異なる哺乳類の脳における定量的細胞計数研究の比較アプローチ

サマリー

現代の神経科学は、実験室の齧歯類や人間を含む多くの種の違いを探る必要があります。しかし、大きな脳を持つ哺乳類が関わると技術的な困難が生じます。このアプローチは、非常に異なる哺乳類における神経細胞集団の種間変異に対応し、進化的パターンを明らかにするための類似結果を生み出します。

要約

ほとんどの神経生物学的研究は実験室の齧歯類を対象に行われています。哺乳類の脳には多くの類似点がありますが、重要な違いも存在し、翻訳時に誤解を招くことがあります。特に神経新生において、脳の可塑性において顕著な異種間の違いが見られます。進化的なトレードオフにより、異なる神経発生過程が存在し、脳構造や哺乳類間で変異を示し、マウスや人間のような異なる種における可塑性の可能性が変化します。大きく異なる種を比較することは複数の問題を生じさせます。比較研究では大型脳が関わる場合に技術的な困難が生じます。異なる研究室による異種な実験手法の使用は、結果の比較を制限することがあります。異質性は哺乳類間で神経発達過程の異なる時間経過に関連しており、比較に変数を加えることがあります。

これらの制約に対処するため、脳の大きさ、回脳、社会生態学的ニッチ、年齢などで大きく異なる哺乳類の層II皮質未成熟ニューロン集団の種間変異を研究するアプローチが確立されました。完全に標準化できない変数もありますが、脳の収集における異質性の低減と、共通の解剖学的構造を基準点として確立し、対応する脳レベルで細胞計数を行う方法が提案されています。得られたデータ(例:細胞密度)は系統樹にマッピングされ、進化パターンを明らかにし、神経解剖学的特徴(例:脳の大きさ、皮質表面積)との共分散性を分析できます。このアプローチは、系統群間で皮質未成熟ニューロンの数に顕著な変異があることを示し、脳の大きさとの共変異が明らかになりました。この方法は、同一種の異なる発達段階の違いを定量化するためにも用いられ、他の多様な哺乳類や生物学的過程にも拡張され、成体脳の異なる細胞集団をより正確に定量化し、可塑性を支える類似の結果をマッピングできます。

概要

神経科学の研究は主に近親交配マウスやラットを用いて、その結果を人間に翻訳しています。分子、細胞、さらには解剖学的な多くの類似点があるにもかかわらず、重要な種間の違いも存在し、前^{臨床データの解釈}に誤解を招く^{ことがあります。}比較研究は必要ですが、大型脳が関与する場合(例:マウスの平均0.5gから人間の1300g、図1A)。さらに、異なる研究室による異質な実験手法は、特に定量的分析において結果の比較を制限し、時に論争を生むことがあります。これは脳構造可塑性の場合であり、特に神経新^生過程に言及^し、発達神経可塑性と^脳修復の理解に関心のあるテーマ^です。

脳可塑性の分野での最近の発見は、進化の過程で異なる種類の神経原^{性プロセスの}発生、発生率、解剖学的位置に実質的な違いが現れたことを強く示唆しています8。例として、大脳哺乳類の幹細胞駆動神経新生が実験室齧歯類に比べて顕著に減少していることが挙げられます。^これは、生態学的圧力への適応として脳領域や機能の拡大が異なることに関連していると考えられます。^7,8、また神経発達の時間経過も異なる^11,12です。.神経新生の速度はマウスと人間で著しく異なるようであり、翻訳¹³の問題を提起しています。

一方で、成熟が停止したニューロン(いわゆる未成熟または休眠ニューロン14,15,16,17,18,19)によって表される新しい「分裂なしの神経新生」は、小脳から大脳種へ増加すると仮説されています ^20,21.興味深いことに、未成熟ニューロンの幹細胞非依存集団は大脳皮質(回脳回種^22,23における高次認知の部位)に宿されており、主に嗅覚や空間移動に関連する標準的な神経生成部位からは遠く離れています。これらはリス脳類で重要な位置を保持しています ^7,8.脳構造や哺乳類種間の違いは単なる比較対象を超え、マウスや人間の可塑性の可能性をシフトさせることで翻訳に関連性を持つ可能性があります。これらの理由から、「比較可能な方法」で、これらの差が、特に実験室の齧歯類や霊長類を対象に、異なる哺乳類間でどの程度系統発生的変異を示しているかを評価することが重要です。

