	LWRNのメディアはATCCの手順に従って社内で作成されました
N-アセチルシステイン	議員の略歴	194603
ナノドロップ2000分光光度計	サーモフィッシャー	ND 2000
ニコチナミド	シグマ	N0636-100G
バーコード付き光学384ウェルプレート	応用バイオシステム	4483285	qPCRキット
PDGFRα	アブカム	AB230457	一次抗体
プロスタグランジンE2(PGE2)	ケイマンケミカル	14010
クアントスタジオ5	応用バイオシステム	A28570	qPCR装置
SB202190	LCラボラトリーズ	S-1700
立体顕微鏡	ニコン	SMZ745
T 75フラスコ	フィッシャーブランド	FB012937
トリトンX100	フィッシャーブランド	PI85111
トリゾル試薬	インビトロジェン	15596026
トゥイーン20歳、100%非イオン洗剤	バイオラッド	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200