本研究は、豚の空腸組織から腸内cryptおよび腸間質細胞(iMSCs)を逐次分離するための段階的なプロトコルを提供します。この手法は、腸内恒常性と再生中の細胞クロストークを研究するための再現可能で生理学的に関連性の高い上皮-間質共培養モデルの開発に適した2次元腸内膜モノレイヤーおよびiMSCを生成します。
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この記事について
サマリー
要約
腸上皮は、基礎となる腸介質間質細胞(iMSCs)と密接に相互作用し、発生、恒常性、再生を調節します。しかし、豚の組織から上皮画と間質画の両方を逐次分離する標準化された方法は限られています。このプロトコルは、同じ子豚の空腸セグメントからクリプトとiMSCを分離するための最適化された段階的プロセスを記述しています。この方法は、エチレンジアミネテトラ酢酸/ジチオスレイトール(EDTA/DTT)ベースの解離バッファーを用いてクリプトを放出し、その後細胞外マトリックスのコラーゲナーゼ/ディスパーゼ消化でiMSCを分離します。このアプローチは、分離された細胞内の空間的変動を最小限に抑えます。分離されたクリプトは成功裏に培養され、コラーゲンハイドロゲル被覆プレート上で典型的な拡張型二次元(2D)腸状単分子層を形成しました。培養されたiMSCは培養フラスコに付着し、免疫染色により血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)や分化クラスター81(CD81)などの間質マーカーを発現させました。全体として、この最適化された分離プロトコルは、同じ子豚の空腸部分から上皮細胞と間質細胞の両方を得ており、腸オルガノイドとiMSC共培養システムを用いて、豚における上皮細胞と間質細胞相互作用を制御するメカニズムを解明する将来の研究の再現性基盤を提供します。これは人間の生理学の再現と動物科学の進歩に関連した翻訳的に重要なモデルです。
概要
腸上皮は、腸の恒常性を維持し、粘膜損傷後の再生を促進するために、継続的な自己更新と分化を行う動的な組織です1,2。腸上皮細胞は腸幹細胞(ISC)に由来し、多様な微小環境因子3,4,5,6,7,8と相互作用します。上皮下区画は主に固有層と粘膜筋層で構成されており、異なる系統の多様な細胞群で構成されています。これらの細胞群の中で、腸介質間質細胞(iMSC)、線維芽細胞や筋原線波芽細胞を含む細胞群は、ISC幹の形成、増殖、分化を調節する栄養因子および成長因子を産生し、上皮の恒常性と再生を調節
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プロトコル
メリーランド大学カレッジパーク校の豚施設に収容されていた21日生子豚の近位空腸から5cmの断片が解剖されました。子豚を生贄にした手順(R-6月22日-30日)は、大学の施設動物ケア・利用委員会が承認した動物ケアおよび利用方針のガイドラインに従って行われました。分離作業に進む前に、プロトコルの概要は 図1に示されており、豚の腸内クリプトおよびiMSCの連続分離に使用される試薬および機器のリストは 材料表に示されています。
1. 分離前準備段階
- 50 mLの円錐形チューブ内に、5 cmの組織セグメントごとに30 mLの洗浄バッファーを準備します。
- 採取した組織サンプルの数に応じて体積を調整してください。
注意:洗浄バッファーの組成については 表1を確認してください 。すべての組織準備および細胞分離工程は、作業台上で行われます。
2. 腸組織準備段階
- 切除した腸組織を30mLの洗浄バッファーに50mLの円錐形チューブに入れます。
注意:切除した組織は使用前に1時間ほど冷水洗浄....
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結果
上皮解離の過程で、エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)はカルシウムイオンをキレート化してカルシウム依存性細胞間接着を破壊し、ジチオスレイトール(DTT)はムシン糖タンパク質内のジスルフィド結合を切断して粘液溶解を促進します。したがって、キレート化合物(EDTA)と還元剤(DTT)を組み合わせて使用することで、細胞外マトリックス(ECM)構造を破壊することなく、上皮膜からのcryptを効果的に放出できます(図3)。クリプトは上皮層から最小限のECM破壊で解放されました(図3B,C)。腸上皮培地で培養すると、分離された骨はコラーゲン被覆のハイドロゲル表面に付着し、腸状単分子層へと拡大し、培地は隔日で交換されました(図5A)。コラーゲンハイドロゲルは腸内腸内モノレイヤーに不可欠な構造的サポートを提供し、生体.......
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ディスカッション
同じ豚の空腸セグメントから腸のcryptとiMSCを分離することは、組織セグメント特異的な細胞および機能的特性を保存する新しいアプローチを提供します。これは重要な点で、腸組織は地域的かつ空間的な同一性を示すためであり、これは以前の豚の研究2,36,37,38で示されています。これまでのオガノイド研究は、あるセグメントから分離されたクリプトと遠隔領域または成長培養からの線維芽細胞に依存し、リスクミスマッチや生理学的に異なる微小環境ニッチに依存していました。ここでは、.......