脳の大きさ、回回、社会生態学的^ニッチ22,24,25が大きく異なる哺乳類の層II皮質未成熟ニューロン集団の種間変異を研究するために最近確立されたアプローチが記載されています。この方法は三つの原則に基づいています。i) 複数の(多様な)哺乳類種を同じ手順で並行して処理すること;ii) 異なる脳で完全に標準化できない変数(固定手順、死後間隔、年齢)を最小限に抑え、免疫細胞化学における抗体の種特異性を研究対象の細胞群の広く共有する特徴を内部の陽性対照として用いること;iii) 異なる種の対応する脳レベルに対する細胞カウントを行う基準点として対応する解剖学的構造を確立すること(図1Bおよび図2)。確立されたマーカーであるダブルコルチン(DCX 15,17,26)と同定された細胞を数えて得られるデータ(例:細胞密度)は、系統樹にマッピングして進化パターンを明らかにし、脳の大きさ、回、皮質表面積などの異なるパラメータとの共分散性を解析できます。

図1:皮質マントルにおけるcINの分布と量を評価するために、非常に異なる哺乳類の脳を処理する。(A) 異なる種や目に属する哺乳類は、脳の大きさや回および皮質拡大の度合いが大きく異なることが特徴である。脳アイコンはBioRenderライセンスで再現されています。(B) 代表的なトルイジン青色染色冠状切片は、大きさや皮質マントルの伸びが大きく異なる脳から切り取られたもの。組織学的に染色された連続断片(クライオスタットカット、冠状、厚さ40μm)が、各動物種の主な神経解剖学的構造を特定するために用いられます(図3参照)。脳の大きさと皮質周囲の顕著な違いに注目してください。パネルAの動物の図像は、La Rosaらの許可を得て再現^{されています。}この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

最後に、すべての形成過程は一般的に年齢が増加するにつれて進行的還元を経験するため^、比較神経可塑性のもう一つの課題は、そのような減少の異なる時間経過を評価することです。これは哺乳類の神経発達過程の異なる時間経過に関連している可能性があります 12,29,30.実際、成長の速い種(マウス)と成熟の遅い種(霊長類)の存在は、最も一般的なモデルシステムである実験用マウスが生物医学の課題解決に限界があるもう一つの理由です。ここで説明した方法は、各種の寿命にわたる異なる年齢の細胞集団を考慮し、その結果として種間で得られる傾向を比較するのにも有用です。cIN密度の系統発生的変異や、その持続性の違いは、小脳哺乳類と大脳哺乳類間で見られました^22,28。

プロトコル

すべての動物処置は関連する国および機関の規則に準拠していました。マウス組織はイタリアのオルバッサーノにある神経科学研究所カヴァリエリ・オットレンギ(NICO)から、イタリア保健省(RRID: MGI:3696370)の許可のもと、セリーナ・ボヴェッティとチャールズリバー研究所の協力により入手されました。裸のモグララット組織は、1986年の動物(科学的手続き)法スケジュール1に基づき、安楽死直後にロンドンのクイーンメアリー大学(ロンドン大学)で採取されました。ウサギ実験は欧州共同体理事会指令86/609/EUおよびイタリア法(DL.vo 116/92)に従い、イタリア保健省の承認(認可番号66/99-A)を行いました。羊と馬の脳は、指令86/609/EECのもと、商業屠殺場から死後採取され、継続的な獣医監督のもとで行われました。犬の脳は、フランス・リヨンのMarshallBio研究所から必要な承認付きで死後に供給されました。猫の脳は、飼い主の同意のもと、パドヴァ大学で定期的な診断解剖の際に死後に採取されました。すべての手続きはEUおよびイタリアの法律に従って行われました。チンパンジーのサンプルは、国際医療機関評議会(CIOMS)の国際指針および国立衛生研究所(NIH-OLAW)の動物福祉実験室許可A5761-01(各動物種および実験の詳細は補足表1および参考文献^22,25)に基づいて処理されました。

