方法論記事

造影超音波およびせん断波エラストグラフィーを用いた乳がんバイオマーカーの評価

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DOI：

10.3791/69452

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2026年6月23日

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1Department of Ultrasound, The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 2Department of General Surgery, The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、造影剤強化超音波とせん断波エラストグラフィーを組み合わせて、乳がん患者におけるKi-67、HER2、ERなどの生物学的予後因子を評価することを示しています。

要約

このプロトコルの目的は、せん断波エラストグラフィー(SWE)と造影超音波(CEUS)から導出される定量的パラメータと乳がんにおける生物学的予後マーカーとの関係を評価することでした。この研究には乳がん患者68名と健康な対照群68名が含まれていました。全患者はSWEおよびCEUS画像検査を受け、乳がん群の手術標本は免疫組織化学を用いてエストロゲン受容体(ER)、ヒト表皮成長因子受容体2(HER2)、およびKi-67の発現を評価するために分析されました。

結果は、乳がん組織が正常な乳腺組織と比べて有意に異なる弾性および灌流特性を示すことが示されました。具体的には、がん群はE平均値を低 く、E最大値、E最小値、ピーク強度、平均通過時間(MTT)値が高いことが示されました。相関解析の結果、Ki-67の発現はE平均、E最大値、ピーク、MTTと正の相関を示し、ERはピーク強度を除くすべてのパラメータと負の相関を示しました。HER2の発現は測定されたすべての画像パラメータと正の相関を示した。これらの発見は、SWEとCEUSが乳がんの分子特性解析および臨床評価を支援する非侵襲的で補完的な知見を提供できることを示唆しています。

概要

乳がんは世界中で女性に影響を与える最も有病率の高いがんの一つであり、発生率は着実に上昇しています。最近の疫学的研究によると、乳がんの発生率は子宮頸がんに次いで、女性全体でがん関連死亡率のトップとなっています2,3。乳がんの病因は、遺伝的形質、内分泌の影響、環境曝露など複数の相互作用要因を含みます。精密医療の進歩により、乳がん管理における画像表現型と分子特徴の関係を理解する関心が高まっています5。

本研究の目的は、せん断波エラストグラフィー(SWE)および造影増強超音波(CEUS)が、エストロゲン受容体(ER)、ヒト表皮成長因子受容体2(HER2)、およびKi-67を含む乳がんの主要な分子マーカーを特徴づける非侵襲的な画像バイオマーカーとして機能するかどうかを調査することでした。本調査は、画像診断がこれらのバイオマーカーと相関し、治療決定を導き予後意義を持ち、生検の補助または代替として機能する可能性があるかどうかを明らかにしようとしました。この相関関係の検証は、高度な画像技術を通じて乳がんを分子レベルで評価するアクセスしやすく再現性の高い方法を提供する可能性があります。

臨床症状は通常、痛みのない乳房腫瘤の発見から始まり、これは約80%の女性に発生します。病気が進行するにつれて、乳首分泌物、クーパー靭帯の牽引による皮膚のくぼみ、リンパ閉塞によるポー・ド・オランジュ、進行期には乳首の後退とかか痒み、水疱、潰瘍などの皮膚変化を伴うこともあります。

乳がん診断で現在用いられている画像診断手法には、超音波検査、マンモグラフィー、磁気共鳴画像法(MRI)、核医学技術8,9,10があります。その中でも超音波検査が最も一般的であり、非侵襲的で患者を放射線にさらさず、脂肪腺組織と高密度腺組織の識別に高い再現性と解像度を提供します。SWEは、せん断波の速度から導出されるヤング率に基づく定量的な剛性測定を提供することで、従来の超音波を強化します。音響放射力を利用してせん断波を誘発することでオペレーター依存性を減らし、再現性を12。CEUSは腫瘍の血管および灌流パターンを可視化し、病変の検出と特徴付けに寄与し、良性および悪性腫瘍の分化を助けます13。

分子免疫組織化学マーカーの有用性は、乳がんの予後判断と治療の指針に極めて重要です。ER、プロゲステロン受容体(PR)、Ki-67、HER2は臨床意思決定において確立された役割を持つ重要なマーカーです15。これまでの研究では、超音波イメージングの特徴がこれらの分子マーカーの発現を反映している可能性が示唆されており、画像化表現型が腫瘍生物学の基礎を反映しているという考えを支持しています16,17,18。本研究は、CEUSとSWEイメージングパラメータおよびさまざまな生物学的予後マーカーの相関を評価する適切なプロトコルを適用し、放射線ゲノミクスの発展分野に寄与することを目的としました。

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プロトコル

研究はヘルシンキ宣言および臨床研究に関する機関ガイドラインに従って完了しました。本研究のプロトコルは錦州医科大学第三附属病院の倫理審査委員会に提出され、承認されました。