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開示事項
著者たちは何も明かすことはありません。
謝辞
著者らは、アメリカ合衆国メリーランド大学カレッジパーク校のMAES競争助成プログラムからの財政支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.50万EDTA | プロメガ | PR-V4231 | |
| 1 M HEPESバッファ | サーモフィッシャー | 15630080 | コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用 |
| 1000 uLのピペットチップ | アルカリ・サイエンティフィックFT1000 | 104027-530 | |
| 10倍PBS | インビトロジェン | AM9624 | コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用 |
| 1N水酸化ナトリウム | 熱力学 | SS266-1 | コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用 |
| 1台のHBSS | サーモフィッシャー | 14025092 | |
| 1X PBS | ハイクローン | SH30256FS | |
| 4%パラホルムアルデヒド(PFA) | サーモフィッシャー | AAJ61899AK | |
| 50 mL円錐形チューブ | サーモフィッシャー | 12-565-271 | |
| 6ウェル板 | フィッシャーブランド | FB012927 | |
| 7.5%重炭酸ナトリウム溶液 | コーニング | MT25035CI | コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用 |
| アドバンスDMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa fluor plus 647 | インビトロジェン | A32728 | 二次抗体 |
| Alexa plus 555 - A32732 | インビトロジェン | A32732 | 二次抗体 |
| アルミホイル | レイノルズ | https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1 | |
| アンチ・アンチ | ギブコ | 15240096 | |
| B27 | サーモフィッシャー | 12587010 | |
| BSA | フィッシャーブランド | BP1600-100 | |
| CD81 | プロテインテック | 66866-1-ig | 一次抗体 |
| 細胞培養グレードの水 | ハイクローン | SH30529FS | コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用 |
| コラーゲン、タイプ1 | コーニング | 356236 | コラーゲンハイドロゲルプレートの準備用 |
| コラーゲナーゼIV | ギブコ | 17104019 | |
| コーニング100mmペトリ皿 | コーニング | 07-202-011 | |
| クライオスターセルの凍結保存培地 | 幹細胞技術 | 7930 | |
| 細胞用クリオバイオル | フィッシャーブランド | 1050026 | |
| ダコ抗体希釈剤 | ダコ/アジレント | 部品番号:S302283-2 | 一次抗体希釈剤 |
| ダコ蛍光器取り付け媒体 | ダコ/アジレント | 部品番号:S302380-2 | |
| ダピ | プロモセル/VWR | 10180-470 | DNA染色 |
| ディスパースII | ロッシュ | 4942078001 | |
| DMEM、高血糖 | コーニング | MT10013CV | |
| DTT | シグマ | 646563 | |
| EGF | ペプロテック | 315-09 | |
| FBS(ハワイ) | アヴァントール | 1300-500H | |
| ガストリン | アナスペック | AS-64149 | |
| ゲンタミシン | MPバイオメディカル | ICN1676045 | |
| グルタマックス | サーモフィッシャー | 35050061 | |
| ヘペス | サーモフィッシャー | 15630-080 | |
| 逆蛍光マイクロスクロプ | ニコン | エクリプス Ti2 | 蛍光イメージング |
| 逆位相差顕微鏡 | ニコン | エクリプス TS100 | 培養細胞イメージングおよびnbsp; |
| iScript Advanced cDNA 合成キット | バイオ・ラッド | 1725038 | RT-PCRキット |
| iTaq ユニバーサル SYBR グリーン・スーパーミックス | バイオ・ラッド | 1725122 | qPCRキット |
| LWRN条件付きメディア | ATCC | CRL-3276 | LWRNのメディアはATCCの手順に従って社内で作成されました |
| N-アセチルシステイン | 議員の略歴 | 194603 | |
| ナノドロップ2000分光光度計 | サーモフィッシャー | ND 2000 | |
| ニコチナミド | シグマ | N0636-100G | |
| バーコード付き光学384ウェルプレート | 応用バイオシステム | 4483285 | qPCRキット |
| PDGFRα | アブカム | AB230457 | 一次抗体 |
| プロスタグランジンE2(PGE2) | ケイマンケミカル | 14010 | |
| クアントスタジオ5 | 応用バイオシステム | A28570 | qPCR装置 |
| SB202190 | LCラボラトリーズ | S-1700 | |
| 立体顕微鏡 | ニコン | SMZ745 | |
| T 75フラスコ | フィッシャーブランド | FB012937 | |
| トリトンX100 | フィッシャーブランド | PI85111 | |
| トリゾル試薬 | インビトロジェン | 15596026 | |
| トゥイーン20歳、100%非イオン洗剤 | バイオラッド | 1706531 | |
| Y27632 | ApexBio | A3008-200 |
参考文献
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
- Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr....
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