1. 脳みその収集

1. 脳は直接採取するか、他の機関や組織バンクから採取してください。ただし、半球全体のみを考慮してください。動物種から脳を抽出する最良の手順を機関と共に確立し、半球への損傷を減らし、死後最小の死後間隔(PMI、下記注参照)と抽出後の固定液への迅速な浸漬を確保します。
   注意:対象抗体の感度に応じて、PMIに注意してください。ダブルコルチン(DCX)の分解に対する高い感度を考慮し、PMI範囲が0〜1時間のサンプルを採取してください(チンパンジーを除く最大14時間PMIを持ちますが、染色の品質に変化はありませんでした。 補足表1)。
2. 動物の寿命の多様性が高いため、研究対象となる異なる哺乳類の年齢グループを事前に決定し、比較可能なデータを得ましょう。
   1. この研究の設計と比較年齢層の設定のために、動物の歴史と多様性に関する2つのデータベースから情報を分析します。AnAgeは動物の老化と生活史を厳選したデータベースで、Animal Diversity Webは動物の自然史、分布、分類、保全生物学のオンラインデータベースです。
   2. 動物の寿命を4つの段階(1つは思春期前、3つは思春期後、すなわち「成獣」)に分けます。これはアメリカ獣医師会(AVMA)が犬の³¹のライフステージを分類したものから始まります。そこでは、寿命は子犬、ジュニア、成犬、成熟、シニア、老年6つの6つのステージに分けられています。
   3. 高齢期と高齢期、成人期と成熟期を圧縮することで、以下の用語を適用します:思春期前、若年成人、中年、そして²²歳の高齢者。

2. 脳組織の固定と処理

注:固定手順は脳の大きさや一部の動物種に関する倫理的配慮によって異なる場合があります(多くの大脳霊長類や馬は灌流ができず、抽出後に固定液に浸して固定する必要があります)。

1. 脳を完全に固定液(推奨4%パラホルマルデヒドまたは10%ホルマリン)に浸してください。
   注:固定の時間は脳の大きさによって異なります(例:犬の脳は3週間、馬の脳は3か月、 補足表1)。目的の抗原の完全性を維持するために、固定液の時間が短くも過剰にもならないようにしてください。
2. 定規(まっすぐ切るため)と刺しナイフを使って、希望する脳半球を均等に切る(厚さ1〜1.5cm)。
3. 脳のスライスをリン酸塩緩衝剤(PB)0.1 M(28.49 gのリン酸ナトリウムと7.8 gのリン酸ナトリウム一塩基を蒸留水に溶かし、pH 7.4)に浸し、シェイカーで24時間優しく攪拌します。必要に応じて(下記の注釈参照)、溶液を廃棄し、翌日にPB 0.1 M、pH 7.4の新しい溶液に置き換えます。
   注:PB 0.1 Mの洗浄量と回数は脳の大きさによって異なります(例:マウス脳は30分、馬の脳は3日)。脳がPB 0.1Mに完全に浸透し、ホルマリンや血液、組織の老廃物が洗い止めないようにしてください。
4. スライスを、PB 0.1 M、pH 7.4の徐々濃度(10%、20%、最大30%)のショ糖溶液に浸してクライオプロテクションし、シェイカーで優しく攪拌します。
   注:ショ糖溶液の量は脳の大きさによって異なります。脳がショ糖溶液に完全に浸かり、完全に沈み込む前にショ糖濃度を上げることを必ず確認してください。