登録前にすべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得され、将来の公開のために非特定された臨床情報、画像情報、病理情報を利用する許可も含まれていました。この研究を通じて、患者の機密保持は常に守られました。

患者参加のための募集および評価プロセスも、2021年版中国抗がん協会ガイドラインに準拠しています。

1. 患者選択と準備

  1. 乳がんの確定診断、十分な超音波画像品質、完全な臨床データを持つ患者を含めてください。
  2. 最近の乳房手術、豊胸手術、乳腺炎、再発性乳がん、瘢痕に隣接する病変、心血管または肝臓疾患、妊娠、または画像検査30日前に病理検査が行われた場合は除外します。
  3. 画像検査前に、各参加者の年齢、体重、臨床歴を記録してください。
  4. 患者を仰向けにし、両腕を頭の上に上げます。
  5. 最適な音響伝導と画像の鮮明さを確保するために、カップリングジェルを乳房にたっぷり塗布してください。

2. せん断波エラストグラフィー(SWE)検査

注:超音波システムおよびプローブについては 材料表 を参照してください。

  1. まずは通常の Bモード 超音波検査を行い、病変の位置を特定し特徴付けます。
  2. SWEモードを起動し、プローブを病変の真上皮膚に垂直に位置させ、外部圧力をかけずに設置します。
  3. サンプリングフレームを調整し、病変と周囲組織の十分なマージンを十分に含めます。
  4. システムの品質管理マップを監視し、十分なせん断波伝播を確保しましょう。
  5. 画像が安定したら、患者に3〜5秒間息を止めるように指示します。
  6. この間、プローブを安定させて画像を安定させます。
  7. 色分けされたエラストグラフィー画像を保存し、システムの定量解析ツールを使って病変の輪郭 を描き 出します。
  8. 病変の最大弾性率(Emax)、最小値(Emin)、平均弾性率(Emean)値を記録します。
  9. 各測定値を3回繰り返し、平均値を計算します。
  10. 測定の一貫性と再現性を確保するために、せん断波エラストグラフィーの取得および品質管理に関する公開された国際ガイドラインに従うこと19.

3. 造影超音波(CEUS)評価

  1. 病変の最大断面積を示す最適な画像面を特定します。
  2. 製造元の指示に従って造影剤を再構成します:生理食塩水5mLを加え、2.4mLを注射器に取ります。
  3. 適切なカニューレを用いて肘前静脈に静脈通路を確保します。
  4. 超音波システムをマイクロバブル可視化に合わせて機械的指数を調整した 画像 モードに設定します。
  5. 造影剤2.4 mLを急速ボーラスで投与し、その後5 mLの生理食塩水フラッシュを投与します。
  6. 洗浄と洗浄の段階を記録するために、すぐに連続デジタル記録を開始してください。
  7. 最低3分間は録画し、完全な強化動態を記録してください。
  8. ピークの増強を特定し、病変の周囲に約3〜4 mm間隔で4つの測定点(上、下、内側、外側)を配置します。
  9. 定量ソフトウェアを使って時間強度曲線を分析します。
  10. 定量分析からピーク強度および平均トランジット時間(MTT)指標を生成します。
  11. 一貫性と再現性を確保するために、過去の臨床試験で確立された造影剤強化超音波(CEUS)取得および定量解析手法に従うこと15.
  12. CEUS画像診断と定量解析を用いて、標準的な乳房画像診断に加えて血管や灌流を評価します。