3. 半球全体のクライオスタット切断

1. 切断時の問題を避けるために、脳のスライスから曲がったピンセットで髄膜を除去してください。
2. スライスを最適切断温度(OCT)化合物で満たした埋め込み型に入れます。スライスが埋め込み型に満たない場合は、ブレインスライスより少し大きめのパラフィルムの四角い断片を切り取り、中央にOCT媒体を加え、そのスライスをOCTの上に置きます。
3. スライスを液体窒素で冷却したイソペンタン300mLに-50°Cで浸して凍結し、OCT培地が完全に白色になるまで加熱します。脳のスライスは、切片までの長期保存のために-80°Cで保管することができます。
4. 切片前には、脳を-20°Cの温度で少なくとも5時間スライスし、組織がゆっくりと均一にクリオスタットと同じ温度に達するのを待つ。
5. スライスを40μm厚の連続コロナ断片に切断し、クライオスタットで室内温度範囲を-20°Cから-25°Cに保ちます。
6. 浮遊切片を12ウェルプレートに採取し、低温保護液(グリセロール150 mL、エチレングリコール150 mL、蒸留水150 mL、Fバッファー50 mL(1.682 gのリン酸ナトリウム一塩基二水和物、0.385 gの水酸化ナトリウムを蒸留水に溶けてpH 7.4)で-20°Cで保存します(1 mL/ウェル、大きな脳の場合は切片全体を覆う以上)で染色します。
   注:脳の大きさによって半球全体の断片は異なります。より大きな脳(例:チンパンジーや馬)は、クライオスタットで処理するために背側と腹側の2つの等しいブロックに分ける必要があります。この場合、浮遊区画は2つの6ウェルプレートに集めることができます。別の方法としては、スライド式マイクロトームで大脳種の半球を切断する方法があり、これによりより大きなサイズのブロックが可能になります。

図2:同じ手順で標準化できない変数を扱う、非常に異なる脳を処理。 上記の方法では、標準化可能なすべての手技が同じ方法で行われます(一般的な固定、全半球で同じ厚さの連続冠状切片の切断、一般的な免疫細胞化学的手技、細胞計数)。BioRender(https://app.biorender.com/)で作成されたフィギュア。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 組織学的着色

1. 連続検死切開(12個中1個)を選びましょう。この間隔を得るには、12ウェル板から1つのウェルのすべてのセクションを選びます。これらを使って半球全体の完全な表現を得るとともに、研究対象の異なる種間で脳レベルの冠状切片を選択する基準として活用してください(第5節参照)。1%のゼラチン化スライドに取り付けます。数時間乾かします。
2. 以下の溶液(150 mL/溶液)を準備します:エタノール50%、70%、96%、100%、キシロール、トルイジンブルー。
3. 染色手順:スライドをエタノール濃度(50%-100%)に増やし、50%-70%でそれぞれ1分、96%-100%で2分ずつ、その後キシロール溶液に1分間移します。
4. スライドを逆の順に置きます:キシロール溶液を1分間浸し、その後エタノール溶液の濃度を徐々に下げていきます(100%-50%)、それぞれ100%-96%で2分ずつ、70%-50%でそれぞれ1分ずつ。
5. スライドを蒸留水素_150mL(2分)に入れます。
6. スライドをトルイジンブルー染色液に5〜10分浸します。この工程の後、染色された部分は濃い青色になります。
   注意:組織学的染色の溶液に保存される時間区分は、種によって異なる場合があります。対象種の脳の断片を検査し、最適な染色プロトコルを設定しましょう。
7. スライドを蒸留水_20度150mLで1分間すすぎます。
8. 分離工程を進め、スライドをエタノール濃度(70%-100%)に70%で1分間、96%-100%でそれぞれ2分間置き、その後キシロール溶液に1分30秒移します。これらの工程では、区画は濃い青から空色に変わります。
9. カバーが滑る前に最後のキシロールの工程から部分がまだ湿っているか確認してください(乾燥したらキシロール溶液で5秒ほどすすいでください)。その後、スライドを数日間乾かします。

5. 脳レベル選択と免疫組織化学的染色

1. 第4節で得られた組織学的に染色された断片を参考に、特定の神経解剖学的特徴に基づく脳レベルを特定します:レベル1(L1)は外側心室の前方開口部からL2まで;レベル2(L2)- 内包の前方開始からL3へ;レベル3(L3)- 扁桃体の前方起点からL4まで;レベル4(L4) - 側心室の後方閉鎖からL2に相当する延長(同じ数の厚さ40μmの連続断片; 図3)。
   注:上記の神経解剖学的参考文献は、大きく異なる大きさや回脳に属する脳皮質の比較を可能にすることを目的としています。関心のある脳領域によって、参照として使われる解剖学的特徴は変わることがあります。
2. 各脳レベルから均等間隔の冠状切片を3つ選びます。
   注:次のステップで使用される各バッファーの体積は脳の大きさによって異なります(例:マウス切片は0.5 mL/ウェル、馬切片は1.5 mL/ウェル)。浮遊区間は各バッファーで完全に覆われていることを確認してください。
3. PBS 0.01 M、pH 7.4で3回、各5分間洗浄します。
4. 内因性ペルオキシダーゼ遮断液(0.6% H₂O₂、1% Triton X-100、0.01 M PBS、pH 7.4、20分)で切片を培養するか、クエン酸(10 mM クエン酸を蒸留水に0.05% Tween 20、pH 6.0を補充)を用いて抗原回収を行い、90°Cで5分間行います。
   注:固定手順や時間、目的の抗原によっては、最適な染色を得るために抗原回収が必要になる場合があります(緩衝材、温度、pH、培養期間は対象抗原によって異なる場合があります)。
5. 再びPBS 0.01 M、pH 7.4で洗浄区間を3回×5分洗い。
6. ブロッキング溶液(1-5%牛血清アルブミン(BSA)、正常血清、1-1.5%トリトンX-100、0.01 M PBS、pH 7.4、RTで90分)でインキュベート切片。
7. 一次抗体溶液(1-5% BSA、2-3% 正常血清、1-1.5% Triton X-100、一次抗体を0.01 M PBS、pH 7.4、4 °Cで48時間、優しくかき混ぜて)で切片を培養します。
   注:対象抗原に対する抗体は、異なる脳領域や種によって染色の質に異なる結果をもたらす^{可能性があります。}異なるメーカーの抗体セットを比較し、研究対象となる異なる種に最適なツールを選択する必要があります(サンプル間のばらつきを減らすため)。
8. ステップ5.3で説明した洗浄手順を繰り返します。
9. 二次ビオチニル化抗体溶液(1-5% BSA、2-3% 正常血清、1-1.5% Triton X-100、0.01 M PBS、pH 7.4、RT 2時間の二次ビオチニル化抗体)で切片をインキュベートします。
   注:アビディン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体法はニューロルシダの細胞計数に用いられています(第6節参照)。これは密度が高く持続する沈殿物を提供し、数え時に切片厚を通して焦点を合わせることを可能にします。免疫蛍光および共焦点分析は、細胞のさらなる特性評価のために二重または三重免疫染色を行うためにも用いられます(プロトコルについては参考文献22,25,32を参照)。
10. 利用可能なキットを使ってアビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体を調製します。
    注意:使用の少なくとも1時間前に、Tris-HCl 0.05 M、pH 7.5(複合体形成に安定したpHを提供する)でアビディン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体溶液を準備し、複合体形成を許可してください。
11. PBS 0.01 M、pH 7.4で2回(5分洗車2回)、Tris-HCl 0.05 M、pH 7.5(5分)で1回洗浄切断。
    注:アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体はTris-HCl 0.05Mで溶液中にあるため、Tris-HCl 0.05Mで洗浄することで組織が溶液に慣れることが可能になります。
12. アビディン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体で切片を培養(RTで1時間)。
13. トリス-HCl 0.05 M、pH 7.5(3回×5分の洗い)で洗浄切面。
14. フルームフード下で、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)染色溶液(H₂O₂、DAB 3-HCl 0.05 M、pH 7.5)で切片を培養し、最適な染色が得られるまで行います。この工程では、セクションが透明から茶色/バーガンディ赤へと変化します。
    注:最適な染色を得るまでの時間は分析対象の種によって異なります(例:DCXではマウス切片2〜5分、馬切片は20〜30分)。染色の過剰を防ぐために、2分ごとに染色している箇所をチェックしましょう。
15. PBS 0.01 M、pH 7.4(3回×5分の洗い)で洗浄セクション。
16. スライドにセクションを取り付け、乾いたら、マウントメディウムを使ったカバースリップで覆い、数日間スライドを乾かします。