4. 組織サンプリングおよび免疫組織化学的解析

  1. 臨床基準に従い、コアニードル生検または外科的切除で組織サンプルを採取してください。
  2. サンプルを10%中性緩衝ホルマリンに室温で6〜24時間固定します。
  3. 標準的な組織病理学的処理プロトコルに従って、サンプルを脱水・透明化し、パラフィンに埋め込む。
  4. パラフィン埋め込み組織ブロックをミクロトームで4μmの断片にスライスします。
  5. セクションを正に帯電したガラススライドに取り付けてください。
  6. スライドをキシレン(各2×10分)で室温で脱水し、その後、グレード化されたエタノールシリーズ(100%、95%、85%、70%エタノール、1ステップ5分)で再水和し、蒸留水ですすぎます。
    注:すべての手順は室温で攪拌せずに実施されました。
  7. 抗原回収はクエン酸バッファー(pH 6.0)またはEDTAバッファー(pH 9.0)を用いて行われます。
  8. 内因性過酸化物酵素活性を阻害するために、組織切片を3%過酸化水素溶液で10分間培養します。
  9. 1%BSAを含むPBSで希釈したER、HER2、Ki-67に対する一次抗体を適用します(ER 1:100;ヒロ2 1:200;Ki-67 1:200)を製造元の指示に従い、4°Cの加湿チャンバーで攪拌せずに一晩培養します。
  10. ホースラディッシュ過酸化酵素結合の二次抗体を1%BSA(1:200)を含むPBSで希釈したものを、室温の加湿チャンバーで30分間攪拌せずにインキュベートします。
  11. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)染色原を用いて抗体結合を可視化し、ヘマトキシリンで30秒間カウンター染色します。
  12. 標準基準を用いて400×倍率未満の染色を評価する:ER陽性>核染色10%;HER2はASCO/CAPガイドラインに従って評価されました。そしてKi-67は陽性腫瘍核の割合で表されます。
  13. 標準化されたプロトコルを用いた免疫組織化学検査を行い、熱誘導抗原回出(シトレートバッファー、pH 6.0、またはEDTAバッファー、pH 9.0、95-98°Cで20分間)、室温で3%過酸化水素による内因性過酸化物酵素遮断10分、一次抗体との培養後ホースラディッシュ過酸化酵素結合二次抗体、3,3′ジアミノベンジジン(DAB)染色検出、ヘマトキシリンの逆染色、段階エタノールによる脱水、 およびすべてのサンプルに同一で適用されるカバースリッピング(21,22)です。

5. 統計分析

  1. 連続変数を平均±標準偏差(SD)として表現します。
  2. 正常性評価後、がん群と対照群間のSWEおよびCEUSパラメータを比較するために、独立した サンプルt検定を用います。
  3. 超音波パラメータと免疫組織化学マーカー(ER、HER2、Ki-67)との関連を評価するためにスピアマン相関解析を実施します。
  4. がんのステータスを分類変数として、各超音波パラメータに対して受信者操作特性(ROC)曲線を生成します。
  5. 曲線下面積(AUC)を計算し、ユーデン指数(J = 感度 + 特異度−1)で決定される最適カットオフでの感度と特異度を導出します。
  6. 陽性中率(PPV)と陰性中率(NPV)を計算します。選択したカットオフ値に基づいています。
  7. 両側のP値<0.05を統計的に有意であると考えます。結果は表や図で提示してください。

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結果

患者の特徴

このプロトコルを68人の乳がん患者と68人の健康対照群で実施した結果、両群間で弾性図および灌流パラメータに有意な差が示されました。すべての乳がん症例は片側性病変として現れ、平均直径は20.78 ± 5.37 mmでした。組織病理学的解析では、浸潤性管がん49例、小葉癌9例、管内癌6例、粘液性癌3例、髄質性癌1例が確認されました。

造影超音波所見

造影剤による超音波検査では、不規則な形態、不均一な内部エコー、包膜の欠如、角ばった特徴を伴う不明瞭な縁縁などの特徴的な悪性特徴が認められました。造影後、44例(64.71%)が高い増強と急速な増強パターンを示しました。灌流欠損は30例(44.12%)で観察され、21例(30.88%)で腫瘤内に放射状または貫通血管が認められました。

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ディスカッション

このプロトコルは、乳がんにおける定量的超音波パラメータと分子予後マーカーの関係を明確に示し、非侵襲的な疾患の特徴付けのための明確な枠組みを提供します。画像パラメータと免疫組織化学マーカーの相関は、組織の硬さなどの機械的特性や灌流特性に影響を与える生物学的変化を反映しています。

疫学的研究によると、乳がんは女性がん患者の約25%を占めており、女性における最も有病率かつ異質な悪性腫瘍の一つであり続けています。歴史的に臨床予後測定は組織学的グレードと腫瘍直径に基づいており、分子生物学が現在の予後評価のゴールドスタンダードとして注目されています。しかし、これらの方法は侵襲的な組織サンプリングに依存しており、腫瘍の形態的または機能的特徴を完全に捉えきれない場合があります。超音波は病変の形態、大きさ、周囲の血管供給を評価する動的かつ非侵襲的な手段を提供します

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

著者たちは、錦州医科大学第三附属病院の超音波技師および病理スタッフの技術支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クエン酸緩衝液（pH 6.0）12364Thermo Fisher Scientificwww.thermofisher.com
EDTA緩衝液（pH 9.0）88763Thermo Fisher Scientificwww.thermofisher.com
過酸化水素（3%）998765Sigma-Aldrichwww.sigmaaldrich.com
L11-3プローブ（超音波）ABC987Myriad Ultrasoundwww.myriad.com, 4-15 MHz
SonoVue（造影剤）12345Bracco Diagnosticswww.bracco.com
SPSS統計解析ソフトウェアN/AIBMwww.ibm.com

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