図3:大脳皮質における未成熟ニューロンの分布と量の研究のための神経解剖学的脳レベル確立。 対応する4つの神経解剖学的構造(外側心室前部開始[レベル1、L1];内被膜前部開始[L2];扁桃体前部開始[L3]);側心室の後閉[L4];赤い円で示される)は、検討されたすべての哺乳類において、前後に4つの対応する「脳レベル」を確立し、大脳皮質内のcIN数を「比較可能な」方法で研究すると考えられました。(A)実験室の齧歯類(マウス、左)と霊長類(チンパンジー、右)の例を示します。各脳レベルから3つの冠状切片(合計12区画、赤い矢印)が、各冠冠切片の第II層全体の細胞カウントに考慮されます(注:すべての切片には新皮質が含まれていますが、古皮質を含むのは一部のみ)。このアプローチは、大きさが大きく異なる脳の対応する神経解剖学的レベルで解析を行うことを目指しています。(B)異なる哺乳類種の組織学的に染色された断片における第一レベル(L1)の識別例を示します。BioRenderで作成された脳と動物のアイコン。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. 細胞計数

1. ワークステーションでNeurolucidaソフトウェアを開き、細胞計数用の選定した対物レンズとともにスライドを顕微鏡の下に置きます。
   注:DCX+細胞計数には20x対比レンズを使用しました。
2. 低倍率(例:4倍)で、ソフトウェアのトレースメニューにあるフリーハンド輪郭線ツールを使って皮質層IIの輪郭を描き、古皮質と新皮質の両方の長さ周長を取得します。
3. 画面左側にある マーカーツールバーでセルカウント用の希望記号を選択します。この分析では、各関心領域(古皮質、新皮質)で、それぞれの形態(成熟状態が異なるタイプ1、ソーマが小さく双極性、ソーマ直径3〜9μm)、タイプ2がソーマが大きく複雑な樹状樹状構造、ソーマ直径が9〜18μmの範囲)に応じて、それぞれ異なる細胞を差別的に数えます。
   注:この分析では、マーカーツール バーで各領域ごとに異なる2種類のシンボル/セルタイプを選択します。ソーマの直径を異なる範囲に分けることは、明確な形態がない場合、成熟の中間段階にある可能性のある細胞を綿密に分類するために非常に重要です。過剰計算を避けるため、断面の上面で切断されたセルは解析から除外されます。
4. 系統解析のためのデータは、古皮質、新皮質、大脳皮質(後者は古皮質および新皮質のデータを加えて得られる)の3つの異なる領域から収集します。
5. スプレッドシートファイルに皮質層2周長(mm)を収集し、これはソフトウェア内の 輪郭測定 ツールバーで確認できます。
6. 同じスプレッドシート上で、1型および2型細胞の数( マーカーツールバーに表示)および各脳領域および脳レベル(3セクション/レベル、合計12セクション/標本)の細胞数(タイプ1とタイプ2細胞を合計して得られる)を集めます。
7. これらのデータを用いて、各領域の各セクションで線形セル密度(セル数/mm)およびタイプ1およびタイプ2セルの割合(タイプ1/タイプ2セル数をセル数で割り、100を掛けたもの)を取得します。
8. 考慮した12のセクション/試料の密度中央値値を(スプレッドシートの 中央値 関数を用いて)計算し、線形セル密度を図式的に表します。中央値を中心指標として用いてください。なぜなら、グループごとのサンプル数は比較的小さく(1群あたり4頭)、また一部のグループは非対称分布を示すからです(中央値は極端な数値の影響を受けにくい)。
9. 各標本のタイプ1および2細胞の割合(上記の式を用いて)計算し、検討した4つの標本/種間の平均値を(スプレッドシートの 平均 関数を用いて)求めます。その後、線形細胞密度を用いて系統解析を行い(第7節参照)、各冠状切片でカウントされた細胞数を用いて未成熟ニューロン/半球の総数を推定します。
10. Neurolucida Softwareの Freehand 輪郭ツールを使って、主軸に垂直なソーマ直径の線を描いてください。このステップを踏まえ、各種でランダムに選ばれたDCX陽性(DCX+)細胞(各脳領域に25個/標本)をランダムに選ばれた100個以上の直径長を計算し、タイプ1およびタイプ2細胞のソーマ直径範囲を得ます。

7. 系統解析:系統樹生成

1. 分析した種のリストをNotepadで学名で作成し、サイト https://timetree.org/ にアップロードしてください。
   注:科学名は以下のサイトで確認できます:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
2. 取得した木のファイルを「 to Newick file 」ボタンをクリックしてエクスポートしてください。

8. 系統解析:系統樹におけるデータ統合のカウント

1. データシートの別欄で、解析対象のすべての種と対応するデータを記載します(この場合:全皮質のDCX+細胞密度、新皮質のDCX+細胞密度、古皮質のDCX+細胞密度)。種ごとに複数の個体が存在する場合は、選択したパラメータの中央値密度の平均を計算します。
2. メスキート・プロジェクトソフトウェア(https://www.mesquiteproject.org/)をダウンロードして、系統樹と計数データを統合してください。
   注意:このソフトウェアは、すでにコンピュータ上にJavaが存在する必要があります。
3. Timetreeが以前保存したNewickファイルを「 Open File」をクリックして開いてください。次に、 Simple Newick/Phylip Treefile オプションを選択します。ファイルをテキストとして扱い、「.nex」として保存してください。
4. 新しいページで「 Taxa&Trees 」を選択し、「 新しい3つのウィンドウ」を選択し、「 Sourceから樹木を使います」を選択します。ポップアップウィンドウで 「保存されたツリー」を選択し、 OKボタンを押してください。「 インポートされた木」 という新しいタブが表示されます。
5. 表示セクションで系統樹(例:フォント、サイズ、枝の長さに比例した)をグラフィカルに変更してください。
6. メスキートに新しいタブを追加し、「 追加 」を選択し、その後 「新しい文字行列 」を選択し、文字数を選択します(本研究では「数=3」で、これは3つのDCX+セル密度に対応します)。文字は 連続データとして扱いましょう。
   注:キャラクターは系統樹と相関するデータを表します。
7. この新しく作成されたタブに、系統樹(パート6.4)と相関するデータをコピーして保存します。
8. インポートされたツリータブで「Analysis: Tree」と「Trace Character History」を選択して簡潔な祖先統計分析を行います。
9. セーブファイルをPDFとして保存してください。

9. 系統解析:脳の大きさとDCX+細胞密度の相関

1. 以前作成したデータシートに、各種の脳サイズを記載した列を追加してください。
2. DCX+細胞密度と脳サイズの自然対数を計算します。
3. 推奨する統計ソフトウェアパッケージ(https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html)を起動し、単純な線形回帰を実行します
4. 結果ファイルをダウンロードし、残差をデータシートの新しい列として保存してください。
   注意:残差は回帰直線からのデータポイントのずれを表します。
5. データシートで残差列と種名を含む列を選択します。次に、 挿入 画面に行き、残差をグラフィックで表示するヒストグラムグラフを選択します。

10. 系統解析:新皮質拡張と新皮質DCX+細胞密度相関

1. 以前作成したデータシートに、各種の新皮質層II表面積データを含む列を追加し、自然対数を計算します。
2. 統計ソフトウェアでは、対数新皮質層II表面積をX変数、対数新皮質DCX+細胞密度をY変数として用いて単純な線形回帰を行います。
3. 取得したファイルをダウンロードし、残差をデータシートの新しい列に保存し、ステップ9.5のように残差グラフを作成できます。

結果

研究対象となったすべての種の大脳皮質のDCX+細胞は、未分化ニューロンの良好に保存された集団の存在を示す一連の特徴を一貫して共有しています(図4A)。簡単に言えば、(i) 皮質層IIに沿って単層を形成するように地形的に配置されている;(ii) 未成熟ニューロンの異なる成熟段階で記述された形態的サブタイプを示すこと、(a) 小型の単極・双極細胞が多く存在し、錐体ニューロンを思わせる複雑な樹状突起を持つ細胞も少数存在、(b) ほとんどが未成熟のPSA-NCAMおよびDCXマーカーを共発現しつつ、細胞分裂に関連するKi67抗原を共発現しないものの、 (c) 大きく複雑な細胞のサブポピュレーションもNeuNを発現しており、成熟が始まったことを示しています^22,25。

これらの共通の特徴に加え、ここで説明した方法で線密度を定量した際、サンプル中の種間で桁違いが1桁に達し、顕著な変動が見られました(

ディスカッション

ここで説明した方法は、脳の大きさや神経解剖学的に大きく異なる多様な種を考慮すると、比較可能な定量的データを提供します。多様な哺乳類の脳全体の細胞集団の一貫性を評価するだけでなく、出生後から老化までの段階における単一種の発達を追跡するためにも利用できます。これは、比較的多くの脳(全半球)や種が関与し、同じ検査室でサンプリングと固定の品質基準に従って処理され、同じ手順³³ (図1および2)で分析されるという前提から始まります。

プロトコルの重要なステップは、脳の大きさや倫理的・実務的理由(例:保護された哺乳類種で許可されていない手順)により完全に標準化できない変数で構成されます。最も一般的なのは死後間隔(PMI)と組織固定で、これらに対しては類似している(ただし同一ではない)条件に達することがあります。私たちの経験では、PMIを1時間未満(例:羊や馬)または15時間(チンパンジー)に保つこと、浸漬による適切な時間...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10%ホルマリン	シグマ・オルドリッチ	HT501128
2-メチルブタン	シグマ・オルドリッチ	320404	イソペンタン
3,3′-ジアミノベンジジンテトラ塩酸塩水和物	シグマ・オルドリッチ	D5637
4% パラホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	441244
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A9647
クエン酸など;	シグマ	C0759
組織学用DPXマウント	シグマ・オルドリッチ	06522
エタノール	メルク	1.00983
エチレングリコール	シグマ・オルドリッチ	102466
グリセロール	シグマ・オルドリッチ	G7893
過酸化水素溶液	シグマ・オルドリッチ	H1009
キリク - O.C.T. コンパウンド	バイオオプティカ	05-9801
メスキートソフトウェア	メスキート・プロジェクト	メスキートバージョン3.81(ビルド955)
ネオマウント	シグマ・オルドリッチ	1.09016
リン酸塩緩衝(PB)	な	な	特注品
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	な	な	特注品
水酸化ナトリウム	リーデル・デ・ハーン	6213
リン酸ナトリウム二乾性二水和物	シグマ・オルドリッチ	71645
リン酸ナトリウム単塩基二水和物	シグマ・オルドリッチ	71500
ショ糖	シグマ・オルドリッチ	S9378
トルイジンブルー	シグマ・オルドリッチ	89640
トリトン X-100	シグマ・オルドリッチ	T8787
トゥイーン20	シグマ・オルドリッチ	P9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRPキット ペルオキシダーゼ(標準)	ベクター研究所	PK-6100
キシロール	シグマ・オルドリッチ	247642